Method Article

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

DOI:

10.3791/56001

⸱

July 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pathology and Infectious Diseases and Microbiology, University of Pittsburgh, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh, 4Departments of Psychiatry, Psychology, Behavioral & Community Health Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule omówiono szczegółowy protokół do ilościowego określania długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentów restrykcyjnych na końcu, który zapewnia szybki i efektywny bezpośredni pomiar długości telomerów. Technika ta może być stosowana do różnych źródeł komórkowych DNA w celu ilościowego określenia długości telomerów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka różnych technik pomiaru długości telomerów, z których każda ma swoje zalety i wady. Tradycyjne podejście, analiza fragmentów restrykcyjnych telomerów (TRF), wykorzystuje technikę hybrydyzacji DNA, w której próbki genomowego DNA są trawione enzymami restrykcyjnymi, pozostawiając powtórzenia DNA telomerów i niektóre subtelomerowe DNA. Są one rozdzielane przez elektroforezę w żelu agarozowym, przenoszone do membrany filtracyjnej i hybrydyzowane z sondami oligonukleotydowymi oznaczonymi chemiluminescencją lub radioaktywnością w celu wizualizacji fragmentów restrykcyjnych telomerów. Podejście to, choć wymaga większej ilości DNA niż inne techniki, takie jak PCR, może mierzyć rozkład długości telomerów w populacji komórek i umożliwia pomiar wyrażony w bezwzględnych kilozasadach. Manuskrypt ten demonstruje zmodyfikowaną procedurę hybrydyzacji DNA w celu określenia długości telomerów. Genomowe DNA jest najpierw trawione przez enzymy restrykcyjne (które nie przecinają telomerów) i rozdzielane przez elektroforezę w żelu agarozowym. Żel jest następnie suszony, a DNA jest denaturowane i hybrydyzowane in situ do znakowanej radioaktywnie sondy oligonukleotydowej. Ta hybrydyzacja in situ pozwala uniknąć utraty telomerowego DNA i poprawia intensywność sygnału. Po hybrydyzacji żele są obrazowane za pomocą ekranów luminoforowych, a długość telomerów jest określana ilościowo za pomocą programu do tworzenia wykresów. Procedura ta została opracowana przez laboratoria doktorów Woodringa Wrighta i Jerry'ego Shaya z University of Texas Southwestern1,2. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis tej procedury, z pewnymi modyfikacjami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomery, znajdujące się na końcach chromosomów, są nukleotydowymi powtórzeniami sekwencji TTAGGG (na chromosomach ludzkich), które odgrywają kluczową rolę w ochronie komórkowej informacji genetycznej3,4,5. Telomery mają długość kilku tysięcy par zasad i służą do ochrony integralności reszty chromosomu podczas replikacji DNA. Replikacja chromosomów nie jest doskonała, co powoduje, że końce chromosomu nie są całkowicie skopiowane. Ta nieefektywność replikacji jest określana jako "problem z replikacją końcową" i powoduje utratę niektórych powtórzeń telomerów podczas każdej rundy replikacji6,7. Długość telomerów może zostać przywrócona po podziale komórki przez telomerazę, enzym, który zastępuje utracone sekwencje telomerów8,9. Telomeraza nie jest jednak aktywowana w większości ludzkich komórek somatycznych, w wyniku czego z czasem telomery ulegają skróceniu, co ostatecznie prowadzi do starzenia się komórek10. Ze względu na skracanie telomerów, telomery są uważane za biomarker starzenia się i ryzyka chorób związanych z wiekiem11,12. Ponadto na długość telomerów mogą wpływać czynniki genetyczne, środowiskowe i styl życia oraz inne bodźce, takie jak stres oksydacyjny, co wskazuje, że długość telomerów może odgrywać rolę jako biomarker w badaniach toksykologicznych, epidemiologicznych i behawioralnych13,14,15.

Ten artykuł demonstruje technikę pomiaru długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentu restrykcyjnego terminalu (TRF) zaadaptowanej z Mendera i Shay'a2 oraz Kimura et al.16, i podobne do Herbert, Shay and Wright1 oraz Haussmann i Mauck17. Tradycyjnie, analiza TRF obejmuje procedurę Southern blot. Southern blot jest uważany za "złoty standard" w badaniu długości telomerów i jest aktywnie wykorzystywany do badania długości telomerów leukocytów w badaniach epidemiologicznych18. Ta analiza TRF wykorzystuje strawione genomowe DNA, pozostawiając powtórzenia telomerów. Fragmenty DNA są następnie rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej, denaturowane i przenoszone do membrany nitrocelulozowej. Sekwencje telomerów są hybrydyzowane z sondą oligonukleotydową telomerów. Zamiast przenosić oddzielone telomery do błony, inne techniki TRF wykorzystują techniki hybrydyzacji w żelu z denaturacją DNA i bez niej. Uwzględnienie denaturacji jest ważne, gdy rozważa się wykrycie telomerów śródmiąższowych, które zostały zgłoszone u niektórych gatunków19. Procedury, które nie mają etapów denaturacji, wykrywają tylko jednoniciowe nawisy DNA w końcowych telomerach i nie wiążą się z śródmiąższowymi sekwencjami telomerów18.

Oprócz analizy TRF, istnieje kilka innych technik pomiaru długości telomerów, z których każda ma swoje zalety i wady. Technika Flow-FISH umożliwia pomiar średniej długości telomerów w poszczególnych komórkach odrębnego typu komórki za pomocą cytometrii przepływowej16,20. Chociaż może dokładnie oznaczać telomery za pomocą wysoce specyficznych sond i redukować błędy ludzkie poprzez automatyzację, Flow-FISH jest drogi, mniej wydajny i wymaga świeżych próbek oraz wysoko wykwalifikowanego technika, co ogranicza jego zdolność do badań epidemiologicznych16. Ponadto metoda ta nie uwzględnia potencjalnych zmian w liczbie chromosomów w populacji komórek. Inna technika, qPCR, jest powszechnie akceptowana jako sposób pomiaru długości telomerów w badaniach epidemiologicznych16 ze względu na wysoką przepustowość, niski koszt i wymóg niewielkich ilości DNA w porównaniu z innymi metodami. Jednak qPCR może mierzyć tylko średnią zawartość telomerowego DNA w stosunku do pojedynczej kopii genu, a zatem jest pośrednim oszacowaniem średniej długości telomerów. Daje to również wysoki współczynnik wariancji w badaniach porównawczych w porównaniu z południowymi plamami, co prowadzi do wątpliwej dokładności21.

Procedura TRF ma swoje własne braki, które ograniczają jej zastosowanie w niektórych badaniach. Techniki TRF wymagają dużej ilości DNA w porównaniu z innymi metodami (od 2 do 3 μg na próbkę). Ogranicza to zastosowania tej techniki do badania długości telomerów w próbkach klinicznych, dla których można pobrać wystarczającą ilość genomowego DNA i nie można go użyć na próbkach zdegradowanego DNA. Dodatkowo analiza TRF jest kosztowna i pracochłonna, a jej wyniki wymagają 4-5 dni. Jednak TRF daje niski współczynnik wariancji, co zapewnia jego odtwarzalność. Chociaż protokół ten różni się od tradycyjnego Southern blot (wykorzystującego hybrydyzację żelu in situ), te dwie techniki są zasadniczo takie same.

Technika przedstawiona tutaj to połączenie Southern blot i hybrydyzacji w żelu; powiązanie etapu denaturacji DNA z Southern blot z hybrydyzacji w żelu. Ta kombinacja ma dodatkową zaletę w postaci lepszej siły sygnału sondy w porównaniu z Southern blot i konsekwentnie daje wymierne wyniki w naszym laboratorium. Dodatkowo, zastosowanie sond radioaktywnych zamiast sond chemiluminescencyjnych daje wyższą intensywność sygnału i pozwala na wizualizację i kwantyfikację za pomocą luminowizora, dzięki czemu analizy TRF są przyjazne dla użytkownika.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja genomowego DNA

  1. Wykonaj ekstrakcję genomowego DNA z komórek (tutaj linia komórkowa BJ-hTERT), która ma być analizowana za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Jeśli stężenie DNA jest mniejsze niż 100 μg/ml, wytrącić DNA etanolem i ponownie zawiesić w objętości buforu TE (10 mM Tris-Cl; 0,1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy); pH 8,0), aby zapewnić stężenie DNA 100-600 μg/ml).

2. Ocena integralności DNA

UWAGA: Ta część protokołu opisuje ocenę integralności DNA za pomocą systemu elektroforezy żelowej z żelem o wymiarach 11 cm x 14 cm. Można również stosować inne systemy i rozmiary żeli, ale napięcie i czas migracji DNA mogą się różnić.

  1. Przygotować 1% żel agarozowy, łącząc 1 g agarozy klasy elektroforetycznej w 100 ml 1x buforu TAE (40 mM Tris-zasada; 20 mM kwas octowy; 2 mM EDTA; pH 8,5) i mikrofalować, aż agaroza się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Schłodzić roztwór w temperaturze pokojowej do osiągnięcia temperatury 50 °C (około 15 - 20 min).
  2. Podczas gdy roztwór agarozy stygnie, przygotuj tackę do odlewania żelu, dodając bramki końcowe odlewu do tacy odlewniczej. Aby zapobiec wyciekom agarozy, należy schłodzić zasuwki końcowe do 4 °C przed przymocowaniem do tacki odlewniczej.
  3. Gdy roztwór agarozy ostygnie do 50 °C, dodać 10 μl bromku etydyny (10 mg/ml w dH2O) i wlać roztwór agarozy do tacki do odlewania żelu. Dodaj grzebień do tacki odlewniczej.
  4. Pozostaw roztwór agarozy do stwardnienia przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj próbki DNA do elektroforezy, rozcieńczając 25 ng genomowego DNA za pomocą 1x buforu TE do końcowej objętości 9 μL i dodaj 1 μL 10x barwnika ładującego (0,25% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,25% (w/v) ksylen-cyjanol FF, 30% (v/v) glicerol). Dobrze wymieszaj.
  6. Przygotuj system elektroforezy żelowej do migracji DNA, wypełniając system elektroforezy buforem 1x TAE tak, aby poziom buforu znajdował się kilka milimetrów powyżej żelu. Załaduj dołki żelu całością próbek DNA. Dodać 5 μl drabinki DNA do jednego dołka.
  7. Przeprowadzić migrację DNA pod napięciem 100 V przez około 2 godziny lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy znajdzie się mniej więcej w połowie żelu.
  8. Zobrazuj żel za pomocą transiluminatora światła ultrafioletowego lub jego odpowiednika.
    UWAGA: Próbki DNA o dobrej integralności mają pasma o dużej masie cząsteczkowej bez rozmazywania (to jest spowodowane ściętym lub uszkodzonym DNA). Jeśli prążki DNA są rozmazane, mają niską integralność i nie nadają się do analizy Southern blot, a DNA musi zostać ponownie wyizolowane ze świeżymi komórkami.

3. Trawienie genomowego DNA

  1. Przeprowadzić trawienie genomowego DNA w końcowej objętości 20-40 μl.
    UWAGA: Objętości większe niż 40 μl przeleją się przez studzienki żelu agarozowego.
    1. Połącz 3 μg genomowego DNA i odpowiednią ilość 10x buforu trawiącego DNA (dostarczanego z enzymami restrykcyjnymi) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1x, w mikroprobówce. Dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego RsaI (10 000 U/ml) i 1 μl enzymu restrykcyjnego HinfI (10 000 U/ml) do każdej probówki. Dostosuj końcową objętość za pomocą sterylnego, dejonizowanegoH2O. Dobrze wymieszaj. Odwirować krótko (10 - 15 s przy 16 000 x g), aby upewnić się, że wszystkie składniki znajdują się na dnie probówki.
  2. Inkubować procesy trawienia w temperaturze 37 °C przez ≥16 godzin. Po mineralizacji przechowuj strawione DNA w temperaturze 4 °C lub -20 °C nie dłużej niż 2 dni, jeśli to konieczne17.

4. Elektroforeza żelowa genomowego DNA

UWAGA: Ta część protokołu opisuje procedurę korzystania z systemu do elektroforezy żelowej o wymiarach 20 cm x 25 cm. Można stosować różne systemy elektroforezy żelowej, ale w celu uzyskania optymalnych wyników może być konieczna modyfikacja kilku zmiennych, w tym napięcia, czasu migracji i ilości bufora elektroforetycznego dodanego do systemu.

  1. Przygotować 0,6% roztwór agarozy, łącząc 2,25 g agarozy klasy żelowej do elektroforezy z 375 ml buforu do elektroforezy, 1x TAE lub 0,5x TBE (110 mM zasada Tris; 90 mM kwas borowy; 2,5 mM EDTA; pH 8,3).
    UWAGA: Dla telomerów mniejszych niż 8 000 kB zalecane jest 0,5x TBE, natomiast 1x TAE jest zalecane dla telomerów od 8 000 kB do 20 000 kB1.
  2. Roztwór należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez 15 - 20 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy agaroza osiągnie 50 °C.
  3. Podczas schładzania roztworu agarozy należy przygotować system elektroforezy żelowej do odlewania żelu zgodnie z opisem w kroku 2.2. Wlej roztwór żelu agarozowego do tacki do odlewania żelu. Umieść grzebień w żelu. Pozostaw żel do stwardnienia na 45 minut bez przykrycia w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotuj strawione próbki DNA do elektroforezy. Aby uzyskać reakcję o objętości 40 μl, dodaj 0,4 μl 10-krotnego barwnika ładującego do każdej próbki strawionego DNA. Krótko odwirować (10-15 s, 16 000 x g), aby upewnić się, że cały roztwór znajduje się na dnie probówki.
  5. Przygotuj system elektroforezy żelowej do migracji DNA. Zdejmij zasuwki końcowe i przeczesz z żelu. Napełnij system elektroforezy żelowej 1x TAE lub 0,5x TBE do linii napełniania, upewniając się, że żel jest całkowicie zanurzony w buforze.
  6. Załadować dołki żelu próbkami DNA w taki sposób, aby między próbkami znajdowała się ślepa studzienka. Unikaj powodowania pęcherzyków lub nakłuwania żelu. Dodać 10 μl drabinki DNA do studzienek na przeciwległych końcach żelu.
    UWAGA: Rodzaj drabiny DNA będzie zależał od długości telomerów, która będzie się różnić w zależności od osoby i źródła komórek.
  7. Uruchom elektroforezę żelową przy napięciu 150 V przez 30 minut, aby szybko przenieść DNA do żelu, a następnie ustaw napięcie na 57 V i pracuj przez 18-24 godziny.

5. Obrazowanie fluorescencyjne żelu i hybrydyzacja

  1. Po 18-24 godzinach wyłącz źródło zasilania elektroforezy żelowej. Wyjmij tackę do odlewania żelu z żelem z buforu do elektroforezy. Odetnij prawy górny róg żelu, aby służył jako odniesienie do orientacji żelu.
  2. Przygotuj kawałek bibuły filtracyjnej, przycinając bibułę tak, aby miała nieco większy rozmiar niż żel. Umieść bibułę filtracyjną na żelu w tacy odlewniczej i pozwól, aby bibuła wchłonęła nadmiar roztworu na żelu. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza między bibułą filtracyjną a żelem za pomocą pipety jako wałka, aby wycisnąć pęcherzyki przez boki.
  3. Usuń żel z tacki odlewniczej, odwracając żel i bibułę filtracyjną tak, aby papier znalazł się pod żelem. Przenieś żel wraz z bibułą filtracyjną do suszarki do żelu i przykryj żel folią. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza między folią a żelem za pomocą pipety jako wałka.
  4. Suszyć żel przez 2 godziny w temperaturze 50 °C.
  5. Po wysuszeniu usuń folię spożywczą i przenieś żel oraz bibułę filtracyjną do szklanego naczynia zawierającego 250 ml wody dejonizowanej (wystarczającej do pokrycia żelu). Ostrożnie usunąć bibułę filtracyjną i inkubować żel w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Żel będzie cienki, twardy i łatwy w obsłudze bez rozdzierania.
  6. Przygotować 5 x roztwór SSC (750 mM NaCl; 75 mM cytrynian sodu) w wodzie dejonizowanej.
  7. Połóż żel na nylonowej siatce (12 cali x 12 cali). Zwiń ze sobą nylonową siatkę i żel, upewniając się, że żel nie styka się ze sobą. Umieść siatkę i żel w probówce do hybrydyzacji (np. 12-calowej tubie o średnicy 1,5).
    UWAGA: Po prawidłowym zwinięciu żel będzie stykał się z nylonową siatką po obu stronach.
  8. Połącz 100 ml 5x SSC i 12 μl zielonego fluorescencyjnego barwienia kwasem nukleinowym i umieść w probówce hybrydyzacyjnej. Chronić roztwór przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C w piecu do hybrydyzacji z rotacją.
  9. Wyjmij nylonową siatkę/żel z probówki do hybrydyzacji, rozwiń i umieść płasko w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml wody dejonizowanej i delikatnie usuń nylonową siatkę. Zobrazuj żel za pomocą phosphorimagera. Użyj ustawień świetlówek: 520 BP, 40 niebieskich i 488 nm. Ustaw tubus fotopowielacza (PMT) na 375, płaszczyznę ogniskową na +3 mm, a czułość na normalną. Zapisz obraz do pliku.

6. Hybrydyzacja

  1. Przygotuj radioaktywną sondę telomerową.
    1. Połączyć 2 μl (2 ng) sondy telomerowej (5- (CCC TAA)4 3'), 2,5 μl 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej, 3 μl γ32P-dATP (6,000 Ci/mmol), 4 μl kinazy polinukleotydowej T4 i wolnej od DNaz, sterylnej wody dejonizowanej do końcowej objętości 20 μL w probówce do mikrowirówki.
      Ostrzeżenie: Podczas korzystania z radioaktywności należy przestrzegać obowiązujących w obiektach przepisów i dotyczących radioaktywności.
  2. Krótko odwirować (10-30 s przy 16 000 x g) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Wirować przez 10-30 s przy 16 000 x g i inkubować w temperaturze 65 °C przez 20 minut, aby zatrzymać reakcję.
  3. Używając kolumny mikrowirowej do chromatografii G-25, wymieszać zawartość kolumny przez wirowanie, a następnie odwirować przez 1 minutę przy 700 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat.
  4. Załadować roztwór sondy radioaktywnej do kolumny chromatograficznej G-25 i odwirować przez 2 minuty przy 700 x g. Zachować filtrat.
    UWAGA: Zachowaj filtrat, ponieważ zawiera on radioaktywną sondę telomerową. W razie potrzeby sonda radioaktywna może być przechowywana w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować 250 ml roztworu denaturującego składającego się z 1,5 M NaCl i 0,5 M NaOH w sterylnej wodzie dejonizowanej.
  6. Umieścić żel w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml roztworu denaturującego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór denaturujący i zastąp go 250 ml sterylnej wody dejonizowanej. Inkubować przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej (40 - 50 obr./min) w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 250 ml roztworu neutralizacyjnego składającego się z 1,5 NaCl i 0,5 M kwasu tris-solnego o pH 8,0 w sterylnej wodzie dejonizowanej.
  8. Usuń wodę dejonizowaną i zastąp ją 250 ml roztworu neutralizacyjnego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Podczas inkubacji w roztworze neutralizacyjnym przygotować 50 ml roztworu hybrydyzacyjnego złożonego z 5x SSC, 5x roztworu Denhardta (0,1% niejonowego polimeru syntetycznego; 0,1% poliwinylopirolidyny; 0,1% albuminy surowicy bydlęcej), 10 mM fosforanu disodowego (Na2HPO4) i 1 mM tetraprymaku pirofosforanu sodu dekahydratu (Na4P2O7 . 10 H2O) w sterylnej wodzie dejonizowanej.
  10. Zwiń żel w nylonową siatkę i umieść w probówce do hybrydyzacji (krok 5.7). Dodać 20 ml roztworu do hybrydyzacji i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez 10 minut z rotacją.
  11. Usuń roztwór hybrydyzacyjny i zastąp go 20 ml świeżego roztworu do hybrydyzacji. Dodać całą sondę telomerową i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez noc z rotacją.

7. Mycie żelem, naświetlanie ekranem luminoforowym i obrazowanie radiowe

  1. Przygotować 500 ml 2x roztwór SSC (300 mM NaCl; 30 mM cytrynian sodu) w sterylnej wodzie dejonizowanej.
  2. Przygotuj 250 ml 0,1 x SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM cytrynianu sodu) i 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej.
  3. Usuń żel i siatkę z probówki hybrydyzacyjnej i umieść w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml 2x SSC. Rozwiń i wyjmij nylonową siatkę z naczynia. Umieścić szklane naczynie na wytrząsarce orbitalnej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć 2x SSC i zastąpić 250 ml 0,1x SSC i 0,1% roztworu SDS i inkubować przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.
  5. Podczas inkubacji naświetl ekran Phosphor na działanie gumki obrazu na 15 minut.
  6. Usuń roztwór 0,1x SSC i 0,1% SDS i zastąp 250 ml 2x SSC. Inkubować przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej.
  7. Wyjmij żel z 2x roztworu SSC i zawiń żel w folię spożywczą lub umieść w woreczku termozgrzewalnym. Usuń wszystkie pęcherzyki i kieszenie powietrzne między żelem a plastikową folią lub plastikową torebką. Umieść żel w kasecie naświetlającej z ekranem Phopshor. Wystaw ekran luminoforowy na działanie żelu przez noc.
  8. Zobrazuj odsłonięty ekran Phosphor za pomocą phosphorimager.

8. Kwantyfikacja długości telomerów

  1. Otwórz plik phosphorimager zawierający fluorescencyjny obraz zielonego fluorescencyjnego żelu barwionego kwasem nukleinowym (Rysunek 1).
  2. Wybierz "Narzędzia", a następnie "Odległość w pikselach". Za pomocą myszy narysuj linię od dołu żelu do środka pierwszego paska znacznika i zapisz odległość. Powtórz tę procedurę dla każdego pasma znaczników (Rysunek 2). Odległości te zostaną użyte w programie do tworzenia wykresów, jak opisano poniżej.
  3. Otwórz obraz fosforowy żelu znakowanego radioaktywnie (Rysunek 3). Wybierz "Menedżer obiektów", a następnie "Siatka". Ustaw siatkę na 1 kolumnę i 150 wierszy. Wyreguluj siatkę tak, aby rozciągała się od góry żelu do dołu żelu. Dostosuj szerokość siatki, aby była równa szerokości pasa ruchu, klikając krawędź siatki i przeciągając szerokość siatki, aby zrównać ją z szerokością pasa.
  4. Skopiuj tę siatkę (tak, aby szerokość i wysokość pól pozostały takie same) i przenieś drugą siatkę na pusty pas (na potrzeby tła). Kontynuuj kopiowanie i przesuwanie dodatkowych siatek dla dodatkowych pasów próbki.
    UWAGA: Po zakończeniu, powinny być siatki dla każdego pasa próbki i jedna siatka pustego pasa dla tła (Rysunek 4).
  5. Wybierz "Analiza", a następnie "Raport objętości". Zaznacz wszystkie siatki raportu. Po wyświetleniu raportu objętości kliknij dwukrotnie raport, aby aktywować program arkusza kalkulacyjnego. Zapisz plik arkusza kalkulacyjnego. Dane dla tego pliku będą znajdować się na ścieżce "Wolumin".
  6. Otwórz odpowiedni program do tworzenia wykresów i utwórz nowe dane oraz tabelę. Wybierz "Y: Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu", a następnie wybierz "Utwórz".
  7. Oznacz pierwszą kolumnę (kolumnę X) jako "Zmierzona odległość", a drugą kolumnę (kolumna Y) oznacz jako "Masa cząsteczkowa". Wprowadzić masę cząsteczkową markera dla każdego pasma znacznika w kolumnie Y. Wpisać odległości migracji uzyskane w kroku 8.2 odpowiadające każdemu markerowi masy cząsteczkowej.
  8. Przejdź do "Analiza" i wybierz "Analizuj", a następnie "Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej)" i wybierz "OK". Na następnym ekranie wybierz "Wykładniczy, a następnie "Zanik jednej fazy". Wybierz zakładkę 'Zakres' i wpisz '150' w 'liczbie punktów definiujących krzywą' i zaznacz 'Utwórz tabelę współrzędnych XY, aby wyeksportować lub skopiować krzywą do innego programu'.
    UWAGA: Wynik, "nieliniowe dopasowanie danych 1", zawiera masę cząsteczkową dla każdej odległości w wierszu Y.
  9. Do analizy pasów próbki wybierz obszar analizy, który znajduje się powyżej i poniżej rzeczywistych pasm telomerów. Nie używaj całej długości pasa ruchu (Rysunek 5). Określ lokalizacje siatki dla obszaru analizy każdego pasa ruchu.
  10. Wybierz 'Plik', 'Nowy' 'Utwórz nową tabelę i wykres'. Wybierz "Y: Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu", a następnie wybierz "Utwórz". Skopiuj i wklej wartości głośności pasa tła (wartości intensywności) z pliku arkusza kalkulacyjnego do pierwszej kolumny (X), a wartości głośności (wartości intensywności) z pasa próbki do pierwszej kolumny Y. Jeśli istnieje wiele linii próbkowania, skopiuj każdy zestaw wartości objętości z pliku arkusza kalkulacyjnego do dodatkowych kolumn Y w pliku programu do tworzenia wykresów.
  11. Skreślić wartości z kolumny tła (X) i każdego pasa pobierania próbek (Y), które znajdują się poza obszarami analizy określonymi w kroku 8.8.
    UWAGA: Tabela danych powinna zawierać tylko wartości w tych lokalizacjach siatki, które odpowiadają obszarom analizy.
  12. Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj" i "Przekształć". Kliknij "OK". Wybierz opcję "Przekształć wartości Y przy użyciu Y=Y-X". Spowoduje to przekształcenie danych w Danych 2 (wartość przekształconej intensywności (Y) = intensywność próbki (Y) - intensywność tła (X)).
    1. Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj", "Analiza kolumn" i "Statystyki kolumn". Wybierz przycisk OK. Zakładka wyników "Col. Stats of Transform of Data 2" pokazuje się w wierszu "Suma" ∑(Inti).
  13. Wybierz 'Plik', 'Nowy', 'Utwórz nową tabelę i wykres'. Wybierz "Y: Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu", a następnie wybierz "Utwórz". Skopiuj i wklej dane kolumny Y ze strony wyników "Dopasowanie nonliniowe danych 1, krzywa" do nowej kolumny X. Skopiuj i wklej dane kolumny Y ze strony wyników "Transformacja danych 2" do nowej kolumny Y. Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj" i "Przekształć". Kliknij "OK". Wybierz opcję "Przekształć wartości Y przy użyciu Y=Y/X".
    1. Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj", "Analiza kolumn" i "Statystyki kolumn". Wybierz przycisk OK. Zakładka wyników 'Col. Stats of Transform of Data 3' pokazuje w wierszu 'Sum' ∑(Inti/MWi). MW = masa cząsteczkowa.
  14. Aby obliczyć średnią długość telomerów (TL) dla każdej próbki, użyj wzoru TL=∑(Inti)/ ∑(Inti/MWi).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy stężenia DNA (1, 2 i 3 μg) wyizolowane z linii komórkowej BJ-hTERT (telomeraza unieśmiertelniła ludzkie fibroblasty napletka)22 i ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostały przeanalizowane pod kątem długości telomerów. Tabela 1 przedstawia przypisanie pasów dla każdej próbki DNA. Rysunek 1 pokazuje fluorescencyjne zabarwienie żelu kwasem nukleinowym. Wzorce masy cząsteczkowej są wyraźnie widoczne. Określon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po elektroforezie rozmaz genomowego DNA jest wyższy niż 800 pz. Może się to zdarzyć, jeśli enzymy restrykcyjne są wadliwe lub jeśli potrzebne są dodatkowe enzymy (jak opisano powyżej). Drugim możliwym wyjaśnieniem jest to, że białko jest nadal przyłączone do DNA. Przy określaniu stężenia DNA za pomocą spektrofotometru stosunek 260/280 powinien wynosić około 1,8. Jeśli stosunek ten wynosi <1,5, występuje zanieczyszczenie białkiem, które może zakłócać trawienie enzymów restrykcyjnych. Albo próbka DNA musiałaby zostać ponow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Instytutu Onkologii Biobehawioralnej Uniwersytetu w Pittsburghu, który jest częściowo wspierany przez P30CA047904 z nagrodami.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biologics
Rsa1, enzym restrykcyjnyNew England Biolabs, IncR0167S10 000 U/mL, trawienie DNA.  W zestawie Cutsmart Buffer (bufor trawienny)
Hinf1, enzym restrykcyjnyNew England Biolabs, IncR0155S10 000 U/mL, trawienie DNA.  W zestawie Cutsmart Buffer (bufor do wytrawiania)
Seakem GTG AgarozaLonza50071elektroforezy agaroza
Optikinaza affymetrix78334X 500 UNT4 Kinaza polinukleotydowa
SYBR Zielone barwienie kwasem nukleinowym IThermoFisher ScientificS7567Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kBSondaBP2580100
(3'-(G3AT2)4-'5)Zintegrowane technologieOligonukleotyd DNA na zamówienie
Gamma-ATP-P32Perkin ElmerBLU502ZRadioizotop
Qiagen Hodowla krwi i komórek DNA Mini zestawQiagen13323Zestaw do ekstrakcji DNA
GE Illustra Microspin G-25 kolumnaGE Healthcare Life Sciences27-5325-01Do oczyszczania readioaktywnej sondy oligo
Ficoll 400niejonowy syntetyczny polimer
Sprzęt/Oprogramowanie
Owl A5 System do elektroforezy żelowej (20 cm x 25 cm)ThermoFisher ScientificA5Elektroforeza żelowa
Horizon 11.4 System elektroforezy żelowej (11 cm x 14 cm)Corel Life Sciences11068020Elektroforeza żelowa
Siatka nylonowa, 50, 12" x 12"Ted Pellam, Inc41-12105
GE Ekrany fosforowe do przechowywaniaGE Healthcare Nauki Przyrodnicze28-9564-75
Kaseta naświetlania ekranu fosforowegoGE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze63-0035-44
Inkubator hybrydyzacji izotemperaturowejFisher Scientific13-247-20Q
Cylindryczne rurki hybrydyzacyjneFisher Scientific13-247-300
Wytrząsarka orbitalna Belly DancerSigma-aldrichZ768499-1EAWytrząsarka orbitalna
Typhoon 9400ABIDo obrazowania żeli i ekranów luminoforowych
GraphPad Prism 6do tworzenia wykresówGraphPadw wersji 6.05
do tworzenia wykresówMicrosoft ExcelOffice 365
SpektrofotometrNanodropThermo ScientificNanodrp 2000
klasa nici C Fisher Scientific DNA Program Program Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).
  2. Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
  3. Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
  4. Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
  5. Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
  6. Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
  7. Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
  8. MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).
  9. Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
  10. Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
  11. Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).
  12. Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
  13. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  14. Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
  15. Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
  16. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  17. Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
  18. Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
  19. Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
  20. Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
  21. Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
  22. Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere LengthTerminal Restriction FragmentIn Gel HybridizationAgarose Gel ElectrophoresisGenomic DNA DigestionTelomere ProbePhosphor ImagingDNA LadderHybridization OvenPeripheral Blood Mononuclear

Related Articles