Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

DOI:

10.3791/56003

⸱

27 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczne terapie komórkowe zbliżyły się o krok do rzeczywistości dzięki wprowadzeniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Płodowe komórki macierzyste, takie jak płyn owodniowy i błonowe mezenchymalne komórki macierzyste, reprezentują unikalny typ niezróżnicowanych komórek, który jest obiecujący w inżynierii tkankowej i do przeprogramowania w iPSC na potrzeby przyszłych interwencji pediatrycznych i bankowania komórek macierzystych. Przedstawiony tutaj protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i hodowli pierwotnego płynu owodniowego i mezenchymalnych komórek macierzystych błony oraz generowania indukowanych episomalnie pluripotencjalnych komórek macierzystych z tych komórek w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach hodowli z wykorzystaniem ludzkiej rekombinowanej witronektyny i pożywki E8. Opisano również charakterystykę nowych linii poprzez zastosowanie rygorystycznych metod – cytometrii przepływowej, obrazowania konfokalnego, tworzenia potworniaków i profilowania transkrypcji. Nowo wygenerowane linie wyrażają markery embrionalnych komórek macierzystych – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – jednocześnie są ujemne dla markera SSEA-1. Linie komórek macierzystych tworzą potworniaki u myszy scid-beżowych w ciągu 6-8 tygodni, a potworniaki zawierają tkanki reprezentatywne dla wszystkich trzech listków zarodkowych. Profilowanie transkrypcyjne linii poprzez przesłanie danych z mikromacierzy o globalnej ekspresji do bioinformatycznego algorytmu oceny pluripotencji uznało wszystkie linie za pluripotencjalne i dlatego podejście to stanowi atrakcyjną alternatywę dla testów na zwierzętach. Nowe linie iPSC mogą być z łatwością wykorzystywane w dalszych eksperymentach obejmujących optymalizację różnicowania i inżynierię tkankową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do potencjalnych terapii zastępczych komórek, modelowania chorób i rozwoju oraz badań przesiewowych leków i toksykologicznych1,2,3. Terapie zastępcze można koncepcyjnie osiągnąć poprzez wstrzyknięcie komórek, implantację tkanki zróżnicowanej in vitro (takiej jak plastry sercowe) lub sterowaną regenerację za pomocą inżynierii tkankowej. Płyn owodniowy (AFSC) i błonowe komórki macierzyste (AMSC) są doskonałym źródłem komórek do tych interwencji bezpośrednio4,5,6,7 lub jako początkowa populacja komórek do przeprogramowania na pluripotencję8,9,10,11, 12.

Wczesne podejścia wykorzystywały niezdefiniowane systemy hodowli lub metody przeprogramowywania, które wymagały genomowej integracji konstruktów9,10,11,12. W nowszym badaniu wykorzystano pożywkę wolną od ksenozy, mimo że zastosowano mniej zdefiniowaną macierz przyczepu błony podstawnej (BMM), do generowania iPSC z komórek nabłonka płynu owodniowego. Jednak test tworzenia potworniaków nie został uwzględniony w badaniu wraz z bogactwem danych in vitro i molekularnych. Stwierdzono, że komórki nabłonka płynu owodniowego mają około 8-krotnie wyższą wydajność przeprogramowania w porównaniu z fibroblastami noworodków13. W innym badaniu stwierdzono również, że mezenchymalne komórki macierzyste z płynu owodniowego są przeprogramowane do iPSC ze znacznie wyższą wydajnością12.

Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być zróżnicowane w tkanki reprezentatywne dla wszystkich 3 listków zarodkowych, a tym samym mają największy potencjał. Pacjenci pediatryczni mogą odnieść korzyści z prenatalnego pobrania, przeprogramowania i inżynierii tkankowej autologicznych komórek macierzystych płynu owodniowego i komórek macierzystych błony owodniowej w okresie okołoporodowym. Co więcej, stosunkowo niski poziom różnicowania płodowych komórek macierzystych (niższy niż w przypadku dorosłych komórek macierzystych14,15) może teoretycznie pomóc w rozwiązaniu zaobserwowanego zachowania uprzedzeń epigenetycznych od komórek źródłowych w iPSC16.

Tutaj prezentujemy protokół przeprogramowania płynu owodniowego i błonowych komórek macierzystych do pluripotencji w chemicznie zdefiniowanym pożywce E8 wolnej od kseno-ksenozyny na rekombinowanej witonektynie17 (VTN) przy użyciu plazmidów epizodycznych18. Główną zaletą płynu owodniowego i komórek błonowych jako źródła komórek do przeprogramowania jest ich dostępność przed i okołoporodowo, a zatem takie podejście przyniosłoby korzyści głównie badaniom nad inżynierią tkankową u dzieci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnymi komisji etycznej ds. badań na ludziach. Uzyskano pisemną zgodę pacjenta na wykorzystanie płynu owodniowego do badań.

Ten protokół jest zgodny z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Alabamy.

1. Izolacja i hodowla pierwotnych mezenchymalnych komórek macierzystych wód płodowych

  1. Posiewanie komórek płynu owodniowego
    1. Uzyskać co najmniej 2,5 ml płynu owodniowego pobranego w procesie amniopunkcji przez lekarza.
      UWAGA: Wszelkie czynności związane z żywymi komórkami i tkankami muszą odbywać się w sterylnym komorze do hodowli tkankowych i należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Wymagana jest znajomość podstawowych hodowli komórkowych i sterylnej techniki.
    2. Przygotować pożywkę hodowlaną płynu owodniowego i komórek błonowych (AFMC): podłoże podstawowe EBM-2, 15% płodowa surowica bydlęca (FBS), 20 ng/ml bFGF, 25 ng/ml EGF, 10 ng/ml IGF. W przypadku hodowli pierwotnego płynu owodniowego, a także komórek macierzystych błony owodniowej, pożywkę należy uzupełnić roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
    3. W dniu 0 wymieszać 2,5 ml płynu owodniowego z 3,5 ml pożywki hodowlanej AFMC i płytką do kolby T25. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 48 godzin bez zakłóceń, zanim sprawdzi się obecność kolonii.
    4. W 5 dniu powinny być obecne kolonie przylegających komórek. Delikatnie kołysać kolbą, aby usunąć komórki, które nie przylegały całkowicie do dna i zanieczyszczeń, a następnie odessać próżniowo zużytą mieszaninę pożywki i płynu owodniowego za pomocą pipety Pasteura. Zastąp 5 ml świeżej pożywki AFMC.
    5. Kultura przez kolejne 5 dni. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, jak opisano w kroku 1.1.4.
  2. Izolacja pierwotnych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej owodni
    1. Łożysko należy uzyskać jak najszybciej po urodzeniu, najpóźniej w ciągu 24 godzin, aby zmaksymalizować integralność komórkową. Wyciąć 9cm2 segment owodni, usunąć skrzepy krwi i umyć w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 30 ml PBS uzupełnionym roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
    2. Zmielić błony za pomocą pary skalpeli na drobne kawałki w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm. Trawienie błon i ekstrakcja komórek zostanie osiągnięta za pomocą systemu dysocjacji tkanek. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: im drobniejsze kawałki tkanki po zmieleniu, tym większa liczba komórek odzyskana po strawieniu.
    3. Przenieś zmieloną masę tkanki błonowej za pomocą ostrzy skalpela do jednej probówki dysocjacyjnej tkanek i wymieszaj z 4,7 ml pożywki RPMI 1640. Wymieszać enzymy dysocjacyjne (patrz tabela materiałów).
    4. Zamontuj rurki na dysocjatorze tkankowym i uruchom program "h_tumor_01". Inkubować probówki w temperaturze 37 °C na platformie kołyszącej przez 30 minut.
    5. Następnie rozcieńczyć zawiesiny 35 ml RPMI 1640 i nałożyć na sitko o pojemności 70 μm umieszczone nad probówką wirówki zbiorczej o pojemności 50 ml.
    6. Wirować przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 5 ml RPMI 1640, policzyć komórki za pomocą hemacytometru i płytkę o gęstości 10 000 komórek/cm2 do naczyń poddanych kulturze tkankowej ze świeżo przygotowaną pożywką AFMC uzupełnioną roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
      UWAGA: W przypadku niepełnego trawienia obecne będą małe kawałki tkanki, a pojedyncze komórki będą rzadkie. Ponownie zakręć w dół i umieść cały pellet w jednej kolbie T75.
  3. Posiewy pierwszorzędowych AFSC i AMSC
    1. Przejście kolonii AFSC/AMSC przez odsysanie próżniowe zużytej pożywki za pomocą pipety Pasteura i dodanie 2 ml enzymu odłączającego komórki do kolby. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-8 minut.
    2. Postukać w kolbę, aby pomóc w usunięciu komórek i wymieszać zawiesinę z równą objętością pożywki AFMC (od tego momentu suplement antybiotykowo-przeciwgrzybiczy nie powinien być konieczny). Wirować przy 200 g przez 4-5 min. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura lub po prostu poprzez odwrócenie probówki i opróżnienie jej do pojemnika na odpady.
    3. Przesuń dolną część probówki wirówkowej, aby rozbić osad na zawiesinę jednokomórkową w pozostałej kropli płynu i wymieszać z pożywką AFMC do posiewu. Płytkę do kolb T o gęstości od 2 500 do 5 000 komórek/cm2.
    4. Zmieniaj podłoże co drugi dzień. Nie hodować linii komórkowych poza pasażem 6. Do celów przeprogramowania należy użyć jak najniższego przejścia.
    5. Przygotować zamrożone zapasy AFSC i AMSC jako zapasowe przy użyciu środka do zamrażania. Zebrać kultury za pomocą enzymu oddzielającego komórki, odwirować przy 200 g przez 4 °C przez 5 minut.
    6. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura i przesunąć spód probówki, aby ponumerować komórki w granulce. Zawiesić ponownie w pełnym podłożu zamrażającym o gęstości 1×106/ml i podwielokrotnie rozprowadzić do kriowialiów. Przechowywać w zamrażarce przez noc w temperaturze -80 °C. Następnie przenieś się do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

2. Przeprogramowanie na pluripotencję

  1. Uzyskaj plazmidy przeprogramowujące
    1. Kup plazmidy do przeprogramowywania za pośrednictwem repozytorium plazmidów non-profit. Potrzebna jest umowa o przekazaniu materiałów.
    2. Przekształć plazmidy w kompetentne komórki E. Coli i wyizoluj plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji plazmidów. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Zmierz stężenie plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru. Dążyć do uzyskania wysokiego wynikowego stężenia plazmidu, najlepiej około 1 μg/μl, aby uniknąć rozcieńczenia próbki podczas transfekcji.
    4. Zmierzyć stężenia poszczególnych plazmidów za pomocą spektrofotometru UV i podzielić je indywidualnie.
    5. Wymieszaj ze sobą odpowiednio 3 μg, 3 μg i 2 μg plazmidów EN2K, ET2K i M2L. To jest rozwiązanie do przeprogramowania plazmidu. Ilość roztworu plazmidu wystarcza do transfekcji 1 x 106 komórek. Przygotuj kilka takich porcji.
    6. Przechowywać wszystkie podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotuj docelowe płytki hodowlane
    1. Pokryj jedną 6-dołkową płytkę witronektyną – dodaj 1 ml buforu rozcieńczającego witronektynę do każdej studzienki i wymieszaj z 40 μl roztworu podstawowego VTN (1 μg/cm2). Pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
    2. Odsysać próżniowo roztwór za pomocą pipety Pasteura i zastąpić 2 ml pożywki AFMC w każdym dołku. Przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu pokrycia komórek.
      UWAGA: Ważne: Pożywka AFMC użyta na tym etapie nie powinna zawierać żadnych roztworów antybiotyków ani przeciwgrzybiczych.
  3. Zbiór pierwotnych kultur AFSC/AMSC
    UWAGA: Rozwiń AFSC/AMSC w kulturze na tyle, aby uzyskać mrożone zapasy o niskiej liczbie przejścia i przeznacz jedną kolbę T-75 na przeprogramowanie. Ponieważ do eksperymentu wystarczy zaledwie 100 000 komórek, należy dążyć do zebrania około 500 000 komórek, aby zrekompensować straty i jeśli ma zostać przetestowana optymalizacja parametrów transfekcji lub różnych warunków hodowli.
    1. Jak najszybciej, przy niskich pasażach, należy zebrać AFSC/AMSC, stosując mieszaninę enzymów do oddzielania komórek, jak opisano w krokach 1.3.1 do 1.3.2. Po odwirowaniu komórek przejdź do następnego kroku.
    2. Zawiesić osad w 1 ml PBS i dobrze wymieszać, aby zmyć składniki surowicy. Policz komórki za pomocą hemekytometru. Dostosuj gęstość komórek do 100 000/ml PBS i podziel na 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Zapewnia to tylko minimalny czas kontaktu między komórkami a buforem używanym do transfekcji.
    3. Umieść probówkę do mikrowirówki na probówkach polistyrenowych o pojemności 5 ml (jako adaptery umożliwią odwirowanie w zwykłym wirniku obrotowym) i wiruj przy 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Odwrócić probówki i wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady. Nie używaj wirnika o stałym kącie nachylenia.
    4. Wykonać dodatkowy etap wirowania przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Umożliwi to zebranie się pozostałej cieczy ze ścianek rurki na dnie. Ostrożnie odessać całość za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  4. Transfekcja z przeprogramowaniem plazmidów
    1. Do eksperymentów z przeprogramowywaniem zostanie wykorzystany system transfekcji (patrz Tabela Materiałów) w celu dostarczenia plazmidów do przeprogramowania komórek. Umieść końcówki do transfekcji, probówki do transfekcji, bufor do responowania i bufor elektrolityczny w komorze do hodowli tkankowej. Odczynniki z zestawu przechowuje się w temperaturze pokojowej do momentu ich otwarcia, a następnie przechowuje się je w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Używamy wersji zestawu 10 μL.
    2. Zbliż urządzenie do transfekcji, aby jego stację metrową można było umieścić bezpośrednio w szafce. Napełnij jedną probówkę transfekcyjną 3 ml buforu elektrolitycznego i zamontuj probówkę w stacji, wciskając ją do końca do szczeliny.
    3. Pobrać podwielokrotności roztworu plazmidu do przeprogramowania, przygotowane w kroku 2.1.5, z magazynu w temperaturze -80 °C i pozostawić je do rozmrożenia w temperaturze pokojowej w komorze hodowlanej.
    4. Na urządzeniu do transfekcji wybierz następujące parametry transfekcji: 950 V, 40 ms i 1 impuls.
    5. Zawiesić osad zawierający 100 000 komórek w 10 μl buforze do resuspensji. Od tego momentu należy pracować szybko, ponieważ bufor do ponownego zawieszania jest lekko toksyczny, a wydłużony czas ekspozycji powoduje zauważalnie niższą żywotność komórek.
    6. Wymieszać w 1/10 roztworu plazmidu do przeprogramowywania (podwielokrotność roztworu przygotowano dla łącznie 1 x 106 komórek).
    7. Zamontuj końcówkę do transfekcji na pipecie do transfekcji.
    8. Zawiesinę komórkową należy ostrożnie zassać do końcówki transfekcyjnej, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki, usunąć zawiesinę i powtórzyć aspirację. Pęcherzyki powietrza będą utrudniać transfekcję.
    9. Włóż pipetę do transfekcji do rurki transfekcyjnej i naciśnij przycisk "START" na ekranie urządzenia do transfekcji. Poczekaj na wyświetlenie na ekranie komunikatu informującego o powodzeniu transfekcji i natychmiast wyjmij pipetę z probówki.
    10. Usunąć zawiesinę do 1 dołka z docelowej płytki 6-dołkowej przygotowanej w sekcji 2.2. Wymieszaj pożywkę z sąsiedniej studzienki i rozprowadź zawiesinę równomiernie w obu studzienkach (uzyskana gęstość komórek wyniesie 50 000 / dołek).
    11. Powtórzyć transfekcję dla wszystkich probówek do mikrowirówek zawierających AFSC/AMSC indywidualnie. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Posiew transfekowanego AFSC/AMSC
    1. Hoduj transfekowane komórki przez 2-5 dni. Następnie przejść na pożywkę przeprogramowującą składającą się z E8 uzupełnionego 100 μM maślanu sodu w dniu 3,
      UWAGA: Można wykonać wtórne przejście, aby uniknąć przerostu źródła AFSC/AMSC. Jednak przejście wyłączy opcję poprawnego obliczenia wydajności przeprogramowania, jeśli ten parametr jest interesujący.
    2. Zmieniaj medium przeprogramowujące codziennie na co drugi dzień przez 10 dni. Zmieniaj podłoże codziennie od 10 dnia.
  6. Ręczne pobieranie w pełni przeprogramowanych kolonii do ekspansji klonalnej
    1. W pełni przeprogramowane kolonie pojawiają się około 14 dnia. Pozwól koloniom powiększyć się i stać się zwartymi. Można je ręcznie zbierać i przenosić na świeże talerze już w dniach 15-16.
    2. Na 1 godzinę przed procedurą pobierania pokryć 24-dołkowe płytki 8 μl VTN w 300 μl buforu rozcieńczającego witronektynę na basenik (1 μg/cm2) i inkubować w temperaturze pokojowej lub 37 °C. Zastąp roztwór pożywką E8 bez maślanu sodu.
    3. Wybierz kolonie o odpowiedniej wielkości (najlepiej o średnicy ponad 400 μm) w sterylnej komorze hodowlanej. Można użyć mikroskopu z kontrastem fazowym lub mikroskopu stereoskopowego.
    4. Do kompletacji używany będzie mikroskop obrazowy LCD umieszczony w szafce, ponieważ jego monitor eliminuje potrzebę korzystania z okularów. Wysterylizuj stolik mikroskopu 70% etanolem.
    5. Używając zwykłego mikroskopu hodowli komórkowych z kontrastem fazowym, wybierz, zaznacz i zanotuj liczbę kolonii do pobrania. Jest to ważne, aby upewnić się, że nie marnuje się czasu na ten proces podczas faktycznego kompletowania.
    6. Napełnij liczbę probówek do PCR równą lub większą niż liczba kolonii do pobrania 30 μl 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS. Kolonie zostaną umieszczone w tych probówkach w celu częściowej dysocjacji przed posiewem.
    7. Zaplanuj pobranie 5 rodzin na raz z płytek za pomocą pipety o pojemności 10 μl ustawionej na 2 μl. Trzymaj końcówkę pipety pod kątem na krawędzi kolonii i ostrożnie, stopniowo zeskrobuj całą kolonię z powierzchni. Natychmiast odessać całą kolonię do końcówki pipety i przenieść ją do jednej z przygotowanych probówek PCR z EDTA.
    8. Powtórz z pozostałymi 4 koloniami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4-6 minut.
    9. Delikatnie pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą większej końcówki pipety, aby rozbić kolonię na mniejsze grudki. Należy unikać tworzenia zawiesiny jednokomórkowej.
    10. Zawiesinę należy umieścić bezpośrednio w studzience docelowej na płytce 24-dołkowej przygotowanej w kroku 2.6.2. Powtórz z pozostałymi koloniami.
    11. Powtórz kroki od 2.6.6 do 2.6.10, jeśli ma być zebranych więcej niż 5 kolonii, ale nie należy wybierać więcej niż 5 kolonii na raz. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Ekspansja klonalna i dojrzewanie iPSC
    1. Pozwól koloniom rosnąć i stawać się zwartymi. Wystarczą 3-6 dni. Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną. Użyj od 400 μl do 1 ml pożywki E8 w zależności od gęstości komórek.
    2. Studzienki 24-dołkowej płytki o wystarczającej gęstości kolonii zostaną rozszerzone na płytki 6-dołkowe. 1 godzinę przed pasażowaniem pokryj płytki 6-dołkowe VTN (jak w kroku 2.2.1). Następnie zastąp roztwór w studzience 2 ml pożywki E8 na studzienkę.
    3. Odessać zużyte podłoże ze studzienek źródłowych za pomocą pipety o pojemności 1 ml i zastąpić 300 μl 0,5 mM EDTA do przemycia. Natychmiast odessać za pomocą tej samej końcówki pipety i ponownie zastąpić 300 μl 0,5 mM EDTA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odessać cały płyn za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    4. Ustaw pipetę o pojemności 1 ml do pojemności, zamontuj na niej końcówkę o szerokim otworze o pojemności 1 ml i zassaj pożywkę E8 od tarczy do końcówki. Zmyj źródłową kulturę iPSC strumieniem pożywki.
    5. Przenieś zawiesinę do dołka docelowego i pipetuj w górę iw dół kilka razy, aby rozbić kolonie na grudki po 20-50 komórek. Upewnij się, że są one równomiernie rozprowadzone w studzience poprzez delikatne kołysanie i potrząsanie płytką i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Zmieniaj pożywkę codziennie i pasaż co 3 do 4 dni. Wszelkie różnicujące się kolonie można oznaczyć pod mikroskopem z kontrastem fazowym i usunąć za pomocą końcówki pipety w komorze hodowlanej. Pozwala to na selektywne rozmnażanie wysokiej jakości czystej kultury iPSC.
    7. Na 1 godzinę przed pasażowaniem pokryć dołki płytki 6-dołkowej VTN, jak w kroku 2.2.1. Następnie zastąp roztwór 2 ml pożywki E8 na studzienkę.
    8. Rutynowe pasażowanie jest podobne do początkowego pasażu wykonywanego przy użyciu 0,5 mM EDTA (kroki od 2.7.2 do 2.7.5). Zastąp zużyte podłoże w jednym dołku 6-dołkowej płytki 1 ml EDTA do umycia i wyrzucenia.
    9. Dodać 1 ml EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-7 minut w celu częściowej dysocjacji. W razie potrzeby zoptymalizuj czas inkubacji, upewniając się, że powstaje zawiesina składająca się z około 20 do 50 grudek komórek. Unikaj dysocjacji na pojedyncze komórki.
    10. Odrzucić roztwór EDTA i odessać 1 ml pożywki E8 za pomocą pipety o pojemności 1 ml z miejsca docelowego do końcówki pipety o szerokim otworze.
    11. Zmyj źródłową kulturę iPSC strumieniem pożywki E8 kilkakrotnie, aż pożądana jej część zostanie uwolniona z powierzchni i przeniesiona do dołka docelowego. Ta część reprezentuje stosunek podziału (np. 1/8 kultury można przenieść w stosunku 1:8).
    12. Przejazd co 3-4 dni. Pozwól liniom iPSC dojrzeć, hodując je przez co najmniej 15 pasaży przed użyciem ich w dalszych eksperymentach

3. Charakterystyka i potwierdzenie pluripotencji

UWAGA: Zapoznaj się z plikami uzupełniającymi, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.

  1. Test tworzenia potworniaka
    1. Aby określić zdolność iPSC do różnicowania się w tkanki reprezentatywne dla wszystkich trzech listków zarodkowych za pomocą testu tworzenia potworniaka, należy postępować zgodnie z zasadami instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, planując z wyprzedzeniem, aby dać czas na złożenie odpowiednich dokumentów protokołu. Tworzenie potworniaka u myszy zajmie od 6 do 10 tygodni.
    2. Hodowla 4 dołków na 6-dołkowej płytce na linię iPSC przez 4 dni. Przybliżona liczba komórek wstrzykniętych do jednego boku myszy wynosi od 0,5 do 1 x 106 komórek. Opcjonalnie: dodatkowa studzienka może być dedykowana do określenia reprezentatywnej liczby komórek w studzience za pomocą dysocjacji pojedynczej komórki za pomocą enzymu odłączającego komórki i liczenia.
    3. Obliczyć objętość mieszaniny E8/BMM, w której zawiesi się grudki iPSC: Wstrzykuje się obu boków myszy, do każdej wstrzykuje się 150 μl zawiesiny grudek. Trzy myszy wystarczą, aby przetestować tworzenie się potworniaka jednej linii iPSC. Dodać dodatkowe 150 μl na igłę do otrzymanej objętości, aby skompensować utratę objętości martwej. Używana jest 1 igła na mysz. Całkowita objętość wynosi zatem 3 * (150 μL * 2 + 150 μL) = 1350 μL
    4. Częściowo oddzielić kolonie iPSC od EDTA, tak jakby miały zostać pasażowane, jak opisano w krokach od 2.7.8 do 2.7.10. Ważne jest, aby kolonie były zdysocjowane w kępy, a nie rozdzielone na pojedyncze komórki.
    5. Zmyć kolonie iPSC 675 μl pożywki E8 (połowa obliczonej objętości z kroku 3.3.3), używając końcówki o szerokim otworze. Przenieść zawiesinę grudek do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml. Ułóż na lodzie.
    6. Połącz z 675 μl BMM. Powstałą zawiesinę należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia.
    7. Znieczulij myszy, aby je unieruchomić za pomocą izofluranu. Powinno to być wykonywane lub prowadzone przez wykwalifikowany personel wiwarium.
    8. Krótko przetrząsnąć rurkę z polistyrenu o pojemności 5 ml i odessać zawiesinę grudek (450 μl na mysz) do jednej strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę 22 G. Wstrzyknąć podskórnie 150 μl zawiesiny komórek. Ten wolumin zawiera około 1 x 106 komórek (patrz krok 3.1.2).
    9. Wstrzyknij 3 myszy na linię iPSC. Postępuj zgodnie z odpowiednimi praktykami opieki nad zwierzętami we wszystkich procedurach.
    10. Codziennie monitoruj stan zdrowia myszy.
    11. Gdy potworniaki osiągną średnicę końcową od 1,5 do 2 cm, należy poddać myszy eutanazji, eksplantacji potworników i przechowywać je w roztworze formaliny w celu utrwalenia tkanek przez 24 godziny.
    12. Przynieś utrwalone potworniaki do centrum histologicznego w celu barwienia hematoksyliny eozyny (H&E). Patolog oceni obecność tkanek wszystkich trzech listków zarodkowych.
      Uwaga dotycząca kariotypowania: Żywe kultury iPSC powinny być wysyłane do wyspecjalizowanych laboratoriów cytogenetycznych w celu zbadania integralności kariotypu. Zaleca się, aby badanie to było wykonywane co 5 pasaży.
  2. Profilowanie transkrypcji
    1. Hoduj 2 dołki 6-dołkowej płytki przez 3-4 dni, aby uzyskać jedną próbkę RNA. Używaj tylko kultur wysokiej jakości, niewielkie zanieczyszczenie różnicującymi się komórkami można rozwiązać, zeskrobując je za pomocą końcówki pipety.
    2. Wyizolować RNA z kultur iPSC za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z protokołem producenta. Wyślij próbki do specjalistycznego ośrodka zajmującego się rdzeniem genomicznym.
    3. Uzyskaj globalne profile transkrypcyjne linii iPSC za pomocą mikromacierzy (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z obsługiwanymi wyborami) lub sekwencjonowania RNA.
    4. Prześlij pliki "*.idat" do bioinformatycznej oceny pluripotencji za pośrednictwem interfejsu online w Instytucie Coriella. Alternatywnie, prześlij pliki "*.cel" w celu bioinformatycznej identyfikacji typu komórki, w tym pluripotencjalnych komórek macierzystych, za pośrednictwem interfejsu online na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa. Szczegółowe informacje na temat rodzajów danych akceptowanych przez poszczególne testy bioinformatyczne można znaleźć w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano świadomą pisemną zgodę od pacjentów przed pobraniem płynu owodniowego do celów badań genetycznych i poświęceniem małej porcji płynu do badań. Nie jest wymagana zgoda na wykorzystanie błony owodniowej w badaniach, ponieważ łożysko stanowi odpad medyczny. Płyn owodniowy i błonowe komórki macierzyste wykazują typowe właściwości mezenchymalne, morfologicznie ich komórki są wrzecionowate i jasne fazowo. Po przeprogramowaniu komórki przechodzą przejście mezenchymalne do nabłonkowego (M...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowa faza wytwarzania iPSC z płodowych komórek macierzystych polega na ekstrakcji komórek źródłowych z tkanek płodu, ich hodowli, ekspansji i wprowadzeniu plazmidów episomalnych przeprogramowujących. Po tej fazie następuje okres hodowli trwający około 14-18 dni, zanim pierwsze w pełni przeprogramowane kolonie będą mogły się rozmnożyć. Ostatnią fazą jest dojrzewanie klonów iPSC. Wstępna ekstrakcja komórek macierzystych błony owodniowej odbywa się poprzez połączone mechaniczne i enzymatyczne trawienie owodni. Odkryli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fonds Medizinische Forschung na Uniwersytecie w Zurychu, Forschungskredit Uniwersytetu w Zurychu, SCIEX NMSCh w ramach stypendiów 10.216 i 12.176, Szwajcarskie Towarzystwo Kardiologiczne, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki w ramach grantu [320030-122273] i [310030-143992], 7. program ramowy, Life Valve, Komisję Europejską w ramach grantu [242008], Fundację Olgi Mayenfisch, Fundacja EMDO, Start-up Grant 2012 Szpitala Uniwersyteckiego w Zurychu oraz wewnętrzne finansowanie Mitchell Cancer Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do dysocjacji guza, ludzkiMiltenyi Biotec130-095-929, zestaw odczynników, zawiera rurki do dysocjacji tkanek i enzymy dysocjacji tkanek
gentleMACS dysocjatorMiltenyi Biotec130-093-235system dysocjacji tkanek, dysocjator
Thermo Scientific™ Shandon&handel; Skalpel jednorazowy nr 10, sterylny, pakowany pojedynczo, 5,75 (14,6cm)Thermo-Fisher3120032
70 µ m sitka komórkoweCorning10054-456
RPMI 1640 średniThermo-Fisher32404014 
platforma wahadłowaVWR40000-300
Probówki wirówkowe 50 mlThermo-Fisher339652
Probówki wirówkowe 15 mlThermo-Fisher339650
EBM-2 podłoże podstawoweLonzaCC-3156podłoże podstawowe do podłoża
AFMC FGF 2 Człowiek (wyrażony w E. coli, nieglikozylowany)Prospec BioCYT-218bFGF, suplement do podłoża AFMC
EGF Human, PichiaProspec BioCYT-332 EGF, suplement do podłoża AFMC
LR3 Insulinopodobny czynnik wzrostu-1 Ludzki rekombinowanyProspec BioCYT-022IGF, suplement do pożywki AFMC
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana do zarodkowych komórek macierzystychThermo-Fisher10439024FBS
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)Thermo-Fisher15240062 dla pierwotnego AFSC/AMSC, dla rutynowego AFSC/AMSC nie powinno to być konieczne, nie stosować w pożywce dla transfekowanych komórek!
Rozwiązanie do odriewania komórek AccutaseStemCell Technologies07920enzym odłączania komórek
CryoStor™ CS10StemCell Technologies07930kompletna pożywka do zamrażania
PBS, pH 7,4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362do izolacji plazmidu
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, czynniki przeprogramowujące Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, czynniki przeprogramowania Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, czynniki przeprogramowania c-Myc+LIN28
Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000cSpektrofotometrThermo-FisherND-2000C
Neon® System transfekcjiThermo-FisherMPK5000system transfekcji, komponenty:
Pipeta Neon - pipeta transfekcyjna
Urządzenie Neon - urządzenie do transfekcji
Neon® System transfekcji 10 i mikro; L KitThermo-FisherMPK1025zestaw materiałów eksploatacyjnych do systemu transfekcji Neon, zawiera:
Końcówka Neon - końcówka transfekcyjna
Rurka neonowa - rurka transfekcyjna
bufor R - bufor do zawieszania
bufor E - bufor elektrolityczny
Stemolekula&handel; Maślan soduStemGent04-0005małocząsteczkowy wzmacniacz przeprogramowania
TeSR-E8StemCell Technologies05940E8 pożywka
Witronektyna XF™StemCell Technologies07180VTN, stężenie magazynowe 250 &mikro; g/ml, stosowany do powlekania na poziomie 1 &mikro; g/cm2 bufor do rozcieńczania witronektyny (CellAdhere)
CellAdhere™ Bufor rozcieńczającyStemCell Technologies07183bufor do rozcieńczania witronektyny
UltraPure™ 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020rozcieńczyć PBS do 0,5 mM przed użyciem
EVOS® System obrazowania FL System mikroskopuThermo-Fisher ScientificAMF4300LCD
CKX53 Mikroskop odwróconydo hodowli komórek z kontrastem fazowymOlympus
Pierce™ 16% formaldehyd (w/v), bez metanoluThermo-Fisher28908rozcieńczyć do 4% z PBS przed użyciem, rozcieńczony można przechowywać w temperaturze 2-8 & stopni; C przez 1 tydzień
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050bufor przepuszczalny, schładzanie do -20 ° C przed użyciem
myszy IgG1, κ Kontrola izotypu, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782kontrolę izotypu dla Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1 i kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783kontrolę izotypu dla myszy Sox2
anty-ludzkiej Oct3/4 (ludzka izoforma A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Mysz anty-ludzka Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Mysz anty-ludzka Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
Mysz IgGM, κ Kontrola izotypu, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617kontrolę izotypu dla TRA-1-60
IgGM myszy, κ Kontrola izotypu, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618kontrola izotypu dla TRA-1-81
Mysz anty-ludzka TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Mysz anty-ludzka TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mysz IgG1, κ Kontrola izotypu, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129kontrolę izotypu dla myszy SSEA-1
IgG3, κ Kontrola izotypu, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321kontrola izotypu dla SSEA-4
Mysz anty-ludzka SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
Mysz anty-ludzka SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Fragment kozy anty-mysi IgG+IgM, Alexa Fluor® 488Jackson Immunoresearch115-606-068stosować w rozcieńczeniu 1:600 lub dalszym zoptymalizować
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-068stosować w rozcieńczeniu 1:600 lub dalej zoptymalizować
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490roztwór podstawowy 10 mM, dalej rozcieńczyć do 1:12.000 w celu uzyskania roztworu roboczego
Corning® Matrigel® Obniżony czynnik wzrostu, Phenol Red-FreeCorning356231Membrane Matrix (BMM)
myszy scid-beżowe, samicaTaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)Zestaw do izolacji RNAQiagen74134
Kolby T-25, kolbyThermo-Fisher156367
Thermo-Fisherpoddane kulturze tkankowej
Nunc™ naczynie do hodowli tkankowychThermo-Fisher12-567-650 Naczynie do hodowli tkankowych 10 cm
Płytki 6-dołkowe, poddane hodowli tkankowejThermo-Fisher140675
Neubauer komora licząca (hemacytometr)VWR15170-173
Mr. Frosty™ Pojemnik mroźniczyThermo-Fisher5100-0001 pojemnik do zamrażania
Probówki FACS, probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, 5 mlCorning3520585 ml probówki polistyrenowe
Probówki Eppendorf, 1,5 mlThermo-Fisher05-402-96Probówki do mikrowirówek 1,5 ml
Probówki do PCR, 200 i mikro; lThermo-Fisher14-222-262
, 100 do 1250 i mikro; lThermo-Fisher02-707-407końcówki do pipet o wąskim otworze 1 ml
, końcówki do pipet, 5 do 300 i mikro; lThermo-Fisher02-707-410
, 0,1 do 10 &mikro; lThermo-Fisher02-707-437
końcówki do pipet o szerokim otworze, 1000 i mikro; lVWR89049-166końcówki o szerokim otworze 1 ml
szklane Pipety PasteuraThermo-Fisher13-678-20A
etanol, 200 proofThermo-Fisher04-355-451
mieszalnik wirowyVWR10153-842
komorowe szkło nakrywkowe, 8-dołkowe, szkło borokrzemianowe 1,5 mmThermo-Fisher155409konfokalne naczynia do hodowli ze szklanym dnem
Igły 22GVWR82002-366
Thermo-Fisher22-253-260
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lutrwalanie eksplantowanych potworniaków
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipMikromacierz ekspresji IlluminaBD-103-0204, obsługiwana przez PluriTest, wycofana przez producenta
PrimeView Human Genome U219 Array PlateekspresyjnaThermo-Fisher901605 (dawniej marka Affymetrix), wkrótce będzie obsługiwana przez PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482mikromacierz ekspresji (dawniej marka Affymetrix), obsługiwana przez CellNet, wkrótce obsługiwana przez PluriTest
PluriTest®Coriell Institutewww.pluritest.org, bezpłatna usługa do bioinformatycznej oceny pluripotencji, akceptuje dane z mikromacierzy - pliki *.idat z platformy HT-12 v4, wkrótce będą obsługiwać dane sekwencjonowania mikromacierzy U133, U219 i RNA
CellNetJohns Hopkins Universitycellnet.hms.harvard.edu, bezpłatna usługa do bioinformatycznej identyfikacji typu komórki, w tym plutipotencjalnych komórek macierzystych, na podstawie danych z mikromacierzy U133 - pliki *.cel, wkrótce będą obsługiwać RNA Sekwencjonowanie danych
system dysocjacji tkanek obrazowania Mikroskop Base T-75 poddane obróbce kulturtkankowych, 156499 Końcówki do pipet Końcówki do pipet Strzykawki insulinowe Mikromacierz

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki z p ynu owodniowegomezenchymalne kom rki macierzyste b ony owodniowejreprogramowanie episomalnewarunki chemicznie zdefiniowaneludzka rekombinowana witronektynapo ywka E8cytometria przep ywowaobrazowanie konfokalnetworzenie potworniak wprofilowanie transkrypcyjne

Powiązane artykuły