Method Article

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

DOI:

10.3791/56010

⸱

July 31st, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacisk krosowy dla całych komórek to złoty standard do pomiaru właściwości elektrycznych pojedynczych komórek. Jednak zacisk krosowy in vitro pozostaje trudną i niskoprzepustową techniką ze względu na swoją złożoność i dużą zależność od obsługi i kontroli użytkownika. Manuskrypt ten demonstruje sterowany obrazem automatyczny system zaciskania krostek do eksperymentów in vitro z klamrami krosowymi całych komórek w ostrych wycinkach mózgu. Nasz system implementuje algorytm oparty na wizji komputerowej do wykrywania komórek znakowanych fluorescencyjnie i kierowania ich do w pełni automatycznego łatania za pomocą mikromanipulatora i wewnętrznej kontroli ciśnienia pipety. Cały proces jest wysoce zautomatyzowany, z minimalnymi wymaganiami dotyczącymi interwencji człowieka. Informacje eksperymentalne w czasie rzeczywistym, w tym opór elektryczny i ciśnienie wewnętrzne pipety, są dokumentowane elektronicznie w celu przyszłej analizy i optymalizacji pod kątem różnych typów komórek. Chociaż nasz system jest opisany w kontekście zapisów ostrych wycinków mózgu, można go również zastosować do zautomatyzowanego, sterowanego obrazem zacisku krosowego zdysocjowanych neuronów, organotypowych kultur warstwowych i innych typów komórek nieneuronalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika zaciskania krostek została po raz pierwszy opracowana przez Nehera i Sakmanna w latach siedemdziesiątych XX wieku do badania kanałów jonowych błon pobudliwych1. Od tego czasu zaciskanie plastrów zostało zastosowane w badaniu wielu różnych osób na poziomie komórkowym, synaptycznym i obwodowym - zarówno in vitro, jak i in vivo - w wielu różnych typach komórek, w tym neuronach, kardiomiocytach, oocytach Xenopus i sztucznych liposomach2. Proces ten obejmuje prawidłową identyfikację i ukierunkowanie na komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, skomplikowane sterowanie mikromanipulatorem w celu przesunięcia pipety z plastrem w bliską odległość od komórki, zastosowanie dodatniego i ujemnego ciśnienia do pipety w odpowiednim czasie w celu ustalenia szczelnej łatki gigaseal oraz włamanie w celu ustalenia konfiguracji łaty na całej komórce. Mocowanie łat jest zwykle wykonywane ręcznie i wymaga intensywnego szkolenia, aby je opanować. Nawet dla badacza doświadczonego z zaciskiem krosowym wskaźnik sukcesu jest stosunkowo niski. Ostatnio podjęto kilka prób zautomatyzowania eksperymentów z zaciskami krosowymi. W celu osiągnięcia automatyzacji rozwinęły się dwie główne strategie: rozszerzenie standardowych urządzeń do zaciskania krosówek w celu zapewnienia automatycznej kontroli procesu łatania oraz projektowanie nowych urządzeń i technik od podstaw. Pierwszą strategię można dostosować do istniejącego sprzętu i można ją stosować w różnych zastosowaniach, w tym w ślepych zaciskach in vivo3,4,5, in vitro patch clamp ostrych wycinków mózgu, organotypowych kultur warstwowych i hodowanych zdysocjowanych neuronów6. Umożliwia przeszukiwanie złożonych obwodów lokalnych przy użyciu wielu mikromanipulatorów jednocześnie7. Metoda łaty planarnej jest przykładem nowej strategii rozwoju, która może osiągnąć wysoką przepustowość jednoczesnego zacisku krosowego komórek w zawiesinie do celów badań przesiewowych leków8. Jednak metoda łaty płaskiej nie ma zastosowania do wszystkich typów komórek, w szczególności neuronów z długimi wyrostkami lub nienaruszonymi obwodami zawierającymi rozległe połączenia. Ogranicza to jego zastosowanie do mapowania skomplikowanych obwodów układu nerwowego, co jest kluczową zaletą tradycyjnej technologii zacisków krosowych.

Opracowaliśmy system, który automatyzuje proces ręcznego zaciskania krostek in vitro, rozszerzając standardowy sprzęt do zaciskania krostek. Nasz system, Autopatcher IG, zapewnia automatyczną kalibrację pipet, identyfikację docelowych komórek fluorescencyjnych, automatyczną kontrolę ruchu pipet, automatyczne łatanie całych komórek i rejestrowanie danych. System może automatycznie rejestrować wiele obrazów wycinków mózgu na różnych głębokościach; analizować je za pomocą wizji komputerowej; i wyodrębnij informacje, w tym współrzędne komórek znakowanych fluorescencyjnie. Informacje te można następnie wykorzystać do namierzania i automatycznego łatania interesujących komórek. Oprogramowanie jest napisane w Pythonie — darmowym języku programowania typu open source — przy użyciu kilku bibliotek typu open source. Zapewnia to jego dostępność dla innych badaczy oraz poprawia odtwarzalność i rygor eksperymentów elektrofizjologicznych. System ma konstrukcję modułową, dzięki czemu dodatkowy sprzęt można łatwo połączyć z obecnym systemem przedstawionym tutaj.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ustawienia systemu

  1. Zbuduj jednostkę sterującą ciśnieniem.
    1. Zmontuj jednostkę sterującą ciśnieniem zgodnie z mapą obwodu ( Rysunek 1). niezbędne części do płytki obwodu drukowanego (PCB) wyprodukowanej zgodnie ze schematem obwodu elektrycznego (Rysunek 1b). Używaj standardowych rezystorów, diod LED, tranzystorów polowych (MOSFET) z tlenku metalu, kondensatorów i złączy (patrz tabela materiałów). zawory elektromagnetyczne do płytki drukowanej. Podłącz pompę powietrza i czujnik ciśnienia powietrza do płytki drukowanej za pomocą przewodu elektrycznego.
      UWAGA: Zbudowanie regulatora ciśnienia z dostępnymi wszystkimi niezbędnymi częściami powinno zająć około 2 godzin.
  2. Podłącz płytę wtórnego akwizycji danych (DAQ).
    1. Podłącz wyjścia danych z płytki drukowanej do płytki DAQ, postępując zgodnie z tabelą 1.
      UWAGA: Płyta DAQ będzie działać w "trybie Single-ended". Mapę portów można znaleźć w instrukcji obsługi (patrz Tabela materiałów).
    2. Podłącz "AIn Pr S" do jednego z kanałów wejścia analogowego (AI), a "R-Gr" do jednego z analogowych uziemień na wtórnej płycie DAQ.
    3. Podłącz główne wyjście ze wzmacniacza do jednego z kanałów AI, a masę do masy analogowej wtórnej płyty DAQ.
      UWAGA: Do podłączenia głównego wyjścia ze wzmacniacza można użyć standardowego BNC.
    4. Zdejmij drugi koniec i podłącz sygnał dodatni (tj. rdzeń miedziany) do kanału AI, a masę (tj. cienki drut wokół rdzenia) do uziemienia analogowego. Powtórz ten krok dla drugiego kanału, jeśli używany jest więcej niż jeden kanał patch.
      UWAGA: Wejście analogowe do karty DAQ zostanie skonfigurowane w późniejszych krokach.
    5. Podłącz zasilanie do wyjścia zasilania dodatkowej płyty DAQ. Użyj oddzielnego źródła zasilania 12 V dla pompy.
  3. Podłącz rurkę.
    1. Podłączyć pompę powietrza i dwa zawory zgodnie z tabelą 2. W ostatnim kroku użyj złącza 3-drożnego, aby podłączyć miękki przewód z górnego portu zaworu 2, czujnik ciśnienia i uchwyt na pipety.
    2. Dodaj kolejne złącze 3-stykowe do rurki podłączonej do uchwytu pipety, jeśli używane są dwie pipety. Podczas łatania należy ręcznie przełączać się między zaworami a pipetami używanymi.
  4. Zainstaluj Autopatcher IG.
    UWAGA: Wymagania systemowe: Autopatcher IG został przetestowany tylko na komputerze z systemem Windows 7. Nie został zweryfikowany dla innych systemów operacyjnych. Opisana procedura dotyczy w szczególności sprzętu wymienionego w Tabeli materiałów.
    1. Pobierz Autopatcher-IG z GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
    2. Zainstaluj Pythona (zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z wersją i adresem pobierania).
    3. Odinstaluj bibliotekę PyQt4, wpisując "uninstall PyQt4" w terminalu wiersza poleceń.
      UWAGA: System korzysta ze starszej wersji biblioteki PyQt4 w celu uzyskania kompatybilności z bibliotekami Qwt i Opencv.
    4. Zainstaluj biblioteki języka Python z historycznych plików kół (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Znajdź następujące pliki: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) i Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Aby zainstalować pliki wheel, przejdź do katalogu, w którym pliki są zapisane i wpisz "install ***wheelfilename***.whl". Zastąp "***wheelfilename***" rzeczywistą nazwą pliku.
        UWAGA: "cp27" w nazwie pliku koła oznacza Pythona 2.7, a "win32" oznacza 32-bitowy system Windows. Jeśli "win32" nie działa, spróbuj "win64".
    5. Aby sterować kamerą CCD, pobierz i zainstaluj instalator dla wersji 64-bitowej (https://www.qimaging.com/support/software/). Następnie pobierz MicroManager dla wersji 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release), aby sterować kamerą w Pythonie.
    6. Aby sterować manipulatorami i stolikiem mikroskopu, należy zainstalować oprogramowanie sterujące dostarczone przez producenta.
      UWAGA: W ten sposób instalowany jest również sterownik niezbędny do sterowania manipulatorami. Pakiet instalacyjny jest zwykle dostarczany na płycie CD-ROM.
    7. Aby sterować dodatkową płytą DAQ, zainstaluj bibliotekę uniwersalną z płyty CD-ROM, dołączonej do zakupionej płyty DAQ.
  5. Skonfiguruj sprzęt dla Autopatcher IG.
    1. Podłącz stolik mikroskopu i sterowniki manipulatora do komputera za pomocą portów USB.
    2. Przypisz numery portów COM do jednostki 0: stolik mikroskopu, jednostki 1: lewy manipulator i jednostki 2: prawy manipulator, w tej kolejności, w pliku konfiguracyjnym "ports.csv" w folderze "configuration". Pozostałe parametry w pliku ports.csv (np. "SCI" i "1") pozostaw bez zmian.
      UWAGA: Informacje o numerze portu COM można znaleźć, uruchamiając oprogramowanie konfiguracyjne manipulatora dostarczone przez producenta. Przejdź do zakładki "ustawienia", wybierz "ustawienia" i stronę "Ruch", a następnie przeczytaj etykiety dla każdej zakładki u góry. Alternatywnie informacje te można znaleźć w Menedżerze urządzeń PC.
    3. Przypisz numery kanałów wejściowych analogowych na płytce DAQ dla czujnika ciśnienia i kanału krosowego 1 i 2 (odpowiadających jednostce 1 i 2). Wprowadź numer kanału w pliku "DAQchannels.csv" w folderze "configuration".
      UWAGA: Zaleca się otwieranie plików .csv za pomocą aplikacji Notatnik zamiast arkusza kalkulacyjnego, ponieważ może to zmienić informacje podczas zapisywania zmian.
  6. Uruchom Autopatcher IG.
    1. Włącz amplifier, kontroler mikroskopu i kontroler manipulatora. Upewnij się, że amplifier oprogramowanie jest uruchomione.
    2. Uruchom Autopatcher IG z Pythonem z terminala wiersza poleceń w następujący sposób: najpierw zmień katalog (polecenie "cd" dla najpopularniejszych terminali), w którym zainstalowany jest Autopatcher IG, wpisz "python Autopatcher_IG.pyw" w terminalu wiersza poleceń i naciśnij "Enter".
      UWAGA: Nie uruchamiaj oprogramowania sterującego manipulatorem przed uruchomieniem Autopatcher IG, ponieważ zajmie ono stolik mikroskopu i manipulator, powodując, że Autopatcher IG nie będzie w stanie znaleźć sprzętu. Oprogramowanie sterujące manipulatorem może być uruchomione po pełnym uruchomieniu Autopatcher IG, jeśli istnieją dodatkowe moduły do sterowania (np. grzałka liniowa).
  7. Skalibruj pipetę główną.
    1. Wyciągnij pipety z plastrami zgodnie z wcześniejszym opisem9. Napełnij wyciągniętą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i załaduj ją na stolik głowicy.
      UWAGA: Puste szklane pipety mają różny kontrast pod mikroskopem i mogą prowadzić do niedokładnej kalibracji.
    2. Przesuń końcówkę pipety w stronę pola widzenia mikroskopu i ustaw na niej ostrość. Jeśli klawiatura numeryczna jest używana do przesuwania manipulatorów i/lub stolika mikroskopu, zaktualizuj współrzędne, naciskając "z" na klawiaturze.
      UWAGA: Ta czynność nie jest konieczna, jeśli klawiatura (stolik mikroskopu: A/D - oś x, W/S - oś y, R/F - oś z; manipulatory: H/K - oś x, U/J - oś y, O/L - oś z, 1/2 - numer jednostki) jest używana do sterowania ruchem, ponieważ współrzędne będą aktualizowane w czasie rzeczywistym.
    3. Kliknij przycisk "Rozpocznij kalibrację" w głównym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) dla odpowiedniego urządzenia, do którego załadowana jest pipeta (Rysunek 2).
      UWAGA: Po zakończeniu kalibracji pojawi się wyskakujące okienko.
      UWAGA: Kalibracja zostanie przeprowadzona automatycznie, co zajmie około 3,5 min. Kliknięcie tego samego przycisku (przełączonego teraz na "anuluj kalibrację" po rozpoczęciu kalibracji) spowoduje przerwanie próby kalibracji.
    4. Zapisz kalibrację, klikając "zapisz kalibrację" na dole głównego GUI (zapisuje bieżącą kalibrację dla obu manipulatorów i można ją załadować w przyszłości).
      UWAGA: Pole widzenia przy małym (4 lub 10x) i wysokim (40x) powiększeniu musi być wyrównane, aby kalibracja wtórna działała prawidłowo. Aby zapoznać się z procedurami wyrównywania, należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanego układu optycznego.

2. Procedura automatycznego zaciskania łatki

  1. Przygotuj ostre wycinki mózgu, jak opisano wcześniej10.
  2. Przygotuj szklane pipety do zacisku krosowego.
  3. Umieść jeden plasterek mózgu na środku komory nagraniowej. Ustabilizuj plasterek za pomocą przytrzymania plasterka lub "harfy".
  4. Wykryj komórkę fluorescencyjną.
    1. Znajdź obszar zainteresowania pod obiektywem 4X. Przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb "kliknij, aby przesunąć" ("CTM") i kliknij środek obszaru zainteresowania. Alternatywnie, użyj klawiatury, aby przesunąć stolik mikroskopu (A/D - oś x, W/S - oś y, R/F - oś z).
    2. Przełącz się na obiektyw o dużym powiększeniu i wyreguluj ostrość, przesuwając mikroskop w osi z, używając R/F na klawiaturze.
      UWAGA: Zaleca się regulację poziomu kąpieli wodnej tak, aby płaszczyzna ogniskowej pod soczewkami o małym i dużym powiększeniu była taka sama lub podobna w osi z.
    3. Kliknij przycisk "Wykryj komórkę" w głównej kolumnie graficznego interfejsu użytkownika, "Jednostka 0". Jeśli dioda LED lub laserowe źródło światła konfiguracji nie może być sterowane sygnałem TTL, ręcznie włącz diodę LED/laser; po zakończeniu wykrywania komórki pojawi się wyskakujące okienko.
      1. W razie potrzeby wyłącz diodę LED/laser; lista współrzędnych komórek pojawi się w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycje pamięci". Usuń niechciane komórki z listy, klikając przycisk "X" obok współrzędnych.
      2. Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są oznaczone fluorescencyjnie, kliknij "Tryb myszy" w głównym graficznym interfejsie użytkownika. Kliknij komórkę, która Cię interesuje; na komórce pojawi się żółta kropka z liczbą, a współrzędne komórki pojawią się w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycje pamięci".
  5. Skalibruj pipetę wtórną.
    1. Napełnij 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Załaduj pipetę do uchwytu na pipetę przymocowanego do głowicy.
    2. Użyj obiektywu o małym powiększeniu. Umieść pipetę w polu widzenia i wyreguluj ostrość za pomocą klawiatury (H/K - oś x, U/J - oś y, O/L - oś z). Użyj "1" i "2", aby przełączać się między jednostką 1 a jednostką 2.
    3. Załaduj kalibrację podstawową, klikając "Załaduj kalibrację". Kliknij przycisk "Kalibracja wtórna" w głównym graficznym interfejsie użytkownika pod używanym urządzeniem. Na przykład, jeśli używana jest jednostka 2, kliknij przycisk "Kalibracja wtórna" w kolumnie "Jednostka 2". Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w wyskakującym okienku, aby przełączyć się na obiektyw o dużym powiększeniu.
  6. Łatanie komórki docelowej.
    1. Upewnij się, że oprogramowanie "MultiClamp" (tj. amplifier) jest uruchomione. Kliknij przycisk "Kontrola poprawki", aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika "Kontrolka poprawki"; otwarcie tego graficznego interfejsu użytkownika może potrwać do kilku minut.
    2. Użyj obiektywu z 40-krotnym powiększeniem, sprawdzając "40X" w głównej kolumnie "Jednostka 0" w graficznym interfejsie użytkownika. Kliknij przycisk "idź do" obok interesującej Cię komórki na liście współrzędnych w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycja pamięci"; Mikroskop przeniesie się do komórki.
    3. Kliknij przycisk CTM używanej jednostki w głównym graficznym interfejsie użytkownika, aby umożliwić ruch po kliknięciu myszą. Kliknij komórkę, która Cię interesuje; Końcówka pipety przesunie się do celi.
    4. Kliknij przycisk "Łatka" w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek".
      UWAGA: Rozpocznie się automatyczne łatanie, a ciśnienie i opór można monitorować w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola łatki".
      1. Użyj przycisku "Wybrano jednostkę 1", aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami.
        UWAGA: System zbliży się do komórki docelowej, zastosuje podciśnienie, dopasuje potencjał błony komórkowej i wykryje tworzenie się gigaseal w oparciu o szereg progów ciśnienia i oporu oraz logikę.
      2. Manipuluj automatycznym procesem w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek". Na przykład kliknij ponownie przycisk "Łatka", aby anulować wersję próbną poprawki, a następnie kliknij "Następny etap", aby przejść proces łatania do następnego kroku, niezależnie od progu.
        UWAGA: Wyskakujące okienko powiadomi użytkownika, gdy utworzy się gigaseal, a także zostanie przedstawiona opcja zastosowania zap wraz z dużym podciśnieniem.
    5. Wybierz "Tak", aby włamać się z połączonym zap-em i ssaniem. Alternatywnie wybierz "Nie", aby włamać się tylko z ssaniem.
      UWAGA: Po pomyślnym zakończeniu łatania całej komórki, wyskakujące okienko przypomni użytkownikowi o zapisaniu dziennika poprawek eksperymentu.
    6. Zapisz dziennik poprawek eksperymentu.
      UWAGA: Jeśli próba instalowania poprawek nie powiedzie się, użytkownik zostanie o tym powiadomiony w wyskakującym okienku, a proces łatania zostanie zresetowany.
    7. Wróć do kroku 2.4 i powtórz kroki z inną komórką.
  7. Uściślij progi poprawek (opcjonalnie).
    UWAGA: Progi początkowego zakresu oporu pipety, nadciśnienia i podciśnienia, oporu gigaseal itp. może być modyfikowany z pliku konfiguracyjnego.
    1. Otwórz plik "PatchControlConfiguration.csv" w folderze "Konfiguracja" w miejscu docelowym, w którym zainstalowany jest system. Zmień liczby odpowiadające każdej wartości progowej. Nie zmieniaj nazw wartości; Spowoduje to nierozpoznawalne wpisy w systemie.
    2. Zaimplementuj nowe wartości progowe natychmiast, naciskając "Ctrl+L" bez ponownego uruchamiania programu; ponowne uruchomienie programu zaimplementuje najnowszą wartość progową z pliku.

3. Wykonywanie nagrań

UWAGA: Tryb w sterowanym komputerowo wzmacniaczu mikroelektrod zostanie automatycznie ustawiony na Zacisk prądowy ("IC") przez oprogramowanie autopatchera po osiągnięciu pomyślnego łatania. Nagrania z użyciem clampów krosowych całych komórek można wykonać za pomocą wybranego oprogramowania do nagrywania (ten system nie zawiera funkcji nagrywania). Jeśli zidentyfikowano wiele komórek docelowych, po zakończeniu nagrywania wróć do kroku 2.4 i spróbuj użyć innej komórki.

  1. Przeprowadzaj eksperymenty z automatycznym miejscowym stosowaniem leków za pomocą picospritzera (opcjonalnie).
    UWAGA: W tym przypadku eksperyment z lokalną aplikacją leku jest używany jako przykład w celu opisania, jak używać dodatkowej funkcji "Sekwencja poleceń" do sterowania zewnętrznym sprzętem za pomocą sygnałów TTL.
    1. Podłącz port A, kanał 0 i masę na dodatkowej płycie DAQ do wejścia wyzwalacza startowego w digitizerze za pomocą odizolowanego BNC (zgodnie z opisem w kroku 1.2.3). Podłącz jeden cyfrowy kanał wyjściowy na digitizerze do zewnętrznego spustu na pikospritzerze.
    2. Przygotuj picospritzer zgodnie z instrukcją obsługi. Podłącz wylot powietrza picospritzer do uchwytu na pipetę do zaciągania się lekiem podłączonego do mikromanipulatora.
    3. Załaduj pipetę wypełnioną wybranym lekiem. Przymocuj go do uchwytu na pipety. Skalibruj pipetę zgodnie z opisem w kroku 1.7.
    4. Po załataniu komórki zgodnie z opisem w kroku 2.6 wybierz żądaną lokalizację do podania leku, klikając myszą w graficznym interfejsie użytkownika widoku kamery w "trybie myszy" (przełączonym z głównego graficznego interfejsu użytkownika). Alternatywnie, użyj graficznego interfejsu użytkownika "Siatka", aby zaprojektować siatkę, z każdym pikselem w siatce jako jedną z lokalizacji docelowych.
      UWAGA: Siatką można manipulować w graficznym interfejsie użytkownika widoku kamery, przeciągając ją myszą.
    5. W graficznym interfejsie użytkownika "Sekwencja poleceń" wybierz manipulator, na którym zamontowana jest pipeta do leku. Kliknij "załaduj punkty myszy" lub "załaduj punkty siatki", aby zaimportować wszystkie współrzędne do dostarczania leku.
      1. Kliknij każdy wpis współrzędnych, aby edytować określony sygnał TTL polecenia w prawej kolumnie. W pierwszym wpisie polecenia kliknij cyfrę po prawej stronie, aby zmienić ją z "0" na "1", wysyłając sygnał +5 V TTL. Ustaw czas (T) na żądany czas trwania sygnału TTL w ms.
      2. W drugim wpisie polecenia ustaw wszystkie cyfry na "0" i ustaw T na czas trwania nagrania próby. Edytuj polecenia dla wszystkich wpisów współrzędnych. Dodaj wpisy poleceń, klikając "+", jeśli potrzebnych jest wiele sygnałów TTL.
        UWAGA: 8-cyfrowe bity reprezentują kanały 0-7 portu A na wtórnym DAQ (porty 1 - 3 są zajęte przez pompę i dwa zawory) można w razie potrzeby przełączyć.
    6. Utwórz protokół nagrywania w module akwizycji danych, tak aby rozpoczęcie przebiegu było wyzwalane przez zewnętrzny wyzwalacz startowy. Edytuj protokół, aby dostarczyć lek w żądanym czasie.
    7. W graficznym interfejsie użytkownika "Sekwencja poleceń" kliknij "Uruchom" po lewej stronie, aby uruchomić wszystkie współrzędne. Możesz też kliknąć "Uruchom" po prawej stronie, aby uruchomić tylko wybraną sekwencję.
      UWAGA: Pipeta przesunie się do każdej współrzędnej i wykona sygnał TTL zgodnie z definicją, aby rozpocząć przemiatanie nagrywania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz system został przetestowany pod kątem zdolności do łatania komórek w ostrych wycinkach mózgu, indukowanych przez myszy pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) różnicujących się w neurony oraz komórek HEK 293 sztucznie wyrażających interesujące kanały. Rysunek 3 przedstawia eksperyment z wykorzystaniem transgenicznych myszy Thy1-ChR2-YFP (B6. Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J) celowane w znakowane fluorescencyjnie neurony piramidowe warstwy 5 w korze ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy metodę automatycznych nagrań metodą patch clamp in vitro. Kluczowe kroki w tym procesie podsumowano w następujący sposób. Po pierwsze, komputerowe systemy wizyjne są wykorzystywane do automatycznego rozpoznawania końcówki pipety na podstawie serii obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopu. Informacje te są następnie wykorzystywane do obliczenia funkcji transformacji współrzędnych między mikroskopem a układami współrzędnych manipulatora. Widzenie komputerowe służy do automatycznego wykrywani...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nietymczasowe zgłoszenie patentowe "SYSTEMY I METODY AUTOMATYCZNEJ ELEKTROFIZJOLOGII PATCH-CLAMP STEROWANEJ OBRAZEM IN VITRO", numer seryjny USA: 15/353,719, zostało złożone 16 listopada 2016 r., Nr ref.: PRF 67270-02.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Fundacji Whitehall. Chcielibyśmy podziękować Samuelowi T. Kissingerowi za cenne uwagi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kamera CCDQImagingRolera Bolt
Electrophysiology rigScientificaSliceScope Pro 2000Zawiera mikroskop i manipulatory. Dostarczone przez producenta oprogramowanie sterujące manipulatorem pokazane w tym manuskrypcie to " Linlab2".
WzmacniaczUrządzenia molekularneMultiClamp 700Bsterowany komputerowo wzmacniacz mikroelektrod
DigitizerMolecular DevicesAxon Digidata 1550
Cool LEDpE-100długości fali 488 nm
Płytka akwizycji danychPomiar ObliczeniaUSB1208-FSWtórny DAQ.
Zobacz instrukcję pod adresem : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Zawory elektromagnetyczneThe Lee Co.
Pompa powietrzaPrzemysł wirtualnyVMP1625MX-12-90-CH
Czujnik ciśnienia powietrzaPółprzewodniki FreescaleMPXV7025G
Docisk SliceWarner instruments64-1415 (SHD-40/2)Zestaw kotew Slice, płaski do komory RC-40, 2.0 mm, 19.7 mm
PythonAnacondawersja 2.7 (32-bitowa dla systemu Windows)https://www.continuum.io/downloads
Zaciski śruboweSparkfunPRT - 08084Zaciski śrubowe 3,5 mm raster (2-pin)
(2-pin)N-kanałowy
MOSFET 60 V 30 ASparkfunCOM - 10213
Gniazda DIP Końcówka lutowana - 8-pinSparkfunPRT-07937
LED - Basic Czerwona 5 mmSparkfunCOM-09590
LED - Podstawowy zielony 5mmSparkfunCOM-09592
Gniazdo/złącze zasilania beczki DC (SMD)SparkfunPRT-12748
Zasilacz ścienny - 12 V DC 600 mASparkfunTOL-09442
Przewód połączeniowy - zestaw (Solid Core, 22 AWG)SparkfunPRT-11367
Blokada męska x żeńska x żeńska x żeńskaARK-PLASRCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Elastyczne rurkiFisher scientific14-171-129Średnica zewnętrzna: 1/8 cala
Średnica wewnętrzna: 1/16 cala.
koncentryczny BNC męski na BNC męskiBelkin ComponentsF3K101-06-E
Rezystor 560 Ohm (tolerancja 5%)Radioshack2711116
PicospritzerZawór ogólnyPicospritzer II
Źródło światła LED o LHDA0531115H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  3. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  4. Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
  5. Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
  6. Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
  7. Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630(2013).
  8. Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
  10. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
  11. Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
  12. Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Patch ClampImage Guided Patch ClampWhole Cell Patch ClampAcute Brain SlicesComputer Vision AlgorithmFluorescent Cell DetectionMicromanipulator ControlInternal Pipette PressureElectrical Resistance MonitoringGigaseal Formation

Related Articles