Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

Summary

Prezentujemy protokół oparty na filtracji do izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy, w którym usunęliśmy potrzebę ultrawirowania, dzięki czemu jest to łatwe do zastosowania. Pokazujemy, że chromatyna przygotowana z jąder nadaje się do badań immunoprecypitacji chromatyny i prawdopodobnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny.

Abstract

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to skuteczna metoda określania wiązania białek z DNA chromatyny. Mięśnie szkieletowe bogate w błonnik stanowiły jednak wyzwanie dla ChIP ze względu na trudności techniczne w izolowaniu jąder wysokiej jakości przy minimalnym zanieczyszczeniu miofibryli. Poprzednie protokoły próbowały oczyścić jądra przed sieciowaniem, co wiązało się z ryzykiem zmienionej interakcji DNA-białko podczas przedłużonego procesu przygotowania jąder. W obecnym protokole najpierw usieciowaliśmy tkankę mięśni szkieletowych pobraną od myszy, a następnie tkanki zostały zmielone i poddane sonikacji. Ponieważ stwierdziliśmy, że ultrawirowanie nie było w stanie oddzielić jąder od miofibryli za pomocą usieciowanej tkanki mięśniowej, opracowaliśmy procedurę filtracji sekwencyjnej w celu uzyskania wysokiej jakości jąder pozbawionych znacznego zanieczyszczenia miofibrylami. Następnie przygotowaliśmy chromatynę za pomocą ultradźwięków, a testy ChIP z przeciwciałem anty-BMAL1 ujawniły silny okołodobowy wzór wiązania BMAL1 z docelowymi promotorami genów. Ten protokół filtracji stanowi łatwą do zastosowania metodę izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanej tkanki mięśni szkieletowych, umożliwiając spójne przetwarzanie próbek do badań okołodobowych i innych wrażliwych na czas badań. W połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS), nasza metoda może być stosowana w różnych badaniach mechanistycznych i genomicznych koncentrujących się na funkcji mięśni szkieletowych.

Introduction

Mięśnie szkieletowe odgrywają ważną rolę w fizjologii i zachowaniu. Wielojądrowe włókno mięśniowe składa się z miofibryli, w których aktyna i miozyna tworzą jednostki funkcjonalne zwane sarkomerami, które generują siłę skurczu. Mięśnie szkieletowe są również największym narządem metabolicznym w organizmie, odpowiadającym za >80% poposiłkowego spożycia glukozy i regulującym odpowiedź insulinową oraz homeostazę metaboliczną^1,2. Fizjologia i metabolizm mięśni są ściśle regulowane przez zegar okołodobowy, wewnętrzny zegar biologiczny^3,4,

Protocol

Opieka nad zwierzętami została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), a procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez University of Texas Health Science Center w Houston.

1. Izolacja jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych

1. Zważyć i zmielić mięśnie szkieletowe kończyn tylnych, wyizolowane od około 20-tygodniowych samców myszy C57BL/6, w lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), jak opisano szczegółowo wcześniej²².
   UWAGA: Z jednej myszy zwykle pozyskujemy 1,0 - 1,5 g mięś....

Results

Tutaj przeprowadziliśmy sieciowanie formaldehydu natychmiast po pobraniu tkanki, aby zachować interakcję DNA-białko w czasie rzeczywistym. Odkryliśmy jednak, że sacharoza lub gradient koloidalny, powszechnie stosowany do izolacji jąder^23,24, nie był skuteczny w oddzielaniu jąder od miofibryli (dane nie pokazane). Powodem może być to, że sieciowanie nadało podobny ciężar jądrom i miofibrylom. W związku z tym opracowaliśmy proces fi.......

Discussion

W tym miejscu opisujemy solidną metodę, w której do wyizolowania jąder wysokiej jakości wykorzystano usieciowane tkanki mięśni szkieletowych. Przeprowadzono sekwencyjną filtrację, aby skutecznie oddzielić jądra od gruzu, a ultradźwiękowa energia akustyczna z przetwornika w kształcie talerza ścięła chromatynę do analizy ChIP. Wyniki wykazały specyficzne dla czasu okołodobowego wiązanie BMAL1 z docelowymi promotorami.

ChIP można wykorzystać do uchwycenia w czasie rzeczywistym zajętości białek w .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Formaldehyde roztwór	Sigma Aldrich	F8775
Glicyna	Fisher Scientific	BP381-5
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)	Fisher Scientific	15250061
RNaza A	Sigma Aldrich	10109142001
Proteaza K	Sigma Aldrich	3115887001
Kurczak Przeciwciało			anty-BMAL1Generowany u kurczaka (Cocalico Biologicals) przeciwko antygenowi aa 318 - 579, a IgY został oczyszczony powinowactwem przy użyciu tego samego antygenu.
Żywica strącająca kurczaka IgY	GenScript	L00405
Equipment
KINEMATICA  Homogenizator stołowy Polytron PT2100	Fisher Scientific	08-451-178
15 mL Młynek do tkanek	Whearton	357544
Falcon Sitka do komórek 100 i mikro; m	Fisher Scientific	08-771-19
Sitka do komórek Falcon 70 i mikro; m	Fisher Scientific	08-771-1
Sitka do komórek Falcon 40 i mikro; m	Fisher Scientific	08-771-2
pluriSitko 30 & mikro; m	PluriSelect	43-50030-03
filtr siatkowy pluriStrainer 20 & mikro; m	PluriSelect	43-50020-03
filtr siatkowy pluriStrainer 10 µ m	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 Skoncentrowany ultrasonograf	Covaris	Model S2
Labquake	Kamera mikroskopowa CCD Thermo Scientific	C415110
	Leica Microsystems	DFC3000 G
zestaw odczynników
DNA Zestaw do ekstrakcji	Thermo Scientific	K0691
Buffers
Wszystkie składniki bufora są opisane w protokole. Każdy komponent został zakupiony w firmie Sigma Aldrich