Artykuł metodologiczny

Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

DOI:

10.3791/56013

⸱

6 lipca 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół oparty na filtracji do izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy, w którym usunęliśmy potrzebę ultrawirowania, dzięki czemu jest to łatwe do zastosowania. Pokazujemy, że chromatyna przygotowana z jąder nadaje się do badań immunoprecypitacji chromatyny i prawdopodobnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to skuteczna metoda określania wiązania białek z DNA chromatyny. Mięśnie szkieletowe bogate w błonnik stanowiły jednak wyzwanie dla ChIP ze względu na trudności techniczne w izolowaniu jąder wysokiej jakości przy minimalnym zanieczyszczeniu miofibryli. Poprzednie protokoły próbowały oczyścić jądra przed sieciowaniem, co wiązało się z ryzykiem zmienionej interakcji DNA-białko podczas przedłużonego procesu przygotowania jąder. W obecnym protokole najpierw usieciowaliśmy tkankę mięśni szkieletowych pobraną od myszy, a następnie tkanki zostały zmielone i poddane sonikacji. Ponieważ stwierdziliśmy, że ultrawirowanie nie było w stanie oddzielić jąder od miofibryli za pomocą usieciowanej tkanki mięśniowej, opracowaliśmy procedurę filtracji sekwencyjnej w celu uzyskania wysokiej jakości jąder pozbawionych znacznego zanieczyszczenia miofibrylami. Następnie przygotowaliśmy chromatynę za pomocą ultradźwięków, a testy ChIP z przeciwciałem anty-BMAL1 ujawniły silny okołodobowy wzór wiązania BMAL1 z docelowymi promotorami genów. Ten protokół filtracji stanowi łatwą do zastosowania metodę izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanej tkanki mięśni szkieletowych, umożliwiając spójne przetwarzanie próbek do badań okołodobowych i innych wrażliwych na czas badań. W połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS), nasza metoda może być stosowana w różnych badaniach mechanistycznych i genomicznych koncentrujących się na funkcji mięśni szkieletowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mięśnie szkieletowe odgrywają ważną rolę w fizjologii i zachowaniu. Wielojądrowe włókno mięśniowe składa się z miofibryli, w których aktyna i miozyna tworzą jednostki funkcjonalne zwane sarkomerami, które generują siłę skurczu. Mięśnie szkieletowe są również największym narządem metabolicznym w organizmie, odpowiadającym za >80% poposiłkowego spożycia glukozy i regulującym odpowiedź insulinową oraz homeostazę metaboliczną1,2. Fizjologia i metabolizm mięśni są ściśle regulowane przez zegar okołodobowy, wewnętrzny zegar biologiczny3,4,5,6. Na przykład, specyficzna dla mięśni szkieletowych delecja Bmal1, jednego z podstawowych składników zegara okołodobowego, spowodowała insulinooporność i zmniejszony wychwyt glukozy w mięśniach szkieletowych, a u zwierząt stwierdzono, że u zwierząt rozwija się cukrzyca typu 27. Ponadto mięśnie szkieletowe są coraz bardziej doceniane jako narząd dokrewny8, wydzielający miokiny w celu regulacji ogólnoustrojowego metabolizmu i fizjologii. Aby w pełni zrozumieć te funkcje regulacyjne w mięśniach szkieletowych, wymagane są badania mechanistyczne.

ChIP to potężne podejście do wyznaczania rekrutacji promotorów białek wiążących DNA. ChIP został początkowo opracowany w celu identyfikacji organizacji nukleosomów na chromatynie DNA9,10. Od tego czasu opisano różne metody sieciowania białek i chromatyny DNA przy użyciu formaldehydu, siarczanu dimetylu lub promieniowania ultrafioletowego (UV)11,12. Najczęściej stosowanym sposobem sieciowania formaldehydu jest zachowujące strukturę chromatyny i interakcje DNA-białko9,13,14. Usieciowana chromatyna jest rozdrabniana przez sonikację i immunoprecypitowana przeciwciałem przeciwko konkretnemu białku wiążącemu DNA będącemu przedmiotem zainteresowania15,16. W ostatnich latach opracowano sekwencjonowanie ChIP (ChIP-seq), metodę łączącą ChIP z NGS, do badania wiązania czynnika transkrypcyjnego w całym genomie17, a w niektórych przypadkach do monitorowania dynamicznych zmian w czasie 18,19,20. Na przykład, okołodobowe badania ChIP-seq ujawniły wysoce zaaranżowaną sekwencję genomowego wiązania składników zegara okołodobowego i markerów histonowych, która napędza czasowo precyzyjną ekspresję genów w całym ~ 24-godzinnym cyklu okołodobowym18.

Większość dostępnych protokołów ChIP jest przeznaczona dla tkanek miękkich (np. wątroba, mózg, itp.), a bardzo niewiele zostało opublikowanych dla tkanek twardych, w tym mięśni szkieletowych. Homogenizacja bogatych w błonnik mięśni szkieletowych i wyizolowanie wysokiej jakości jąder jest technicznie trudne21, szczególnie w przypadku eksperymentów ChIP, które wymagają sieciowania. W niedawnym badaniu ChIP mięśni22, komórki satelitarne oddzielono od włókien mięśniowych, a jądra przygotowano z obu typów komórek poprzez długotrwałą procedurę obejmującą trawienie tkanek. Cały proces trwał około trzech godzin, zanim przeprowadzono sieciowanie formaldehydu na izolowanych jądrach. Chociaż procedura ta pozwoliła uniknąć sieciowania włókien mięśniowych, co sprawia, że tkanka mięśniowa jest jeszcze bardziej oporna na wydajną homogenizację i była w stanie wytworzyć wysokiej jakości jądra, znaczne opóźnienie od pobrania tkanki do sieciowania jąder wiąże się z ryzykiem zmienionej interakcji DNA-białko. W przeciwieństwie do tego, większość badań wykonywała sieciowanie natychmiast po eksperymentalnym leczeniu lub pobraniu tkanek w celu zachowania wiązania DNA-białko w czasie rzeczywistym12. Drugą wadą izolacji jąder przed sieciowaniem jest to, że wyklucza ona zastosowania wrażliwe na czas, takie jak pobieranie próbek w rytmie okołodobowym, które zwykle odbywa się w odstępach 3-4 godzin. Bez sieciowania jąder izolacja musi przebiegać natychmiast po rozbiorze, podczas gdy próbki usieciowane mogą być przetwarzane razem po zakończeniu całego przebiegu czasowego, zapewniając w ten sposób większą spójność eksperymentalną.

Inne protokoły izolacji jąder z nieusieciowanych mięśni szkieletowych również zostały zgłoszone. W dwóch badaniach opisano zastosowanie ultrawirowania gradientowego w celu oddzielenia jąder od pozostałych miofibryli i resztek komórkowych23,24. Podczas gdy ultrawirowanie sacharozy lub gradientu koloidalnego jest skuteczne w przypadku nieusieciowanych tkanek mięśniowych, nasze eksperymenty wykazały, że po usieciowaniu ultrawirowanie gradientowe nie oddzieliło jąder od szczątków komórkowych na gradiencie.

Dlatego opracowaliśmy procedurę izolowania jąder wysokiej jakości za pomocą usieciowanych tkanek mięśni szkieletowych myszy. Zamiast ultrawirowania gradientowego opracowaliśmy metodę filtracji szeregowej, aby skutecznie oddzielać jądra od zanieczyszczeń. Po ultradźwiękach próbki chromatyny zostały z powodzeniem zastosowane do badań ChIP, które wykazały okołodobowy wzorzec wiązania białka BMAL1 z docelowymi promotorami. Nasza metoda może mieć szerokie zastosowanie w różnych badaniach mechanistycznych tkanek mięśniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), a procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez University of Texas Health Science Center w Houston.

1. Izolacja jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych

  1. Zważyć i zmielić mięśnie szkieletowe kończyn tylnych, wyizolowane od około 20-tygodniowych samców myszy C57BL/6, w lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), jak opisano szczegółowo wcześniej22.
    UWAGA: Z jednej myszy zwykle pozyskujemy 1,0 - 1,5 g mięśni szkieletowych.
    1. Umieść zmieloną tkankę mięśni szkieletowych w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml PBS na lodzie.
  2. Wirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
  3. Ostrożnie usunąć supernatant PBS przez aspirację.
  4. Oszacuj objętość osadu w każdej probówce o pojemności 50 ml za pomocą probówek referencyjnych z 1, 2, 3 i 4 ml wody.
  5. Dodać 7 objętości lodowatego 1% formaldehydu do PBS i homogenizować próbki na lodzie za pomocą homogenizatora tkankowego z sondą (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Opcjonalnie: Procedurę homogenizacji można przeprowadzić w chłodni.
  6. Próbkę należy usieciować przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  7. Ugasić reakcję sieciowania przez dodanie 1 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.
  9. Przepłukać 10 ml lodowatego buforu bazowego (10 mM HEPES-KOH o pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) zawierającego świeżo dodane inhibitory proteazy (0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 10 μg/ml leupeptyny). Odwirować przy 3 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację.
  10. Zawiesić osad w 6 ml buforu do lizy (10 mM HEPES-KOH o pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) zawierającym świeżo dodane inhibitory proteazy (0,2 mM PMSF i 10 μg/ml leupeptyny).
  11. Przenieść próbkę do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odbić każdą próbkę homogenizować na lodzie 15 powolnymi pociągnięciami za pomocą luźnego tłuczka, a następnie 15 uderzeń ciasnym tłuczkiem, aby uwolnić jądra.
  12. Przefiltrować homogenat (6 ml) przez sitko do komórek (wielkość porów: 100 μm) i przepłukać 4 ml buforu do lizy. Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić w 5 ml lodowatego buforu zasadowego i odbić 10 razy ciasnym tłuczkiem w celu uwolnienia jąder.
    1. Usunąć podwielokrotność 20 μl do pomiaru stężenia DNA za pomocą spektrofotometru (OD260/OD280) i obserwacji mikroskopowej z błękitem trypanowym, jeśli to konieczne (patrz poniżej) (patrz poniżej) (Rysunek 1A).
  13. Przefiltrować zawiesinę przez sitko komórkowe (wielkość porów: 70 μm), przepłukać probówkę i ponownie przefiltrować za pomocą 2 ml buforu zasadowego, jak powyżej.
  14. Powtórzyć filtrację jak w kroku 1.13 z sitkami do komórek o stopniowo zmniejszanej wielkości porów (40 μm, 30 μm, 20 μm i 10 μm).
    UWAGA: W sumie w krokach 1.12-1.14 zastosowano sitka o 6 rozmiarach porów.
  15. Wirować w temperaturze 1 000 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze zasadowym o pojemności 500 μl.
  16. Zmierz stężenie DNA jak wyżej.
    UWAGA: Około 200 μg nukleinowego DNA uzyskano z połączenia obu tylnych kończyn od jednego zwierzęcia. Opcjonalnie zachowaj 20 μl do obserwacji mikroskopowej z barwieniem błękitem trypanowym (stężenie podstawowe 0,4%, rozcieńczenie 1:5); jądra będą barwione na niebiesko (Rysunek 1B).
  17. Odwirować w temperaturze 1 000 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić supernatant. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.

2. Sonikacja

  1. Próbki należy rozmrozić w 500 μl buforu do lizy SDS i ponownie zawiesić za pomocą delikatnego pipetowania.
  2. Przenieść zawiesinę DNA jąder do szklanej fiolki z lodem.
  3. Uruchom sonikację ze skoncentrowanymi impulsami ultradźwiękowej energii akustycznej z przetwornika w kształcie talerza. Szczegółowe informacje na temat wyposażenia znajdują się w tabeli materiałów. Użyj następującego ustawienia: liczba cykli na serię: 200; intensywność: 5; cykl pracy: 20; temperatura 4 - 6 °C; 30 s wł.
    UWAGA: Przykład oceny skuteczności sonikacji jest pokazany na Rysunek 2.
  4. Przenieś sonikowaną chromatynę do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. Przenieść 50 μl próbek poddanych sonikacji (~ 7 - 10 μg/próbkę mięśniową) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu odwrotnego sieciowania przez noc w temperaturze 65 °C. Pozostałe próbki zamrozić w temperaturze -80 °C.

3. Ocena sonikacji i kwantyfikacji

  1. Dodać 1,0 μl RNazy A (500 U/ml RNazy A: 20 000 U/ml RNazy T1) do zapisanych 50 μl sonikowanych próbek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać 8 μl proteazy K (10 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 55 °C.
  3. Zbierz DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA.
    1. Dodać 5 objętości buforu wiążącego, nałożyć go na wirującą kolumnę i odwirować przy 4 000 x g, 10 min.
    2. Nałożyć przepust na tę samą kolumnę i ponownie odwirować.
    3. Przemyć buforem myjącym dwa razy po 13 000 x g, 1 min.
    4. Ponownie odwirować przy 13 000 x g, 1 minutę w celu wysuszenia kolumny.
    5. Dodać 50 μlH2Oi odwirować przy 13 000 x g, 1 minutę w celu wymycia DNA.
    6. Nałożyć przepust na tę samą kolumnę i ponownie odwirować.
  4. Określić ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometru (OD260/OD280). Uruchom próbki na żelach o stężeniu 0,8%, aby ocenić wielkość i ilość (1 μg) produktów poddanych sonikacji (Rysunek 2).
    UWAGA: Średnia wydajność chromatyny wynosi około ~ 20%.

4. ChIP

  1. Uprzednio zapisaną chromatynę rozmrozić w temperaturze -80 °C i podwielokrotnić chromatynę do ilości ~ 100 - 120 μg na probówkę. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 buforem do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (20mM Tris-HCl (pH 7,4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x koktajl inhibitorów proteazy (), 0,1% Na-deoksycholan (w/v), 1% Triton X-100).
    1. Jeśli w każdej grupie jest wiele próbek, połącz równe ilości DNA chromatyny do końcowej ilości ~ 100 - 120 μg / próbkę. Zaoszczędź 10% jako dane wejściowe.
  2. Dodać 40 μl (50% v/v zawiesiny w buforze RIPA) wstępnie zablokowanego (~ 2 h, 4 °C) białka A/G agarozy (przeciwciało inne niż kurze) lub kulek IgY (przeciwciało kurze) i inkubować na rotatorze przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
  3. Odwirować przy 1 000 x g, 10 minut i ostrożnie przenieść supernatant do nowych probówek.
  4. Dodaj przeciwciała o stężeniu 1 μg przeciwciała na ~ 25 - 100 μg DNA chromatyny.
  5. Obracać delikatnie w temperaturze 4 °C przez noc z prędkością około 15 obr./min.
  6. Dodać 10 μl wstępnie zablokowanego (~2 h, 4 °C) białka A/G agarozy (przeciwciało inne niż kurze) lub kulek IgY (przeciwciało kurze) i obracać w chłodni przez 2 godziny.
  7. Umyj koraliki w następujący sposób. Przemyć 1 ml buforu RIPA przez 3 minuty dwukrotnie, przemyć 1 ml buforu o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) przez 3 minuty dwa razy, przemyć 1 ml buforu LiCl (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoksycholanu, 0,5% NP40) przez 3 minuty dwukrotnie.
    1. Przemyć 1 ml buforu Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) przez 3 minuty raz. Następnie eluuj DNA za pomocą buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA i 0,5% SDS).
  8. Odwirować przy 1 000 g przez 1 minutę i ostrożnie usunąć supernatant.
  9. Zawiesić kulkę z 50 μl buforu elucyjnego.
  10. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C.
  11. Wirować przy 12 000 g przez 5 min.
  12. Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać kolejne 50 μl i ponownie odwirować przy 12 000 g przez 5 minut. Ostateczna objętość elucji wyniesie 100 μl.
  13. Odwrotne sieciowanie i elucja DNA.
    1. Inkubować eluowaną chromatynę przez noc w temperaturze 65 °C.
    2. Dodać 1,0 μl RNazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 8 μl proteazy K (10 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 55 °C.
    4. Pobrać DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR z objętością elucji wynoszącą 50 μl zgodnie z protokołem producenta.
  14. Analizuj profile za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej25,26.
    UWAGA: Sekwencje starterów są wymienione w Rysunek 3 Legenda. Dane są przedstawione jako średnia ± SEM (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przeprowadziliśmy sieciowanie formaldehydu natychmiast po pobraniu tkanki, aby zachować interakcję DNA-białko w czasie rzeczywistym. Odkryliśmy jednak, że sacharoza lub gradient koloidalny, powszechnie stosowany do izolacji jąder23,24, nie był skuteczny w oddzielaniu jąder od miofibryli (dane nie pokazane). Powodem może być to, że sieciowanie nadało podobny ciężar jądrom i miofibrylom. W związku z tym opracowaliśmy proces fi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy solidną metodę, w której do wyizolowania jąder wysokiej jakości wykorzystano usieciowane tkanki mięśni szkieletowych. Przeprowadzono sekwencyjną filtrację, aby skutecznie oddzielić jądra od gruzu, a ultradźwiękowa energia akustyczna z przetwornika w kształcie talerza ścięła chromatynę do analizy ChIP. Wyniki wykazały specyficzne dla czasu okołodobowego wiązanie BMAL1 z docelowymi promotorami.

ChIP można wykorzystać do uchwycenia w czasie rzeczywistym zajętości białek w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Karyn Esser, Nobuya Koike i Noheon Park za pomocne rady. Praca ta była częściowo wspierana przez NIH/NIGMS (R01GM114424) dla S.-H.Y. oraz Fundację Roberta A. Welcha (AU-1731) i NIH/NIA (R01AG045828) dla Z.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materials
Formaldehyde roztwórSigma AldrichF8775 
GlicynaFisher ScientificBP381-5
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Fisher Scientific15250061
RNaza ASigma Aldrich10109142001
Proteaza KSigma Aldrich3115887001
Kurczak Przeciwciałoanty-BMAL1Generowany u kurczaka (Cocalico Biologicals) przeciwko antygenowi aa 318 - 579, a IgY został oczyszczony powinowactwem przy użyciu tego samego antygenu.
Żywica strącająca kurczaka IgYGenScriptL00405
Equipment
KINEMATICA  Homogenizator stołowy Polytron PT2100Fisher Scientific08-451-178
15 mL Młynek do tkanekWhearton357544
Falcon Sitka do komórek 100 i mikro; mFisher Scientific08-771-19
Sitka do komórek Falcon 70 i mikro; mFisher Scientific08-771-1
Sitka do komórek Falcon 40 i mikro; mFisher Scientific08-771-2
pluriSitko 30 & mikro; mPluriSelect43-50030-03
filtr siatkowy pluriStrainer 20 & mikro; mPluriSelect43-50020-03
filtr siatkowy pluriStrainer 10 µ mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 Skoncentrowany ultrasonografCovarisModel S2
Labquake Kamera mikroskopowa CCD Thermo ScientificC415110
  Leica MicrosystemsDFC3000 G
zestaw odczynników
DNA Zestaw do ekstrakcjiThermo ScientificK0691
Buffers
Wszystkie składniki bufora są opisane w protokole. Każdy komponent został zakupiony w firmie Sigma Aldrich

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
  2. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
  3. Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
  4. Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
  5. Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
  6. Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35(2015).
  7. Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12(2016).
  8. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
  9. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  10. Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
  11. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  12. Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
  13. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
  14. Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
  15. Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
  16. Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444(2013).
  17. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  18. Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
  19. Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
  20. Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
  21. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
  22. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
  23. Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
  24. Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
  25. Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801(2015).
  26. Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23(2015).
  27. Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
  28. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  29. Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
  30. Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
  31. Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
  32. Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nuclei IsolationChromatin ImmunoprecipitationSkeletal MuscleCross linked TissueFiltration MethodChromatin PreparationSonication SettingsQPCR AnalysisCircadian BindingNGS Application

Powiązane artykuły