Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56016

⸱

15 sierpnia 2017

 ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

W tym artykule

Podsumowanie

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Streszczenie

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny zwierzęcy model terapii elektrowstrząsowej, najskuteczniejszej metody leczenia ciężkiej depresji. ECS indukuje uogólnione napady toniczno-kloniczne z niską śmiertelnością i śmiercią neuronów i jest szeroko stosowanym modelem do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych. W tym miejscu opisujemy metodę indukcji ECS, w której krótki prąd o natężeniu 55 mA jest dostarczany przez 0,5 s do samców szczurów o wadze 200 - 250 g za pomocą elektrod z klipsem uszy. Taka obustronna stymulacja powodowała napady kloniczne w stadium 4 - 5, które trwały około 10 s. Po ustaniu ostrego lub przewlekłego ECS większość szczurów wyzdrowiała, stając się behawioralnie nie do odróżnienia od szczurów pozorowanych "bez napadów". Ponieważ ECS globalnie zwiększa aktywność mózgu, został również wykorzystany do badania zależnych od aktywności zmian białek synaptycznych i ich wpływu na siłę synaps przy użyciu wielu metod. W szczególności subkomórkowe frakcjonowanie gęstości postsynaptycznej (PSD) w połączeniu z Western blotting pozwala na ilościowe określenie obfitości białek synaptycznych w tej wyspecjalizowanej strukturze synaptycznej. W przeciwieństwie do poprzedniej metody frakcjonowania, która wymaga dużej ilości mózgów gryzoni, opisujemy tutaj metodę frakcjonowania na małą skalę w celu wyizolowania PSD z hipokampa pojedynczego szczura, bez wirowania w gradiencie sacharozy. Za pomocą tej metody pokazujemy, że wyizolowana frakcja PSD zawiera postsynaptyczne białka błonowe, w tym PSD95, GluN2B i GluA2. Marker presynaptyczny synaptofizyna i rozpuszczalne białko cytoplazmatyczne α-tubulina zostały wykluczone z frakcji PSD, wykazując udaną izolację PSD. Co więcej, przewlekły ECS zmniejszył ekspresję GluN2B w PSD, co wskazuje, że nasza metoda frakcjonowania PSD na małą skalę może być zastosowana do wykrywania zmian w białkach PSD w hipokampie u pojedynczego szczura po leczeniu genetycznym, farmakologicznym lub mechanicznym.

Wprowadzenie

Terapia elektrowstrząsowa była stosowana w leczeniu pacjentów z poważnymi zaburzeniami depresyjnymi, w tym ciężką depresją lekooporną, depresją dwubiegunową, chorobami Parkinsona i schizofrenią1,2. W tej terapii napad jest generowany przez bodziec elektryczny dostarczany do głowy znieczulonych pacjentów za pośrednictwem elektrod naczaszkowych1,2,3. Powtarzające się podawanie ECS było klinicznie korzystne w przypadku lekoopornych zaburzeń depresyjnych1,2,3. Jednak dokładny mechanizm leżący u podstaw długoterminowej skuteczności działania przeciwdepresyjnego u ludzi pozostaje nieuchwytny. ECS jest zwierzęcym modelem terapii elektrowstrząsowej i jest szeroko stosowany do badania jej mechanizmu terapeutycznego. U gryzoni zarówno ostre ECS, jak i przewlekłe leczenie ECS promują neurogenezę dorosłych w hipokampach i reorganizują sieć neuronową4,5, co prawdopodobnie przyczyni się do poprawy elastyczności poznawczej. Co więcej, globalne zwiększenie aktywności mózgu przez ECS zmienia obfitość transkryptów, takich jak czynnik neurotropowy pochodzenia mózgowego6, oraz wiele białek, w tym metabotropowy receptor glutaminianu 17 i podjednostki receptora glutaminianu typu N-metylo-D-asparaginianu (NMDA)7. Zmiany te pośredniczą w długotrwałej modyfikacji liczby, struktury i siły synaps w hipokampie7,8,9.

W modelach ECS stymulacja elektryczna jest dostarczana gryzoniom za pomocą stereotaktycznie wszczepionych elektrod, elektrod rogówkowych lub elektrod usznych, co wywołuje uogólnione napady toniczno-kloniczne10,11. Stereotaktyczne wszczepienie elektrod wiąże się z operacją mózgu i wymaga znacznego czasu na poprawę umiejętności chirurgicznych eksperymentatora w celu zminimalizowania obrażeń. Mniej inwazyjne elektrody rogówki mogą powodować ścieranie i suchość rogówki oraz wymagać znieczulenia. Stosowanie elektrod z klipsem do uszu omija te ograniczenia, ponieważ można je stosować u gryzoni bez operacji lub znieczulenia i powodować minimalne obrażenia. Rzeczywiście, odkryliśmy, że prąd dostarczany do obudzonych szczurów za pośrednictwem elektrod z klipsem do uszu niezawodnie indukuje napady toniczno-kloniczne w stadium 4-5 i zmienia białka synaptyczne w ich hipokampie10.

Aby zbadać indukowaną przez ECS obfitość białek synaptycznych w określonych regionach mózgu gryzoni, ważne jest, aby wybrać metody eksperymentalne, które są najbardziej odpowiednie do ich wykrywania i kwantyfikacji. Subkomórkowe frakcjonowanie mózgu pozwala na surową izolację rozpuszczalnych białek cytozolowych; białka błonowe; białka związane z organellami; a nawet białka w specjalnych strukturach subkomórkowych, takich jak PSD12,13,14. PSD to gęsta i dobrze zorganizowana domena subkomórkowa w neuronach, w której białka synaptyczne są silnie skoncentrowane na błonie postsynaptycznej i w jej pobliżu12,13,15. Izolacja PSD jest przydatna do badania białek synaptycznych wzbogaconych w PSD, ponieważ dynamiczne zmiany w obfitości i funkcji postsynaptycznych receptorów glutaminianu, białek rusztowania i białek transdukcji sygnału w PSD12,15,16,17 są skorelowane z plastycznością synaptyczną i synaptopatią obserwowaną w kilku zaburzeniach neurologicznych17,18. Poprzednia metoda frakcjonowania subkomórkowego stosowana do oczyszczania PSD polegała na izolacji frakcji nierozpuszczalnej w detergentach z surowej frakcji błonowej mózgu poprzez różnicowe wirowanie gradientów sacharozy14,19. Głównym wyzwaniem związanym z tą tradycyjną metodą jest to, że wymaga ona dużej ilości mózgów gryzoni14,19. Przygotowanie 10 - 20 gryzoni do wyizolowania frakcji PSD na zabieg wymaga znacznych nakładów kosztów i czasu i nie jest praktycznie wykonalne, jeśli istnieje wiele zabiegów.

Aby sprostać temu wyzwaniu, dostosowaliśmy prostszą metodę, która bezpośrednio izoluje frakcję PSD, bez wirowania w gradiacji sacharozy20,21, i zmieniliśmy ją tak, aby miała zastosowanie do izolacji PSD z hipokampa pojedynczego mózgu szczura. Nasza metoda frakcjonowania PSD na małą skalę pozwala uzyskać około 30 - 50 μg białek PSD z 2 hipokampów, co wystarcza do wykorzystania w kilku testach biochemicznych, w tym immunoprecypitacji i Western blot. Western blot pokazuje sukces naszej metody izolowania PSD, ujawniając wzbogacenie białka o gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95) i wykluczenie markera presynaptycznego synaptofizyny i rozpuszczalnego białka cytoplazmatycznego α-tubuliny. Nasze metody indukcji ECS i frakcjonowania PSD na małą skalę można łatwo dostosować do innych regionów mózgu gryzoni i zapewniają stosunkowo prosty i niezawodny sposób oceny wpływu ECS na ekspresję białek PSD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign.

1. Utrzymanie kolonii szczurów

  1. Hoduj szczury Sprague-Dawley (patrz tabela materiałów) i utrzymuj je w standardowych warunkach z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
  2. Odsadz młode szczura od piersi w 28. dniu po urodzeniu (P) i trzymaj je w grupach po 2-4 samce lub samice z miotu.
  3. Oznacz ogony samców szczurów nietoksycznym, trwałym czarnym markerem w celu identyfikacji.
  4. Waż samce szczurów 3 razy w tygodniu i zapisuj ich masę ciała.

2. Przygotowanie maszyny ECS

  1. O godzinie 7:30 należy zdezynfekować ławkę w pomieszczeniu do przygotowywania zwierząt i umieścić na niej maszynę ECS (generator impulsów).
  2. Umieść pojedynczego samca szczura o wadze 200 - 250 g w czystej, pustej klatce z pokrywką. Powtórz tę czynność dla wszystkich samców szczurów, które mają być leczone indukcją ECS. Pozwól szczurom przyzwyczaić się przez 30 minut.
  3. Podczas gdy szczury przyzwyczajają się w swoich klatkach, ustaw generator impulsów do indukcji ECS na częstotliwość 100 impulsów/s, szerokość impulsu 0,5 ms, czas trwania wstrząsu 0,5 s i prąd 55 mA (Rysunek 1A).
  4. Przygotuj generator impulsów, naciskając przycisk "RESET" i upewniając się, że przycisk "READY" świeci. Upewnij się, że klipsy na uszy nie są przymocowane do generatora impulsów, a następnie naciśnij przycisk "SHOCK" przez kilka sekund.
    UWAGA: W tym momencie generator impulsów jest gotowy do indukcji ECS.
  5. Podłącz klipsy na uszy do generatora impulsów.

3. Indukcja ostrego ECS

UWAGA: Zobacz Rysunek 1B, górny panel.

  1. Zwilż klipsy do uszu sterylną solą fizjologiczną i upewnij się, że są nasycone.
  2. Zwilż uszy szczura sterylną solą fizjologiczną, owijając je gazą nasączoną solą fizjologiczną. Gdy będą mokre, usuń gazę.
  3. Przymocuj jeden klips na ucho, umieść poza głównym pasmem chrząstki.
  4. Potwierdź na maszynie ECS, że ustanowiona została prawdziwa pętla; jeśli nie, na maszynie pojawi się komunikat o błędzie lub odczyt liczby "1".
  5. Noś grubą, niemetalową rękawicę. Trzymając szczura delikatnie w dłoni w rękawiczce, naciśnij przycisk "SHOCK" przez kilka sekund i powoli zwolnij uchwyt szczura, aby obserwować napad. W przypadku pozorowanej kontroli "bez napadu" (NS) należy obchodzić się ze szczurem identycznie, ale nie dostarczać prądu.
  6. Odłącz klipsy uszne, gdy zaczyna się klonus i zapisuj zachowanie napadowe zgodnie ze zmienioną skalą Racine'a22, która obejmuje "ruchy ust i twarzy" (etap 1), "głową" (etap 2), "klonus kończyn przednich" (etap 3), "wychowywanie z klonusem kończyn przednich" (etap 4) oraz "podnoszenie i upadanie z klonusem kończyn przednich" (etap 5). Napad powinien trwać około 10 sekund; Zapisz czas trwania napadu za pomocą timera.
  7. Po zakończeniu napadu należy zwrócić szczura do jego klatki domowej. Monitoruj szczura przez kolejne 5 minut, aby upewnić się, że szczur wyzdrowieje po napadach. Trzymaj go pojedynczo w klatce i zwróć klatkę do sali pooperacyjnej.
  8. Powtórz indukcję ECS na następnym szczurze.
  9. Monitoruj szczury przez pozostałą część dnia i co najmniej raz rano i raz po południu następnego dnia, aż zostaną poddane eutanazji do eksperymentów.
    UWAGA: Metoda indukcji ECS może prowadzić do objawów klinicznych jako przypadkowego działania niepożądanego, które wymaga uwagi. Na przykład protokół indukcji ECS może wywołać napady trwające dłużej niż 15 s i powodować niepotrzebny stres u szczurów. W takim przypadku należy przerwać napad za pomocą diazepamu (10 mg/kg, i.p.) lub pentobarbitalu (25 - 30 mg/kg, i.p.). Jeśli u szczurów rozwinie się niewydolność oddechowa lub poważne nieprawidłowości behawioralne po ustaniu napadów, należy je poddać eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla, a następnie ścinanie głowy.

4. Indukcja przewlekłego ECS

UWAGA: Zobacz Rysunek 1B, dolny panel.

  1. Wywoływać jeden ECS dziennie o tej samej porze rano, jak opisano w krokach 1 - 3 powyżej, przez siedem kolejnych dni.
  2. Monitoruj szczury dwa razy dziennie po powrocie do klatek domowych.

5. Homogenizacja i frakcjonowanie hipokampów szczurów

UWAGA: Zobacz Rysunek 2.

  1. Przygotować świeży bufor homogenizacyjny (roztwór A), który zawiera 320 mM sacharozy, 5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7,4, 200 nM kwasu okadainowego i inhibitory proteazy. Przefiltruj i wysterylizuj bufor za pomocą filtrów o wielkości porów 0,22 μm do filtracji próżniowej i umieść go na lodzie.
  2. W określonym momencie po ostrym ECS lub przewlekłym ECS (Rysunek 1), poddaj szczura eutanazji przez wdychanie CO2 przez 5 - 10 minut, a następnie ścięcie głowy za pomocą gilotyny.
  3. Usuń mózg i rozłóż hipokampy na metalową płytkę umieszczoną na lodzie, jak opisano wcześniej23,24.
  4. Umieść dwa hipokampy jednego szczura na 30-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i zmiel je na małe kawałki za pomocą nożyczek.
  5. Przenieść rozdrobnione hipokampy do ręcznego homogenizatora szklanego za pomocą pipety o pojemności 1 ml i dodać 1 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego (roztwór A, krok 5.1). Włóż okrągły tłuczek do szklanego homogenizatora. Gdy szklany homogenizator znajduje się na lodzie, delikatnie i równomiernie przesuwaj tłuczek w górę i w dół 10 - 15 razy przez 1 minutę, aż znikną małe kawałki tkanki hipokampa.
  6. Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i odwirować homogenat przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia supernatantu pojądrowego (frakcja S1) od osadu zawierającego nierozpuszczalną tkankę i jądra (frakcja P1). Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś 50 μl i 950 μl frakcji S1 do dwóch oddzielnych, nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml i przechowuj je na lodzie. Zachowaj granulat frakcji P1 na lodzie.
  7. Odwirować frakcję S1 (950 μl) przez 10 minut w temperaturze 13 800 x g i 4 °C w celu oddzielenia supernatantu (frakcji S2), wzbogaconego białkami rozpuszczalnymi w cytozolu, i osadu (frakcja P2), wzbogaconego białkami związanymi z błoną, w tym białkami synaptosomalnymi. Przenieś frakcję S2 do nowej mikrowirówki o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przechowuj ją na lodzie.
  8. Zawiesić osad (frakcja P2) w 498 μl lodowato oczyszczonej wody za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodać 2 μl 1 M HEPES (pH 7,4) za pomocą pipety 20 μL, aby uzyskać końcowe stężenie 4 mM HEPES (pH 7,4). Inkubować w temperaturze 4 °C z mieszaniem przez 30 minut. Zawieszoną frakcję P2 należy przechowywać na lodzie.
  9. Określ stężenie białka we frakcjach S1, S2 i P2 za pomocą testu BCA. Dodać 50 mM HEPES (pH 7,4) do każdej frakcji, aby osiągnąć stężenie 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia lub przetworzyć frakcję P2 w celu wyizolowania PSD.

6. Izolacja PSD z frakcji surowego białka błonowego (P2)

  1. Odwirować frakcję P2 (500 μl) przez 20 minut w temperaturze 25 000 x g i 4 °C w celu oddzielenia lizowanego supernatantu (frakcja LS2) i lizowanego osadu (frakcja LP1). Przenieś frakcję LS2 do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przechowuj ją na lodzie.
  2. Zawiesić osad LP1 w 250 μl 50 mM HEPES (pH 7,4) zmieszanym z 250 μl 1% detergentu w 1x buforze PBS za pomocą pipety 1 ml. Inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez 15 min.
  3. Odwirować zawieszony osad LP1 przez 3 godziny w temperaturze 25 000 x g i temperaturze 4 °C, aby oddzielić supernatant (frakcja inna niż PSD) od osadu (frakcja PSD). Usunąć supernatant do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i ponownie zawiesić osad PSD w 100 μl 50 mM HEPES (pH 7,4) za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  4. Określ stężenie białka we frakcjach LS2, innych niż PSD i PSD za pomocą testu BCA. Dodać 50 mM HEPES (pH 7,4) do każdej frakcji, aby osiągnąć stężenie 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Wszystkie roztwory użyte w krokach 5 - 6 (tj. roztwór A, bufor HEPES i bufor PBS) powinny być wykonane z oczyszczonej wody wolnej od zanieczyszczeń i cząstek jonowych i organicznych.

7. Western Blotting (zachodnia plama)

  1. Rozmrozić każdą frakcję białkową na lodzie. Przenieść 12 μl każdej frakcji (S2, P2 i PSD w 1 mg/ml) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 20 μl.
  2. Dodać 3 μl 5-krotnego buforu do próbek SDS i inkubować w temperaturze 75 °C przez 30 minut w łaźni wodnej. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej (RT).
  3. Załaduj 10 μl próbki białka do każdej studzienki z 15-dołkowym żelem do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o nachyleniu 4-20% za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Uruchomić żel w aparacie SDS-PAGE i przy napięciu 80-100 V w buforze roboczym (25 mM Tris, 190 mM glicyny i 0,1% SDS; pH 8,3).
    UWAGA: Każdy żel powinien zawierać próbki białek od szczurów NS i szczurów ECS w różnych punktach czasowych po ostrym lub przewlekłym ECS.
  4. Przenieść białka z żelu SDS-PAGE do membrany z polifluorku winylu (PVDF) w aparacie transferowym pod napięciem 25 - 30 V (60 mA) przez 9 - 12 godzin w buforze transferowym (25 mM Tris, 190 mM glicyny i 20% metanolu; pH 8,3).
  5. Usunąć membranę PVDF z aparatu transferowego i umyć ją w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) przez 5 minut na wielofunkcyjnym rotatorze w temperaturze pokojowej.
  6. Zablokować błonę w 5% mleku i 0,1% Tween-20 w TBS przez 1 godzinę. Inkubować ją w przeciwciałach pierwszorzędowych (Tabela 1) w buforze płuczącym (1% mleka i 0,1% Tween-20 w TBS) przez noc na wielofunkcyjnym rotatorze w temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów dla rozcieńczeń).
  7. Przemyć membranę 4 razy przez 10 minut każdy w buforze do przemywania się, a następnie inkubować ją z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) w buforze płuczącym przez 1 godzinę na wielozadaniowym rotatorze w temperaturze pokojowej.
  8. Płukać membranę 4 razy po 10 minut w buforze do mycia, a następnie TBS przez 5 minut.
  9. Inkubować membranę ze wzmocnionym substratem chemifluorescencyjnym przez 1 minutę i wystawić ją na działanie filmu rentgenowskiego. Wywołaj naświetloną folię za pomocą procesora filmowego.

8. Kwantyfikacja Western Blot

  1. Przeskanuj Western blot jako plik TIFF i zapisz ten plik na komputerze.
  2. Otwórz plik Western blot w programie ImageJ jako obraz w skali szarości, w sekcji "Plik", "Otwórz obraz", strzałka w prawo "skala szarości".
  3. Wybierz narzędzie do zaznaczania prostokątnego z paska narzędzi ImageJ i narysuj prostokąt, który pokrywa pojedynczy pasmo Western blot interesującego Cię białka.
  4. W sekcji "Analizuj" naciśnij "Zmierz", aby uzyskać obszar i średnią gęstość wybranego pasma.
  5. Przenieś prostokąt do obszaru tła bez zmiany jego rozmiaru i kształtu. Powtórz krok 8.4 dla obszaru i średniej gęstości tła.
  6. Odejmij średnią wartość gęstości prążka tła od gęstości pasma Western blot, uzyskując gęstość pasma odjętą od tła białka będącego przedmiotem zainteresowania.
  7. Powtórz kroki od 8.2 do 8.6 dla wszystkich interesujących nas pasm Western blot.
  8. Podziel gęstość prążkową odjętego tła białka będącego przedmiotem zainteresowania przez gęstość prążka odjętą od tła produktu genu porządkowego, takiego jak α-tubulina; ten krok daje znormalizowaną wartość białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując szczegółową procedurę przedstawioną w niniejszym opracowaniu, pojedynczy wstrząs elektryczny (55 mA, 100 impulsów/s przez 0,5 s) podany za pomocą elektrod klipsowych do uszu wywołał jednorazowe drgawki toniczno-kloniczne stopnia 4-5 u szczurów (Rysunek 1A-B). Łącznie 8 szczurów poddano ostrej indukcji ECS, w wyniku której wystąpiły drgawki toniczno-kloniczne stopnia 4-5. Drgawki trwały około 10 s, a wszystkie szczury powróciły do sta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metodę indukcji ECS u szczurów, która wywołuje globalną stymulację aktywności neuronalnej w ich hipokampach. ECS jest zwierzęcym modelem terapii elektrowstrząsowej, która jest klinicznie stosowana w leczeniu opornych na leki zaburzeń depresyjnych u ludzi 1,2,3. Pomimo stosowania terapii elektrowstrząsowej w leczeniu ciężkiej depresji, dokładny mechanizm leżący u podstaw depresji pozostaje niejasny. Poniew...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Ericowi C. Boltonowi za umożliwienie nam użycia jego wirówki do frakcjonowania oraz dr Grahamowi H. Dieringowi z laboratorium dr Richarda L. Huganira na Uniwersytecie John's Hopkins za dostarczenie nam protokołu frakcjonowania PSD na małą skalę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS dostarcza
generator impulsówUgo Bsile, Comerio, Włochy57800ECS dostarcza
system oczyszczania wody MilliQEMD MilliporeZ00Q0VWWFrakcjonowanie subkomórkowe dostarcza
sacharozęEm scienceSX 1075-3Materiały do
frakcjonowania subkomórkowegoNa4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Materiały do frakcjonowania subkomórkowego
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza
Kwas okadaikowyTOCRIS1136Materiały do frakcjonowania subkomórkowego
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Frakcjonowanie subkomórkowe
dostarcza NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Frakcjonowanie subkomórkowe
EMD Millipore Sterito Sterylne próżniowe filtry butelkoweFisher ScientificSCGPS05RESubcellular Fractionation dostarcza
nożyczki do irysaWPI (World Precision Instrumenty)500216-GMateriały do frakcjonowania subkomórkowego
Naczynie do hodowli tkankowych 30 mmFisher Scientific08-772BMateriały do frakcjonowania subkomórkowego
Homogenizator szklany i tłuczek teflonowyVWR89026-384Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza
probówkę do mikrowirówek 1,7 mlDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza
wirówkę Sorvall Legend XT/XF Thermo Fisher75004521Materiały do frakcjonowania subkomórkowego
Odczynnik do oznaczania białek Pierce BCA A, 500 mlThermo Fisher#23228Western blot Odczynnik
oznaczania białek Pierce BCA B, 25 mlThermo Fisher#1859078Western blot dostarcza
SDS-żel poliakrylamidowy (SDS-PAGE)BIO-RADWestern blot supplies
Bieganie BuforWykonany w laboratoriumWestern blot supplies. 
Pionowe ogniwo elektroforetyczne Mini-PROTEAN Tetra do żeli Mini-Prefabrykat, 4-żeloweBIO-RAD#1658004Western blot dostarcza
membranę z polifluorku winylu (PVDF) MiliporeIPVH00010Western blot dostarcza
Bufor transferowyWykonane w laboratoriumWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot dostarcza
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot dostarcza
Dodecylosiarczan soduSIGMA-ALDRICH436143Western blot dostarcza
metanol Fisher ScientificA454-4Western blot dostarcza
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent do izolacji PSD
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot dostarcza
beztłuszczowe mleko instant w proszkuŚwietna wartośćWestern blot Wielofunkcyjny
rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot dostarcza
film autoradiograficzny Hyblot CLDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot
dostarcza Ulepszony substrat chemifluorescencyjny Thermo Scientific32106Western blot dostarcza
procesor foliowy Konica SRX-101AKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot dostarcza
Nazwa przeciwciała
PSD-95Cell Signaling#2507Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 h, Temperatura reakcji = 4 ° C, Gatunek gospodarza = Sygnalizacja
komórkowasynaptofizyny#4329Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 ° C, Gatunek gospodarza =
alfa-tubulinaSantacruzSC-5286Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 ° C, Gatunek gospodarza = Mysz
GluN2BNeuromab75-097Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 ° C, Gatunek gospodarza = Mysz
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 ° C, Gatunek gospodarza = Królik
STEPSantacruzSC-23892Rozcieńczenie przeciwciał = 1:200 - 500, czas = 9 - 12 h, Temperatura reakcji = 4 ° C, Gatunek gospodarza = Mysz
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Rozcieńczenie przeciwciała = 1:2,000-5,000, czas = 1 h, Temperatura reakcji = RT, Gatunek gospodarza = Osioł
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Rozcieńczenie przeciwciał = 1:2,000-5,000, czas = 1 h, Temperatura reakcji = RT, Gatunek gospodarza = Osioł
do #4561086S królika królika

Bibliografia

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869(2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230(2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896(2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269(2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Napady elektrowstrząsowefrakcjonowanie hipokampawestern blottinganaliza białek synaptycznychekspresja GluN2Bdetekcja PSD95frakcjonowanie w małej skaliizolacja hipokampaindukcja napadów
Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.