Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster

Żyjemy w czasach, w których otyłość i związane z nią obciążenia ekonomiczne są problemem ogólnoświatowym¹. Dwóch na trzech Amerykanów ma nadwagę lub otyłość z powiązanymi patologiami serca, główną przyczyną zgonów w dorosłej populacji². Potrzebne są nowe, skuteczne metody, aby odpowiednio zbadać składniki genetyczne i molekularne zaangażowane w regulację zespołu metabolicznego przy użyciu organizmów modelowych. Z tego powodu wybraliśmy model muszki owocowej Drosophila, ponieważ dzieli on najbardziej podstawowe procesy biologiczne ze ssakami, w tym myszami i ludźmi^3,4,5,6. Genom Drosophila jest wysoce konserwatywny podczas ewolucji, ale ogólnie znacznie mniejszy, z mniejszą duplikacją genów i złożonością metaboliczną, co czyni go idealnym do zrozumienia podstawowych mechanizmów związanych z wieloma chorobami ludzkimi^4,7,8. Również charakterystyczne procesy zachodzące w tkance tłuszczowej, jelitach i trzustce są reprezentowane przez muchę i pośredniczą w funkcjach regulacyjnych w metabolizmie glukozy i lipidów, na przykład podobne do ludzkich9^,10,11. Co więcej, podstawowe szlaki molekularne zaangażowane w kontrolę otyłości, insulinooporności i cukrzycy u ludzi są funkcjonalnie zachowane u Drosophila melanogaster^{12,13,14,15,16}. Podobnie jak organizmy wyższe, Drosophila ma bijące serce, które powstaje podczas rozwoju w wyniku procesów podobnych do tych u ssaków heart^3,17. W związku z tym opracowanie niezawodnego protokołu żywienia HFD i wysokoprzepustowego testu TAG, dostosowanego do skutecznych celów przesiewowych z wykorzystaniem zestawu narzędzi genetycznych Drosophila, stanowią ważny środek do badania i zrozumienia podstawowych podstaw genetycznych leżących u podstaw złożonych chorób metabolicznych.

Karma HFD sama w sobie jest przygotowana ze standardowego laboratoryjnego pokarmu dla much, uzupełnionego olejem kokosowym, który składa się głównie z nasyconych kwasów tłuszczowych, o których wiadomo, że są związane z zespołem metabolicznym¹⁸. Podczas gdy wywoływanie otyłości u modeli ssaków, takich jak gryzonie, może trwać miesiące^19,20, nasz zoptymalizowany protokół żywienia HFD u Drosophila skutecznie i powtarzalnie zwiększa zawartość tłuszczu w organizmie w ciągu kilku dni^12,14. Protokół ten, w połączeniu z wysokoprzepustowym testem TAG, umożliwia skuteczne masowe badania przesiewowe pod kątem wpływu czynników genetycznych, wpływów środowiskowych i kandydatów na leki w celu odkrycia nowych modulatorów metabolizmu tłuszczów. W związku z tym protokoły te są prawdopodobnie istotne dla zrozumienia i/lub zwalczania otyłości i patologii związanych z otyłością u ludzi.

Protokół żywieniowy jest wszechstronny i może być stosowany do badania metabolicznych i funkcjonalnych efektów pojedynczych nasyconych lub nienasyconych kwasów tłuszczowych. Zastosowanie tego wysokoprzepustowego testu TAG nie ogranicza się do D. melanogaster, ale może być dostosowane do różnych małych organizmów modelowych z naskórkiem lub twardymi matrycami zewnątrzkomórkowymi (np. inne gatunki Drosophila, C. elegans i inne pojawiające się modelowe organizmy bezkręgowców) do pomiaru zawartości tłuszczu w różnych warunkach środowiskowych, genetycznych lub fizjologicznych, na dowolnym etapie rozwoju, dorosłość lub faza choroby metabolicznej. Test TAG opiera się na pomiarze kolorymetrycznym szeregu reakcji enzymatycznych, które rozkładają TAG na wolne kwasy tłuszczowe, glicerol, 3-fosforan glicerolu i wreszcie_H2O2, który reaguje z 4-aminoantypiryną (4-AAP) i 3,5-dichloro-2-hydroksybenzenosulfonianem (3,5 DHBS) w celu wytworzenia produktu o czerwonym zabarwieniu, który jest mierzony za pomocą 96-dołkowego spektrofotometru.

1. Protokół żywienia HFD

Tabela 1. Przepis na jedzenie dla much.
Poniższa tabela podsumowuje różne składniki użyte do przygotowania naszej żywności kontrolnej. Po przygotowaniu 10 ml żywności wlewa się do fiolek, schładza i przechowuje w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.

1. Przygotowanie HFD
   1. Aby przygotować 1 kg pokarmu o wysokiej zawartości tłuszczu, należy zważyć 700 g gotowego pokarmu dla much (patrz tabela 1) i 300 g oleju kokosowego do dwóch oddzielnych pojemników za pomocą wagi analitycznej.
   2. Podgrzej każdy pojemnik osobno w kuchence mikrofalowej, aż zawartość całkowicie się rozpuści. Wlej olej kokosowy do pojemnika na muchy. Mieszaj trzepaczką, aż olej dobrze wymiesza się z pokarmem dla much.
      UWAGA: Żadne kawałki jedzenia ani oleju nie powinny być widoczne. Gdy pokarm na muchy topi się w kuchence mikrofalowej, zatrzymuj się w odstępach 1 minuty, aby wymieszać jedzenie i zapobiec wykipieniu.
   3. Ponownie zważ żywność o wysokiej zawartości tłuszczu. Jeśli całkowita waga jest mniejsza niż 1 kg (700 g żywności + 300 g oleju kokosowego), dodaj wodę (około 10 ml), aby skompensować parowanie podczas podgrzewania i przywrócić wagę do 1 kg.
   4. Wlać około 10 ml dobrze wymieszanego pokarmu o wysokiej zawartości tłuszczu na fiolkę (około 25% objętości fiolki). Następnie przykryj gazą, aby zapobiec zanieczyszczeniu muchami. Schłodzić przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść fiolki do temperatury 4 °C w celu przechowywania do 4 tygodni.
      UWAGA: Normalna żywność (NF) jest używana jako żywność kontrolna. Wlać również 10 ml (około 25% objętości fiolki) NF na fiolkę. W przypadku żywności HFD zastąp 30% żywności NF olejem kokosowym. W warunkach kontrolnych i eksperymentalnych muchom podawano taką samą ilość NF i HFD (10 ml pokarmu na fiolkę).

Rysunek 1. Karmienie HFD u Drosophila.
Schemat przedstawia różne etapy karmienia much na pokarmie kontrolnym (normalna dieta bez dodatku oleju kokosowego-NF) lub HFD (z dodatkiem oleju kokosowego). Cały proces trwa 10 dni po początkowym zebraniu dorosłych much. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Karmienie HFD D. melanogaster
   UWAGA: Protokół ten obejmuje procedury kontroli żywności i karmienia HFD, które są kompatybilne z każdą żyłką muchową. Muchy kontrolne i doświadczalne umieszcza się w fiolkach zawierających taką samą ilość pokarmu (NF lub HFD).
   1. Użyj CO₂ do znieczulenia much.
      UWAGA: Dla neofitów prosimy o zapoznanie się z reference²¹, aby zapoznać się z informacjami na temat hodowli i obchodzenia się z D. melanogaster.
   2. Zebrać muchy w wieku 0-5 dniowym z fiolek i przenieść (przez odwrócenie) muchy do nowych fiolek zawierających NF (wcześniej podgrzanych w temperaturze pokojowej). Pozwól muchom starzeć się przez dodatkowe 5 dni w temperaturze 21 °C.
   3. Po upływie 5 dni wyjąć fiolki zawierające HFD i NF z temperatury 4 °C.
      UWAGA: Ponieważ niskie temperatury mogą stresować żywe muchy, pozostaw fiolki na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby się rozgrzały przed użyciem.
   4. Za pomocą chusteczek oczyść i usuń nadmiar płynu ze ścianek fiolek.
   5. Włóż mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach około 1 cm x 3 cm do żywności o wysokiej zawartości tłuszczu, aby wchłonąć nadmiar płynu.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania przywieraniu much do pokarmu HFD.
   6. Następnie przenieś muchy na pokarm o wysokiej zawartości tłuszczu (odwracając). Położyć fiolki poziomo na boku, (nie stojąc) w temperaturze 21-22 °C przez 5 dni.
      UWAGA: Unikaj wyższych temperatur, ponieważ może to częściowo stopić pokarm o wysokiej zawartości tłuszczu, powodując, że muchy przykleją się do jedzenia i umrą.
   7. Po 5 dniach przenieś (przez odwrócenie) muszki z NF i HFD do nowych fiolek bez jedzenia, aby umożliwić opróżnienie ich jelit przez 30 minut. Następnie przystąp do ważenia much.
      UWAGA: Jednym z krytycznych kroków w tym protokole żywienia HFD jest przygotowanie dobrze wymieszanego HFD, wolnego od jakichkolwiek kawałków pokarmu dla much lub skondensowanego oleju. Zaleca się jednorodne wymieszanie i schłodzenie HFD do temperatury 45-30 °C przed rozlaniem do fiolek i przechowywaniem pokarmu w temperaturze 4 °C. Ważne jest właściwe dopasowanie wieku muszek kontrolnych i doświadczalnych, a także kontrolowane warunki żywieniowe i środowiskowe przed karmieniem HFD. Podczas fazy karmienia muchom kontrolnym i doświadczalnym należy podawać taką samą ilość NF i HFD. Nigdy nie zbieraj much z przepełnionych fiolek lub butelek (aby uniknąć skutków międzypokoleniowych). Zawsze umieszczaj maksymalnie 25 much na fiolkę podczas karmienia NF i HFD, aby uniknąć ograniczeń dietetycznych lub innych efektów stłoczenia. HFD składa się w 30% z oleju kokosowego, dlatego temperatury powyżej 22 °C mogą częściowo stopić HFD, powodując przyklejenie się muchy do tłustego pokarmu i śmierć. Przed umieszczeniem much na HFD wyczyść fiolki, aby usunąć resztki oleju i włóż bibułę filtracyjną, aby wchłonąć nadmiar płynu z żywności. Podczas inkubacji much na HFD, fiolki są układane na bokach, aby zapewnić muchom beztłuszczową poziomą powierzchnię.
3. Ważenie much
   1. Dla każdego badanego genotypu i płci należy użyć ultraczułej wagi, aby zarejestrować wagę wstępnie oznakowanych, pustych probówek o pojemności 1,7 ml.
   2. Używając środka znieczulającego na muchy lub CO₂ znieczulij i zbierz 36 much o tym samym genotypie, płci i statusie karmienia za pomocą szczoteczki do jednej wstępnie zważonej probówki o pojemności 1,7 ml.
   3. Zważyć probówkę zawierającą muchy za pomocą tej samej ultraczułej wagi.
   4. Określ średnią masę muchy zgodnie z tym wzorem:
      
      UWAGA: Liczba much w tym protokole wynosi 36.
   5. Błyskawiczne zamrożenie probówek o pojemności 1,7 ml zawierających muchy poprzez zanurzenie w ciekłym azocie na 2 minuty. Zbierz probówki i włóż je do pudełek. Następnie przenieść pudełka do -80 °C (preferowana temperatura) w celu przechowywania do czasu użycia z testem TAG.
      UWAGA: Ciekły azot ma bardzo niską temperaturę. Należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

2. Test TAG

1. Przygotowanie stężeń wzorcowych TAG
   1. Przygotuj 500 ml PBT (PBS 1X, 0,05% Triton).
   2. Używając probówek o pojemności 0,5 ml i roztworu TAG (tabela materiałów), przygotuj 100 μl ślepej próby (tylko PBT) i 100 μl sześciu standardowych stężeń TAG (2 μg/μL; 1 μg/μL; 0,5 μg/μL; 0,25 μg/μL; 0,125 μg/μL; 0,0625 μg/μL) z PBT.
   3. Umieść rurki na lodzie i przystąp do mielenia much.
2. Mielenie much
   1. Wyjąć zamrożone muchy w temperaturze od -80 °C (krok 1.3). Przenieś probówki zawierające muchy na lód.
   2. Najpierw umieść metalowe kulki mielące o średnicy 2 mm w 96-dołkowym dozowniku kulek, użyj małego pędzla, aby usunąć dodatkowe kulki.
   3. Umieść 96-dołkową płytkę mielącą do góry nogami na dozowniku kulkowym i odwróć, aby przenieść metalowe kulki bezpośrednio na płytę mielącą. Na dołek powinna przypadać jedna piłka.
   4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 600 μl PBT do każdego rzędu 96-dołkowej płytki mielącej.
   5. Za pomocą kleszczy dodaj 3 muchy na studzienkę. Należy wskazać genotyp, płeć i stan pokarmowy much w każdym rzędzie/dołku 96-dołkowej płytki mielącej.
   6. Szczelnie umieść nakrętki na 96-dołkowej płycie mielącej. Taśmę można umieścić na górze, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
   7. Prawidłowo umieść 96-dołkowe płytki szlifierskie w szlifierce. Ustaw maszynę na najwyższą prędkość i naciśnij "uruchom", aby mielić muchy przez 3 minuty.
   8. Po 3 minutach przerwać mielenie i przystąpić do wirowania na płytkach: wirować przez 15 minut w temperaturze 4.000 x g, 4 °C. Po odwirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z płytą mielącą, aby uniknąć zmieszania supernatantu z osadem.
3. Ładowanie próbki i określanie zawartości TAG
   1. Weź nową 96-dołkową płytkę spektrofotometru. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj 200 μl odczynnika TAG do każdego rzędu płytki.
   2. Załaduj 20 μl PBT do pierwszego dołka w pierwszym rzędzie, aby utworzyć ślepą próbę. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Unikaj tworzenia się bąbelków.
   3. Załadować 20 μl każdego wzorcowego rozcieńczenia (z kroku 2.1.2) do pozostałych studzienek w pierwszym rzędzie i mieszać pipetując w górę i w dół. Unikaj tworzenia się bąbelków.
   4. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 20 μl supernatantu z każdego rzędu płytki mielącej do odpowiedniego rzędu na 96-dołkowej płytce spektrofotometru. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Unikaj tworzenia się bąbelków.
   5. Następnie umieść folię przepuszczającą gaz na wierzchu 96-dołkowej płytki.
   6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 min.
      UWAGA: Jeśli w studzienkach znajdują się pęcherzyki, odwiruj płytkę przez 2 minuty przy 2,000 x g, aby usunąć wszystkie pęcherzyki. Obecność pęcherzyków będzie zakłócać odczyt absorbancji.
   7. Odczytać absorbancję każdego dołka płytki przy długości fali 550 nm za pomocą kompatybilnego czytnika mikropłytek. Następnie prześledź krzywą wzorcową i określ stężenie [μg/μL] nieznanych próbek.
   8. Aby określić ilość zawartości TAG na średnią masę muchy, należy użyć następującego wzoru:
      
      UWAGA: W tym protokole 3 muchy zostały zmielone w 600 μl PBT; w efekcie średnia objętość na muchę wynosi 200 μL.
4. Test Bradforda i normalizacja zawartości TAG z zawartością białka
   1. Przygotować siedem 100 μl wzorcowych rozcieńczeń albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (75 μg/ml; 100 μg/ml; 150 μg/ml; 200 μg/ml; 250 μg/ml; 500 μg/ml; 1,000 μg/ml) z PBT.
   2. Weź nową 96-dołkową płytkę i załaduj 200 μl odczynnika Bradford 1X do każdego rzędu płytki.
   3. W pierwszym dołku pierwszego rzędu dodaj 10 μl PBT, aby uzyskać ślepą próbę. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Unikaj tworzenia się bąbelków.
   4. Dodać 10 μl każdego wzorcowego rozcieńczenia do pozostałych studzienek w pierwszym rzędzie i mieszać, pipetując w górę i w dół. Unikaj tworzenia się bąbelków.
   5. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 10 μl supernatantu muchowego z każdego rzędu płytki mielącej do odpowiedniego rzędu na płytce 96-dołkowej. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Unikaj tworzenia się bąbelków.
   6. Umieść folię przepuszczającą gaz na wierzchu płytki 96-dołkowej.
   7. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Jeśli w studzienkach znajdują się pęcherzyki, odwiruj płytkę przez 2 minuty przy 2 000 x g, aby je usunąć.
      UWAGA: Obecność pęcherzyków będzie zakłócać odczyt absorbancji.
   8. Użyć spektrofotometru, aby odczytać absorbancję ślepej próby, wzorców i nieznanych próbek przy długości fali 595 nm. Za pomocą krzywej wzorcowej należy określić stężenia [μg/μl] próbek w każdym rzędzie.
   9. Znormalizuj zawartość TAG z poziomem białka, korzystając z następującego wzoru:
      

U D. melanogaster, podobnie jak u innych gatunków, występuje dymorfizm płciowy między samcami i samicami22. Powszechnie wiadomo, że samice są większe, mają więcej tłuszczu w brzuchu niż samce22. Aby przetestować skuteczność naszego protokołu, przeprowadziliśmy testy TAG w celu określenia różnic w zawartości TAG między samcami i samicami standardowych laboratoryjnych much typu dzikiego (w1118). Dane pokazują, że kobiety mają więcej tkanki tłuszczowej na całym ciele niż ich męscy odpowiednicy (Rysunek 2A, B). Dane wykazały również, że test jest stabilny, bez zmian w kwantyfikacji TAG w czasie (do 50 minut po inkubacji) i bez zmian w zależności od wielkości próbki biologicznej (3 lub 5 much).

Wykazano, że spożywanie HFD powoduje otyłość u ludzi i myszy19,20,23. Aby przetestować skuteczność naszego protokołu żywienia, przeprowadziliśmy testy TAG za pomocą naszego HFD i kontrolnego karmienia samic much. Odkryliśmy, że spożywanie HFD u Drosophila powoduje zwiększoną zawartość tłuszczu, która stopniowo gromadzi się w czasie (Rysunek 3A-C). Innym ważnym odkryciem jest to, że już po 18 godzinach karmienia HFD (Rysunek 3C), byliśmy w stanie wywołać znaczny wzrost zawartości tłuszczu u tych muszek. Odkrycia te sugerują, że ten system modeli genetycznych jest idealnym narzędziem do przyspieszonych badań nad znalezieniem nowych regulatorów otyłości wywołanej przez HFD.

Rysunek 2. Testy TAG u samców i samic much.
2-tygodniowe muchy na normalnej diecie zebrano, pogrupowano według płci (samce i samice), zważono i zmielono (3 lub 5 much na dołek) do analizy TAG. Testy TAG przeprowadzono zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszej pracy. Absorbancję każdej próbki przy długości fali 550 nm odczytano w różnych punktach czasowych (0 min, 5 minut, 20 minut i 50 minut) w celu określenia ostatecznych wahań kwantyfikacji TAG w czasie, zmienności zawartości tłuszczu w różnych rozmiarach populacji (3 i 5 much) w1118 muchach oraz różnic między zawartością TAG samców i samic. Wyniki wykazały, że samice gromadzą więcej tłuszczu niż ich męskie odpowiedniki (A-B), pomiary TAG nie wahają się do 50 minut po inkubacji reakcji w temperaturze 37 °C (A-B). Ponadto średnie poziomy TAG pozostają niezmienione między testami TAG z użyciem 3 lub 5 much (A-B). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Statystyki: brak istotnej różnicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Wpływ HFD na akumulację tłuszczu.
A-B: Zebrano 2-tygodniowe samice much hodowane na normalnym lub HFD przez 5 dni i przeprowadzono testy TAG w celu określenia poziomu tłuszczu. Zawartość TAG była normalizowana albo na podstawie masy ciała (A), albo poziomu białka (B). Dane wykazały, że spożywanie HFD prowadzi do zwiększonej zawartości tłuszczu przy obu metodach normalizacji. C: 2-tygodniowe samice much na normalnym/kontrolnym pokarmie (NF) i 18 godzin, 1 dzień lub 2 dni na HFD są oznaczane na zawartość TAG. Wyniki wskazują na znaczny i postępujący wzrost poziomu TAG z 18 godzin do 2 dni ekspozycji na HFD. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Statystyki: test t-studenta. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.