Artykuł metodologiczny

Przeszczep pierwotnych komórek rozrodczych w celu przeskoku opartego na CRISPR/Cas9 w Xenopus

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56035

⸱

1 lutego 2018

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

Geny niezbędne do przetrwania stanowią techniczne przeszkody w tworzeniu linii mutantów. Skakanie pozwala uniknąć śmiertelności, łącząc edycję genomu z przeszczepem pierwotnych komórek rozrodczych w celu stworzenia zwierząt typu dzikiego z mutacjami linii zarodkowej. Leapfrogging pozwala również na efektywne generowanie homozygotycznych mutantów zerowych w pokoleniu F1. Tutaj pokazany jest etap przeszczepu.

Streszczenie

Tworzenie zmutowanych linii poprzez edycję genomu przyspiesza analizę genetyczną w wielu organizmach. Metody CRISPR/Cas9 zostały przystosowane do stosowania u afrykańskiej żaby szponiastej, Xenopus, która od dawna jest organizmem modelowym do badań biomedycznych. Tradycyjne schematy hodowlane mające na celu tworzenie homozygotycznych linii mutantów z mutagenezą ukierunkowaną na CRISPR/Cas9 mają kilka czasochłonnych i pracochłonnych etapów. Aby ułatwić tworzenie zmutowanych zarodków, a w szczególności przezwyciężyć przeszkody związane z eliminacją genów niezbędnych do embriogenezy, opracowano nową metodę zwaną przeskakiwaniem. Technika ta wykorzystuje wytrzymałość zarodków Xenopus do "wycinania i wklejania" metod embriologicznych. Leapfrogging wykorzystuje transfer pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) z skutecznie mutagenizowanych zarodków dawcy do rodzeństwa typu dzikiego poddanego ablacji PGC. Metoda ta pozwala na efektywną mutację niezbędnych genów poprzez tworzenie chimerycznych zwierząt z komórkami somatycznymi typu dzikiego, które przenoszą zmutowaną linię zarodkową. Kiedy dwa zwierzęta F0 z "przeszczepami żabki przeskakowej" (tj. zmutowanymi komórkami rozrodczymi) są krzyżowane, wytwarzają homozygotyczne lub złożone heterozygotyczne zarodki F1, oszczędzając w ten sposób czas całego pokolenia na uzyskanie danych fenotypowych. Leapfrogging zapewnia również nowe podejście do analizy genów efektu matczynego, które są oporne na analizę fenotypową F0 po mutagenezie CRISPR/Cas9. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metodę przeskakiwania, ze szczególnym naciskiem na to, jak skutecznie przeprowadzić przeszczep PGC.

Wprowadzenie

Jak genotyp koduje fenotyp, było głównym pytaniem w biologii od czasu ponownego odkrycia praw Mendla. Zrozumienie roli genów, ich regulacji i interakcji w sieciach genowych oraz funkcji kodowanych produktów może dostarczyć narzędzi do odkrywania nowych biologii i łagodzenia stanów chorobowych. Przez ponad pół wieku1, afrykańska żaba szponiasta, Xenopus, jest wiodącym modelem do badań nad szeroką gamą tematów z zakresu podstawowej biologii i biomedycyny, w tym genetycznej kontroli rozwoju. Historycznie rzecz biorąc, większość badań nad Xenopus wykorzystywała allotetraploidalną żabę, X. laevis, ale ostatnio, ze względu na jej diploidalność, X. tropicalis został opracowany jako model genetyczny. Kompletne sekwencje genomu zostały zebrane z obu gatunków Xenopus2,3. "Społeczność żab" znajduje się obecnie w punkcie zwrotnym, w którym podstawowa technologia modyfikacji genomu pozwala na badanie funkcji genów, praktycznie według własnego uznania. Programowalne endonukleazy CRISPR/Cas9 sprawiły, że mutageneza genów jest wysoce wydajna, a mutacja bialleliczna jest możliwa w większości komórek zwierzęcia4,5,6,7,8,9,10,11. Badania te, podkreślone przez Bhattacharya i wsp.12 oraz Shigeta et al.13, wykazały, że funkcja wielu genów może być badana przez mutagenezę u zwierząt mozaikowych F0. Takie podejście ma wiele zalet; jednak zarodki z mikrowstrzyknięciem Cas9-sgRNA często wykazują zmienne fenotypy z powodu niepełnej utraty funkcji (LOF). Co ważniejsze, generowanie zmutowanych linii jest bardzo korzystne w niektórych zastosowaniach - w szczególności podczas badania genów, które mają matczyny wkład mRNA. Matczyne mRNA i białka oraz ich wpływ na epigenetykę utrzymują się przez dłuższy czas w embriogenezie14,15,16, co sprawia, że wczesny wkład rozwojowy wielu genów jest oporny na analizy F0. W związku z tym wymagane są inne podejścia LOF.

Podczas próby stworzenia zmutowanych linii, droga do uzyskania homozygotycznych zarodków LOF napotyka kilka przeszkód. Po pierwsze, skuteczna mutageneza w celu wytworzenia mutacji biallelicznych może być niekorzystna, ponieważ utrata podstawowych funkcji genów skutkuje niemożnością przeżycia do dojrzałości płciowej, zakłócając produkcję żywotnej linii. Powszechnym rozwiązaniem jest staranne miareczkowanie ilości dostarczanego Cas9-sgRNA. W tym przypadku celem jest osiągnięcie równowagi między zmniejszeniem śmiertelności a maksymalizacją skuteczności mutagenezy linii zarodkowej. Drugi problem wynika ze standardowego schematu hodowlanego, w którym analizy fenotypowe są odraczane do pokolenia F2. Stosując standardowe podejście, dojrzałe płciowo zwierzęta F0, które przenoszą zmutowane allele przez linię zarodkową, są krzyżowane w celu wytworzenia heterozygotycznych "nosicieli" F1, które są następnie hodowane do dojrzałości płciowej. Dwie heterozygoty F1 są następnie krzyżowane w celu wytworzenia zmutowanych zarodków F2 z oczekiwaną częstością mendlowską wynoszącą 25%. Tak więc do analizy zmutowanych fenotypów potrzebne są dwa pokolenia hodowlane. Zmutowane zwierzęta mogą być homozygotami lub heterozygotami złożonymi (tj. potomstwem zawierającym dwa różne zmutowane allele, które zależy od genotypów zwierząt rodzicielskich użytych w krzyżówce F1).

Te przeszkody można pokonać, ograniczając programowalną mutagenezę za pośrednictwem nukleazy do komórek rozrodczych, co leży u podstaw nowej metody zwanej leapfrogging17. Przeskakiwanie składa się z dwóch głównych elementów: (1) mikroiniekcji mRNA Cas wraz z sgRNA lub kompleksami nukleaza-sgRNA (lub, w zasadzie, TALEN-ami lub nukleazami palca cynkowego) na etapie pojedynczej komórki w celu skutecznej mutagenizacji genomów embrionalnych, a następnie (2) przeszczepienie PGC do zarodków rodzeństwa typu dzikiego, gdzie endogenne PGC zostały usunięte. Gdy oba etapy są skuteczne, można uzyskać całkowite zastąpienie linii zarodkowej zmutowanymi komórkami rozrodczymi. Blackler wykazał na początku lat sześćdziesiątych, że Xenopus PGCs mogą być przeszczepiane między zarodkami w późnym stadium neuruli i wczesnych stadiów pąków ogonowych18,19. W przypadku przeskakiwania podejście Blacklera zostało zmodyfikowane poprzez wykonanie przeszczepów w stadium blastuli17, gdy PGC są zlokalizowane w biegunie roślinnym zarodka20,21. Przeszczep przed gastrulacją ma dwie główne zalety. Po pierwsze, stwierdzono, że wszczepienie przeszczepów i późniejszy prawidłowy rozwój są bardziej efektywne, gdy przeszczep jest wykonywany w stadium blastuli (obserwacje niepublikowane). Po drugie, wykonując przeszczepy w stadium blastuli wkrótce po rozpoczęciu transkrypcji zygotycznej, można uniknąć śmiertelności wynikającej z rozwojowych mutacji genów, które zakłócają gastrulację lub w inny sposób prowadzą do zniekształconych późnych neuronów. Zarodki po przeszczepie PGC ("przeskoczone") są hodowane do dojrzałości płciowej, a krzyżówki między tymi zwierzętami F0 wykazały, że w wielu przypadkach 100% potomstwa F1 wykazuje fenotyp LOF (większość z nich to heterozygoty złożone), co wskazuje na całkowitą wymianę linii zarodkowej z docelowymi mutacjami.

Oczekuje się, że przeskakiwanie przyspieszy podejście genetyczne w Xenopus. Leapfrogging stanowi również alternatywę dla metody "transferu gospodarza"22 do analizy LOF genów efektu matczynego (niepublikowane obserwacje). W niniejszej publikacji szczegółowy opis metody, ze szczególnym uwzględnieniem transplantacji PGC, przedstawiono w X. tropicalis (z niewielkimi modyfikacjami dla X. laevis). Przeszczepianie PGC zostało tutaj zademonstrowane, aby ułatwić szybszy transfer tej technologii do innych laboratoriów pracujących z Xenopus. Zasady tej metody powinny być skuteczne w przypadku innych (np. urodeli), a specyficzne dla organizmu modyfikacje w metodologii powinny pozwolić na zastosowanie do wielu innych zwierząt, u których można osiągnąć skuteczną mutagenezę, a PGC są łatwo przeszczepiane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine.

1. Przygotowania do przeszczepu PGC

  1. Przygotuj narzędzia do preparowania z wyprzedzeniem, zgodnie z wcześniejszym opisem23.
    UWAGA: Noże do włosów brwi służą do wykonywania nacięć za pomocą pętli do włosów w celu ustabilizowania zarodka podczas wykonywania operacji. Włoski brwi i pętle do włosów są przyklejane do pipet Pasteura ze szkła borokrzemianowego, które najpierw zostały wciągnięte w płomień i złamane na rozcieńczonej części (patrz Rysunek 1A, grot strzałki), aby utworzyć krótszą, węższą końcówkę (Rysunek 1B) dla większej zręczności podczas wykonywania operacji.
  2. Generuj sgRNA za pomocą procedur opisanych wcześniej24 .
    UWAGA: Krótko mówiąc, krótkie matryce DNA kodujące sgRNA są tworzone przy użyciu nakładających się na siebie deoksyoligonukleotydów zawierających promotory 5' bakteriofagów T7, które są wyżarzane i "wypełniane" bezbłędną, termostabilną polimerazą DNA. Reakcje syntezy sgRNA in vitro są inkubowane przez kilka godzin lub noc (w zależności od użytego zestawu). Reakcje są poddawane działaniu DNAzy w celu usunięcia matrycy. SgRNA są oczyszczane standardowymi metodami ekstrakcji fenolem/chloroformem i wytrącania octanu amonu/izopropanolu, zgodnie z instrukcjami producenta zestawu24.
  3. Na krótko przed wykonaniem mikroiniekcji należy przygotować kompleksy Cas9-sgRNA, najpierw denaturując ~250 ng sgRNA w 3 μl całkowitej objętości H2O bez RNAzowe (traktowane dietylowęglanem) w temperaturze 60-65 °C przez 5 min, a następnie szybko schładzać na lodzie przez 5 min. Wirować sgRNA przez kilka sekund, dodać 1 μL 1 μg/μL białka Cas9, i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu pobudzenia tworzenia kompleksów.
    UWAGA: Po tej inkubacji probówka może być trzymana na lodzie podczas przygotowywania zarodków do mikroiniekcji.
  4. Pozyskać zarodki X. tropicalis przez zapłodnienie in vitro przy użyciu standardowych metod, jak opisano wcześniej25. De-jelly25,26 zarodki po 10 minutach od zapłodnienia.
    UWAGA: Czas zapłodnienia jest uważany za czas po dodaniu zawiesiny nasienia do komórek jajowych i zalaniu naczynia 1/9thX Marc's Modified Ringers (MMR)26. Dla X. tropicalis25, w przeciwieństwie do X. laevis, wykonaj de-jellies w 1/9x MMR zawierającym 3% zasady wolnej od cysteiny (nie soli HCl), pH dostosowane do 7,8-8,0, a następnie wielokrotne płukanie w 1/9x MMR. Przenieś zarodki do naczynia pokrytego agarozą (1%) zawierającego 1/9x MMR w temperaturze pokojowej.
  5. Natychmiast przenieść zarodki do wstrzyknięcia do 1% pokrytego agarozą naczynia zawierającego 1x MMR za pomocą pipety Pasteura.
  6. Wstrzykiwać na etapie 1 komórki. Zobacz referencje26,27 aby uzyskać szczegółowe opisy metod mikroiniekcji Xenopus.
    1. Wstrzyknij każdy zarodek w jedno miejsce na biegunie zwierzęcym z 4 nL kompleksu Cas9-sgRNA (końcowa ilość = 1 ng Cas9 i ~250 pg sgRNA; patrz Dyskusja)24. Po 10-20 minutach od wygojenia się miejsca wstrzyknięcia, przenieść zarodki do naczynia pokrytego agarozą zawierającego 1/9x MMR i inkubować w temperaturze 25 °C. Stwórz również naczynie z niewstrzykniętych zarodków rodzeństwa, które będą służyć jako biorcy przeszczepu.
  7. Przygotuj płytki Petriego (60 mm), które zawierają warstwę 1% agarozy o grubości ~5 mm wykonanej w 0,3x MMR, w przypadku przeszczepów w X. tropicalis, lub 1x MMR w przypadku X. laevis.
    1. Stwórz wgłębienia o głębokości ~3-4 mm, wkładając formę 3 x 4 dołkową (utworzoną przez wycięcie 96-dołkowej płytki PCR) do stopionej agarozy podczas nalewania płytek (patrz Rysunek 1C i D). Przytrzymaj formę kilka milimetrów nad dnem szalki Petriego za pomocą zacisku przymocowanego do stojaka pierścieniowego, aż agaroza stwardnieje.
    2. Dodatkowo należy wykonać 24-dołkową płytkę do przechowywania pojedynczych zarodków, pokrywając dołki cienką warstwą 1% agarozy wykonanej z 1/9x MMR.
      UWAGA: Pożywka hodowlana dodana do tych studzienek to 1/9x MMR uzupełniona 50 μg siarczanu gentamycyny/ml.

2. Przeszczepienie PGC

  1. Gdy zarodki osiągną Nieuwkoop i Faber28 blastula stadium 9 (Ryc. 2A), ~4,5 h po zapłodnieniu (hpf) dla X. tropicalis, wyjmij je z inkubatora w temperaturze 25 °C i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przez dodatkowe 0,5 godziny.
  2. Aby rozpocząć przeszczep przy 5 hpf (Ryc. 2B), użyj pipety Pasteura, aby przenieść jeden zarodek dawcy PGC (wstrzyknięty Cas9-sgRNA) do 60-milimetrowej szalki agarozowej zawierającej wgłębienia (utworzone w kroku 1.7) w 0,3x MMR (lub 1x MMR, jeśli używasz X. laevis). Przenieś również jeden niewstrzyknięty zarodek rodzeństwa, biorcę przeszczepu, do tego naczynia.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby tożsamość każdego z tych zarodków nie była mylona.
  3. Ręcznie usuń otoczki witeliny z każdego zarodka za pomocą kleszczy i obróć oba zarodki tak, aby ich bieguny roślinne były widoczne i dostępne do operacji.
    UWAGA: Opis ręcznej dewitelizacji zarodków został już wcześniej opisany w 26.
  4. Używając ostrej końcówki noża do włosów do brwi, wykonaj cztery płytkie nacięcia w kształcie kwadratu na biegunie roślinnym zarodka biorcy, wewnątrz strefy, w której utworzą się przyszłe komórki butelki oznaczające blastopor. Wykonaj nacięcia, wkładając końcówkę noża do włosów brwiowych w zarodek, tuż pod powierzchnią, i wykonuj ruchy krojenia w górę, jednocześnie stabilizując zarodek za pomocą pętli włosowej.
    UWAGA: Rysunek 2 pokazuje widoki roślinne zarodka w odstępach półgodzinnych od 4,5 do 7,0 hpf, aby pokazać rozmiar komórki i dostarczyć wskazówki do oszacowania, gdzie uformują się komórki butelki (przerywane białe kółko). Celem jest wykonanie nacięć w miejscu, w którym wskazana jest przerywana ramka.
  5. Gdy cztery boki kwadratu zostaną wyznaczone nacięciami, pogłęb każde nacięcie nożem do włosów brwi, wykonując podobne ruchy tnące, aby osiągnąć głębokość około 1/3 do 1/2 odległości od podłogi blastocoelu.
  6. Uwolnij eksplant tkanki roślinnej od zarodka biorcy (Ryc. 3A i B), wykonując poziome (równoległe do powierzchni roślinnej) nacięcia w głębokim obszarze roślinnym.
    UWAGA: Wielkość eksplantatu roślinnego zawierającego PGC wynosi około 0,4-0,45 mm z każdej strony i 0,25-0,3 mm głębokości. Ten roślinny eksplant z zarodka biorcy nie jest już potrzebny i dlatego należy go odłożyć na bok w celu wyrzucenia.
  7. Pracując szybko, powtórz tę procedurę (kroki 2.4-2.6) na zarodku dawcy PGC, aby stworzyć fragment tkanki roślinnej o podobnej wielkości do przeszczepu.
    UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić tę drugą sekcję z niewielkim opóźnieniem, aby zminimalizować czas potrzebny zarodkowi biorcy na zagojenie otwartej rany.
  8. Po usunięciu tkanki zawierającej PGC z zarodka dawcy, użyj noża do włosów brwi i pętli do włosów, aby przesunąć ten eksplant na miejsce w otworze utworzonym w zarodku biorcy.
    UWAGA: Wewnętrzna powierzchnia przeszczepu dawcy musi być skierowana w stronę wnętrza zarodka biorcy. Nie jest konieczne dopasowanie orientacji osi grzbietowo-brzusznej i lewej-prawej przeszczepu do zarodka biorcy.
  9. Użyj dłuższej krawędzi trzonu noża do włosów brwiowych, trzymanej równolegle do powierzchni przeszczepu, aby delikatnie wcisnąć przeszczep w otwór w powierzchni roślinnej zarodka biorcy.
  10. Po umieszczeniu przeszczepu użyj pętli do włosów lub trzonu noża do włosów brwiowych, aby delikatnie przesunąć "tuszę" zarodka dawcy po powierzchni agarozy i do zagłębienia agarozowego. Upewnij się, że otwarta rana tuszy jest skierowana w stronę płynu luzem. Jeśli nie, użyj noża do włosów brwi, aby obrócić zarodek, aby uzyskać tę orientację.
  11. Wsuń zarodek biorcy, z gojeniem się przeszczepu na miejscu, do sąsiedniego zagłębienia i podobnie upewnij się, że przeszczepiona tkanka bieguna roślinnego jest skierowana w stronę płynu w objętości.
  12. Powtórzyć tę procedurę (kroki 2.1-2.11) przy użyciu innej pary zarodków dawcy i biorcy w celu stworzenia kolejnej pary zarodków przeszczep/tusza; przenieść je do pustych zagłębień.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby robić notatki w celu śledzenia dopasowanych par tusz i zarodków do przeszczepu. Tusze dawców zostaną wykorzystane jako wskaźnik skuteczności mutagenezy indukowanej przez Cas9-sgRNA w przeszczepionych PGC, której nie można łatwo ocenić, dopóki zwierzęta po przeszczepie nie osiągną dojrzałości płciowej (patrz krok 3.3 poniżej i dyskusja).
  13. Kontynuuj wykonywanie przeszczepów, aż zarodki osiągną w przybliżeniu wczesne stadium gastruli 10, które wynosi około 6,5 hpf u X. tropicalis (patrz Ryc. 2E).

3. Opieka nad zarodkami po uzdrowieniu

UWAGA: Przeszczepy goją się na swoim miejscu w ciągu ~30 minut, a normalne jest obserwowanie niektórych żółtek z lizy komórek wydzielających się z zarodka (Rysunek 3C).

  1. Po wygojeniu użyj pipety Pasteura, aby bardzo delikatnie przenieść zarodki z zagłębień do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki pokrytej agarozą. Wysięk zostanie usunięty (ryc. 3D) przez zmieszanie płynu podczas transferu.
    1. Obróć zarodki tak, aby były umieszczone słupem roślinnym do góry, przodem do roztworu objętościowego. Ponownie umieść tusze dawcy i biorców przeszczepów w sąsiednich studzienkach, aby pomóc w śledzeniu par zarodków; Zapisz te informacje.
  2. Przenieść 24-dołkową płytkę zawierającą zarodki do inkubatora w temperaturze 25 °C w celu przeprowadzenia nocnego posiewu.
    UWAGA: Następnego dnia zarodki osiągną stadium pąka ogonowego.
  3. Przenieś biorców przeszczepu do czystych, pokrytych agarozą 6-dołkowych płytek zawierających 1/9x MMR, uzupełnionych 50 μg siarczanu gentamycyny/ml, z 1 zarodkiem na dołk. Utrzymuj wyraźny rejestr tusz dawców, które pasują do tych biorców przeszczepów.
  4. Aby ocenić skuteczność mutagenezy poprzez sekwencjonowanie amplikonów PCR5,17,24 lub przy użyciu innych metod, które opierają się na amplikonach PCR (patrz Dyskusja), przenieś poszczególne tusze do probówek z paskami PCR o pojemności 0,2 ml. Usunąć większość pożywki i homogenizować w 100 μl buforu do lizy24 zawierającym proteinazę K (PK) poprzez wielokrotne pipetowanie w górę iw dół za pomocą pipety P200.
  5. Wykonaj lizę zarodka24 w temperaturze 56 °C przez 6 godzin do nocy, aby umożliwić trawienie farmakokinetyki. Dezaktywuj PK poprzez podgrzanie go do 90-95 °C przez 10 minut, a następnie szybkie schłodzenie do 4 °C. Użyj lizatów bez dalszych kroków czyszczenia, aby zasiać reakcje PCR w celu uzyskania krótkich amplikonów do bezpośredniego sekwencjonowania DNA Sangera24. Przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W ciągu kilku dni kijanki osiągną etap żerowania (około etap 45-46) i mogą być karmione zawiesiną proszku planktonowego (surowica Micron).
  6. Po ~1 tygodniu, przy codziennych zmianach pożywki hodowlanej w celu utrzymania czystości i zminimalizowania przerostu drobnoustrojów, przenieś kijanki do małych zbiorników w krążącym systemie wodnym z przepływem kroplowym. Wykorzystaj dane sekwencjonowania, aby oddzielić kijanki z wysoce efektywnie zmutagenizowanymi PGC od kijanek o niższej skuteczności mutagenezy. Po zakończeniu metamorfozy przenieś żabki do dorosłego systemu wodnego w laboratorium.
    UWAGA: Schematy opracowane przez National Xenopus Resource (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) stanowią przewodnik dla karmienia kijanek 29 i utrzymania dorosłych żab 30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po transplantacji należy przeprowadzić jakościowe oznaczenie skuteczności mutagezy CRISPR/Cas9, zanim poświęci się nakłady pracy na hodowlę i utrzymanie zwierząt aż do osiągnięcia przez nie dojrzałości płciowej. Ponieważ zwierzęta z transplantatami typu „leapfrog” są somatycznie dzikie, a linia zarodkowa jest trudnodostępna do bezpośrednich pomiarów, istotne staje się zachowanie zwłok embrionów dawcy. Analiza DNA z tych zwłok służy jako wskaźnik zakresu mutagezy zachodzącej w transplantow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy raport zawiera szczegółowy protokół przeszczepiania tkanek roślinnych zawierających PGC. Przeszczepianie PGC jest stosowane w połączeniu z technologiami edycji genomu (np. CRISPR/Cas9) w celu modyfikacji linii zarodkowej zwierzęcia przy jednoczesnym zachowaniu prawie wszystkich jego tkanek somatycznych jako genetycznie dzikiego. Aby przeskok zakończył się sukcesem, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych czynników przed wykonaniem przeszczepów.

Aby zapewnić całkowite zastąp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Ta praca została wykonana dzięki wsparciu grantu, 5R21HD080684-02, od National Institute of Child Health and Human Development. Autor pragnie podziękować Kenowi Cho za jego nieustający entuzjazm i wsparcie. Autor pragnie również podziękować Bruce'owi Blumbergowi za użycie aparatu, Rebece Charney za krytyczną lekturę rękopisu oraz Seanowi McNamarze i Marcinowi Wlizli z National Xenopus Resource (RRID:SCR_013731) za cenne rozmowy na temat żywienia i pielęgnacji zwierząt X. tropicalis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools11252-20 lub 11252-30
Nóż
Domowe pętelkiDomowe
pipety Pasteura, szkło borokrzemianoweFisher Scientific13-678-20A
Krazy Glue (na bazie cyjanoakrylanu)Elmer's Products, Inc.KG581Aby przymocować włosy do brwi i pętle do włosów w pipetach Pasteura, można użyć innych podobnych klejów.
Oligodeoksynukleotydy, zamówione na zamówienieZintegrowane technologie DNANiestandardowe uporządkowaneoligonukleotydy szablonowe do syntezy sgRNA, patrz Nakayama et al., 2014 w celu uzyskania szczegółów projektu.
Zestaw Megascript T7Ambion/ThermoFisherAM1334Lub użyj zestawu Megashortscript T7 (AM1354)
Fenol, buforowanyWysokiej jakości destylowany fenol od dowolnego dostawcy komercyjnego
ChloroformWysokiej jakości chloroform od dowolnego dostawcy komercyjnego
EtanolWysokiej jakości etanol od dowolnego komercyjnego dostawcy
Pianowęglan dietylu (DEPC)Sigma Chemical Co.D5758-50ML
Białko Cas9, z sygnałem lokalizacji jądrowejPNA Bio, Inc.CP01Rozpuszczony przy użyciu wody uzdatnionej przez DEPC zgodnie z zaleceniami producenta
10X Marc's Modified Ringers solutionHomemade. Przepis (nr 26) na 1X MMR (bez EDTA) to 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Roztwór ma pH dostosowane do 7,4.
AgarozaWystarczy dowolna agaroza klasy biologii molekularnej
60 X15 mm Płytki PetriegoFalcon351007
24-dołkowe Falcon3047
L-CysteinaSigma Chemical Co.C7352-100GWolna baza, nie sól HCl
Proteinaza K Roche03 115 828 001Zazwyczaj ~ 20 mg / ml z żywności Roche
sera MicronseraTadki. Zawiesić w pożywce wzrostowej. Można kupić u różnych sprzedawców internetowych
do brwi do włosów Tris

Bibliografia

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15(2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22(2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148(2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168(2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157(2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587(2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282(2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutageneza CRISPR Cas9embriony Xenopustechnika leapfroggingtransmisja w linii zarodkowejchirurgia bieguna wegetacyjnegoprzeszczepianie embrion wanaliza mutant w F1analiza DNA donoraknockout genu niezb dnego

Powiązane artykuły