Ten manuskrypt opisuje użyteczność ultradźwięków wykonywanych na samicach szczurów do projektowania eksperymentalnych modeli do badań reprodukcyjnych i ginekologicznych. Pokazane jest wyjaśnienie krok po kroku, jak przeprowadzić ocenę ultrasonograficzną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ultrasonografia w eksperymentalnych badaniach reprodukcyjnych na szczurach
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z rozwojem technologii wspomaganego rozrodu i etycznymi ograniczeniami badań na ludziach, modele zwierzęce szczurów stały się szeroko stosowane w medycynie reprodukcyjnej. W przeszłości badania nad rozwojem układu rozrodczego u gryzoni opierały się na jednorazowym badaniu histologicznym wyciętych tkanek. Niedawno, wraz z rozwojem ultrasonografii przezbrzusznej o wysokiej rozdzielczości, można teraz wykonywać wysokiej jakości ultrasonografię w celu oceny narządów rozrodczych szczurów, co pozwala na nową metodę badania układu rozrodczego. Obrazy uzyskano za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości. Ultrasonografię ginekologiczną wykonano na 28 ośmiotygodniowych szczurach niebędących w ciąży i 5 ciężarnych szczurach rasy Sprague-Dawley. Opisujemy, jak rozpoznać narządy układu rozrodczego i związane z nimi struktury w typowych widokach podczas różnych faz cyklu ruiowego. Doppler przepływu kolorów został wykorzystany do pomiaru przepływu krwi w tętnicy macicy i oceny zmian wzorca przepływu krwi w macicy na różnych etapach ciąży. Wykazaliśmy, że eksploracja ultrasonograficzna jest użyteczną metodą oceny zmian w wewnętrznych narządach rozrodczych. Jego zastosowanie stwarza możliwość przeprowadzania dodatkowych eksperymentów, w tym zabiegów medycznych czy chirurgicznych, a także daje możliwość monitorowania zmian ultrasonograficznych narządów wewnętrznych bez poświęcania zwierząt.
Wprowadzenie
Modele zwierzęce szczurów są szeroko stosowane w medycynie reprodukcyjnej, w tym w transplantacji zarodków i jajników1,2. Jednak w przeszłości badanie rozwoju układu rozrodczego u gryzoni opierało się na jednorazowym badaniu histologicznym wyciętych tkanek, a badanie podłużne codziennych zmian w narządach rozrodczych nie było możliwe u szczurów3. Ultradźwięki są szeroko stosowane w technikach wspomaganego rozrodu u ludzi od ponad 30 lat, ale ta cenna technologia została zastosowana u szczurów dopiero niedawno.
Naszym celem było ustanowienie ultrasonograficznego podejścia do oceny narządów rozrodczych szczurów Sprague-Dawley, zaprojektowanie eksperymentalnych modeli do badań reprodukcyjnych i ginekologicznych oraz zademonstrowanie procedury, ponieważ według naszej wiedzy, nie ma aktualnych wizualizacji publikacji dotyczących tej procedury. Opisujemy procedurę badania ultrasonograficznego układu rozrodczego samicy szczura oraz prezentujemy wyniki ultrasonograficzne dotyczące anatomii i przepływu krwi w tętnicy macicznej za pomocą ultradźwięków o wysokiej rozdzielczości. Monitorowaliśmy charakterystykę endometrium, jajników i przepływu krwi w tętnicy macicznej u zwierząt niebędących w ciąży na różnych etapach cyklu rui, aby ocenić istotne różnice w grubości endometrium, morfologii jajników i przepływie krwi w macicy na różnych etapach cyklu rui, podobnie jak u kobiet. Użyliśmy wysokiej jakości sprzętu ultradźwiękowego o częstotliwości 70 MHz i rozdzielczości 30 μm. Innym naszym celem była ocena zmian w oporze przepływu krwi w macicy u ciężarnych szczurów. Technika ta pozwala na badanie codziennych zmian w narządach rozrodczych bez poświęcania zwierząt.
Istnieje kilka technicznych trudności w stosowaniu ultradźwięków na szczurach. Trudności te obejmują: endometrium szczura jest znacznie cieńsze niż u ludzkiej samicy4. Trudności w obrazowaniu jajników szczurów przypisuje się grubszej skórze i muskulaturze ścian brzucha u szczurów, co spowodowało prawie całkowite osłabienie ultradźwięków5, a tętnica maciczna jest znacznie trudniejsza do znalezienia u szczurów niebędących w ciąży. Rozwiązaliśmy wiele problemów technicznych związanych z procedurą, a w przypadku tych problemów, które pozostały, pokazujemy, jak je zminimalizować.
Skuteczne monitorowanie zmian ultrasonograficznych w narządach rozrodczych szczurów bez potrzeby składania ofiar ze zwierząt otworzy możliwość budowy przyszłych modeli zwierzęcych medycyny rozrodu i innych procedur chirurgicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone ściśle według zaleceń zawartych w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health oraz zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Protokół otrzymał licencję na prowadzenie doświadczeń na zwierzętach zgodną z dyrektywą 2010/63/UE o numerze zezwolenia A13170404 (Anexo 1). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w laboratorium certyfikowanym przez Unię Europejską zgodnie z krajowymi wytycznymi dotyczącymi etycznej opieki nad zwierzętami (RD 53/2013, Dyrektywa UE 63/2010). Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Murcji.
1. Przygotowanie zwierząt
Uwaga: Wszystkie eksperymenty były wspierane przez Sekcję Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Murcji oraz Wydział Położnictwa i Ginekologii Uniwersytetu w Murcji.
- We wszystkich eksperymentach należy używać 8-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley (28 samic szczurów) o wadze 200-250 g.
Uwaga: Tutaj również użyliśmy 5 ciężarnych szczurów. - Aby uzyskać ciężarne szczury, ośmiotygodniowe samice i płodne samce szczurów są umieszczane w klatce i łączą się w pary od 17:00 do 23:00. Identyfikacja czopa dopochwowego następnego ranka została zinterpretowana jako sukces godowy. Weźmy pod uwagę 1 dzień ciąży, następny dzień po kryciu.
- Eksperymenty należy przeprowadzić w 9, 15 i 18 dniu ciąży.
- Szczury domowe w grupach po dwa osoby ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody utrzymują regularne 12-godzinne cykle światła/ciemności.
- Po zaaklimatyzowaniu się w warunkach placówki przez co najmniej dwa tygodnie, codziennie rano przeprowadzaj cytologię pochwy, aby ocenić częstotliwość i regularność rui.
Uwaga: Dwadzieścia osiem szczurów z regularną fazą rui trwającą od 4 do 5 dni zostało wybranych do włączenia do badania.
2. Przygotowanie szczurów do obrazowania
Uwaga: Obrazy uzyskano za pomocą ultrasonografii przezbrzusznej o wysokiej rozdzielczości. Fazy cyklu rujowego określono za pomocą cytologii wymazu z pochwy.
- Przed badaniem obrazowym należy znieczulić zaporę w komorze indukcyjnej 2-3% gazem izofluranowym.
- Usunąć zwierzę i natychmiast umieścić pysk w stożku nosowym podłączonym do systemu znieczulającego i utrzymywać zwierzę na 1,5-2% izofluranie podczas badania ultrasonograficznego.
- Usuń sierść od brzegu żebrowego do brzucha ogonowego za pomocą maszynki do strzyżenia i kremu do depilacji.
- Znieczulonego szczura należy ułożyć w pozycji leżącej na podgrzewanym stole, aby zabezpieczyć szczura i zapewnić optymalny komfort oraz utrzymanie parametrów fizjologicznych przez cały czas trwania sesji obrazowania. Wszystkie parametry fizjologiczne powinny być zintegrowane z obrazami i danymi rejestrowanymi w czasie rzeczywistym za pomocą aplikacji ultrasonograficznej.
- Delikatnie włóż sondę doodbytniczą (po nasmarowaniu), aby monitorować temperaturę ciała (37.5 °C ± 0.5 °C).
- Umieść przetwornik (30 Hz) w nieruchomym uchwycie i przesuwaj go wzdłuż osi pionowej i poziomej (przód-tył i bok-bok) za pomocą joysticka obsługiwanego ręcznie lub ręcznie.
- Nałóż balsam okulistyczny na bazie ropy naftowej na oczy szczura, aby uniknąć wysuszenia podczas zabiegu.
3. Procedura egzaminacyjna
Uwaga: Anatomia narządów rozrodczych szczurów: Pochwa leży grzbietowo do pęcherza moczowego i dzieli się na dwa rogi macicy, które rozciągają się w kierunku nerek. Jajniki są połączone z rogami macicy za pośrednictwem jajowodów (ryc. 1). Macica znajduje się w okolicy za nerkami.
- Identyfikacja macicy
- Używając pęcherza jako punktu orientacyjnego, aby znaleźć szyjkę macicy, podążaj za szyjką macicy, aby znaleźć gałąź lewego i prawego rogu macicy.
- Przełącz się na dwuwymiarowe viewing/wideo, wybierając "B-mode". Zmierz przednio-tylną średnicę każdego rogu macicy w obszarze środkowego przesmyku na strzałkowym obrazie linii środkowej. Wykrywaj pomiary za pomocą oprogramowania systemu ultrasonograficznego.
- Zmierz grubość endometrium od granicy echogenicznej do granicy echogenicznej w poprzek jamy endometrium na strzałkowym obrazie linii środkowej w "trybie B".
- Przejdź do trybu kolorowego Dopplera, wybierając "Color Doppler". Użyj kolorowego Dopplera, aby zidentyfikować dopływ krwi do endometrium i zmierzyć przepływ krwi w endometrium. W trybie kolorowego Dopplera wybierz następujące parametry: filtr górnoprzepustowy ustawiony na 4 Hz, częstotliwość powtarzania impulsów ustawioną w zakresie od 4 do 48 kHz oraz impulsową bramkę Dopplera ustawioną w zakresie od 0,2 do 0,5 mm.
- Identyfikacja przepływu krwi w tętnicy macicznej
- Uzyskaj krzywe dopplerowskie w tętnicy macicznej w pobliżu bocznego dolnego brzegu połączenia macicowo-szyjnego w pobliżu tętnicy biodrowej po każdej stronie.
- W trybie Dopplera należy użyć następujących parametrów: filtr górnoprzepustowy ustawiony na 6 Hz, częstotliwość powtarzania impulsowego ustawioną w zakresie od 4 do 48 kHz oraz impulsową bramkę Dopplera ustawioną w zakresie od 0,2 do 0,5 mm.
- Uważaj, aby wyrównać przepływ krwi i wiązkę Dopplera, aby zminimalizować kąt Dopplera. Zapisz kąt między wiązką Dopplera a naczyniem. Wartości uzyskane poza kątem 60° są niedokładne i należy ich unikać6.
- Zmierz szczytową prędkość skurczową (PSV) i prędkość końcoworozkurczową (EDV) z trzech kolejnych cykli. Następnie oblicz wartości stosunku skurczowego do rozkurczowego (S/D) (PSV/EDV) i wskaźnika oporu (RI) ([PSV-EDV]/PSV) dla każdego rogu macicy.
- Zmierz przepływ krwi w tętnicy macicznej 5 ciężarnych szczurów w 9., 15., 18. dniu ciąży.
- Identyfikacja przepływu krwi w jajniku i tętnicy jajnikowej
Uwaga: Jajniki samic szczurów znajdują się bocznie w stosunku do nerek po obu stronach zwierzęcia i znajdują się w poduszeczkach tłuszczowych znajdujących się na końcu rogu macicy (ryc. 1).- Aby zobrazować jajnik, zacznij od sondy w płaszczyźnie poprzecznej i umieść ją po bocznej stronie zwierzęcia nieco poniżej żeber. Nerka i poduszeczka tłuszczowa mają hiperechogeniczny wygląd w porównaniu z jajnikiem.
- Zmierz zewnętrzną granicę jajnika i mieszków włosowych. Liczby na skali do każdego obrazu są podane w milimetrach, z przyrostem co 0,1 mm.
Uwaga: Obrazowanie w trybie Color Doppler i Power Doppler pomaga w identyfikacji intensywności jajników i przepływu kierunkowego.
4. Projekt badania
- Sprawdź cykl rujowy za pomocą cytologii wymazu z pochwy.
- Podziel wszystkie szczury na dwie grupy. W przypadku grupy 1 lub przed płodnością (lub okołoowulacyjnej) należy uwzględnić szczury, które znajdowały się w fazie cyklu rujowego i rujowego. W przypadku grupy 2 lub po zapłodnieniu należy uwzględnić szczury, które znajdowały się we wczesnej i późnej fazie cyklu diestrus.
- Monitoruj i porównuj przednio-tylną średnicę każdego rogu macicy w obszarze środkowego przesmyku w grupach 1 i 2.
- Monitoruj i porównuj grubość endometrium i charakterystykę endometrium w grupach 1 i 2.
- Monitoruj i porównuj wielkość (maksymalne średnice) i charakterystykę jajników oraz lokalizuj wszelkie pęcherzyki okołoowulacyjne w obu jajnikach w grupach 1 i 2.
- Monitoruj i porównuj przepływ krwi w tętnicy macicznej w grupach 1 i 2.
- Monitoruj i porównuj przepływ krwi w tętnicy macicznej ciężarnych szczurów na różnych etapach ciąży (9, 15 i 18 dzień ciąży).
- Wykonuj analizy statystyczne za pomocą SPSS. Przedstaw dane jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) lub medianę z przedziałami międzykwartylowymi. Przeanalizuj wyniki za pomocą testu t-Studenta między różnymi grupami. Wartość P mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną różnicę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nie stwierdzono istotnych różnic w średnicach przednio-tylnych rogów macicy ani w grubości endometrium pomiędzy obiema stronami rogu macicy (Tabela 1). W porównaniu z grupą 2, średnia grubość endometrium w grupie 1 była większa, jednak między obiema grupami nie odnotowano istotnych różnic (P>0.05) (Rysunek 3). Niemniej jednak, w pobliżu cyklu rujowego stwierdzono obecność płynu wewnątrz macicy (u 8 z 28 szczurów), co wiązało się ze zmianami w morfologii endometrium (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na modyfikacje proceduralne i rozwiązywanie problemów, które były wymagane w tym badaniu, pomimo naszego celu, jakim było zidentyfikowanie wszystkich faz cyklu rui u szczurów za pomocą ultradźwięków, nie byliśmy w stanie znaleźć żadnych istotnych różnic. Przypuszczamy, że trudności te mogą wynikać z tego, że cykl rujowy trwa tylko kilka dni u szczurów, w przeciwieństwie do cyklu u kobiet. Jesteśmy pewni, że wszystkie pomiary zostały wykonane dokładnie w odpowiednim czasie, aby określić ewentualne różnice. Dlat...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Sekcję Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Murcji oraz Wydział Położnictwa i Ginekologii Uniwersytetu w Murcji. Dziękujemy wszystkim technikom pracującym w CEIB (Centro Experimental en Investigaciones Biomédicas), sekcji eksperymentów na zwierzętach Uniwersytetu w Murcji, którzy współpracowali przy tym projekcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System mikroobrazowania in vivo Vevo3100 o wysokiej rozdzielczości | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Zintegrowany system szynowy Vevo wraz z jednostką monitorowania fizjologicznego. | Firma Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| MX400 Przetwornik | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Lab Software | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD: Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | ||
| Żel smarujący | Ogólne zaopatrzenie | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 System wózków anestezjologicznych | Cibertec S.A | Aparat anestezjologiczny | |
| Ecogel 100 żel ultradźwiękowy | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| Balsam do depilacji (Nair) | Zaopatrzenie | ||
| Isoflurane | Esteve Veterinaria | Znieczulenie wziewne | |
| * Wymagane oprogramowanie to oprogramowanie Vevo, w tym aplikacja B-Mode, aplikacja Dopplera fali tętna i pakiet narzędzi do analizy odkształceń naczyniowych. |
Bibliografia
- Hunter, R. K. II, et al. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cell Effects on a Rodent Model of Thin Endometrium. PLoS ONE. 10 (12), e0144823(2015).
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 7 (3), 185-199 (2006).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging. J Vis Exp. (42), (2010).
- Lohmiller, J. J., Swing, S. P. Reproduction and Breeding. The Laboratory Rat. , 2nd, Elsevier Academic Press. 147-164 (2006).
- Jaiswal, R. S., Singh, J., Adams, G. P. High-resolution ultrasound biomicroscopy for monitoring ovarian structures in mice. Reprod Biol Endocrinol. 7 (69), (2009).
- Kim, G. H. Murine Fetal Echocardiography. J Vis Exp. (72), (2013).
- Jing, Z., Qiong, Z., Yonggang, W., Yanping, L. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 101 (2), 587-594 (2014).
- Mu, J., Adamson, S. L. Developmental changes in hemodynamics of uterine artery, utero- and umbilicoplacental, and vitelline circulations in mouse throughout gestation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (3), H1421-H1428 (2006).
- Anderson, C. M., Lopez, F., Zhang, H. Y., Pavlish, K., Benoit, J. N. Reduced uteroplacental perfusion alters uterine arcuate artery function in the pregnant Sprague-Dawley rat. Biol Reprod. 72 (3), 762-766 (2005).
- Hongmei, L., et al. Ultrasound Molecular Imaging of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Expression for Endometrial Receptivity Evaluation. Theranostics. 5 (2), 206-217 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
