Artykuł metodologiczny

Wykrywanie deficytów behawioralnych u szczurów po urazowym uszkodzeniu mózgu

20.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56044

⸱

30 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem prezentowanych tutaj testów behawioralnych jest wykrycie deficytów funkcjonalnych u szczurów po urazowym uszkodzeniu mózgu. Przedstawiono cztery specyficzne testy, które wykrywają deficyty w zachowaniach, aby odzwierciedlić uszkodzenie określonych obszarów mózgu, czasami trwające do jednego roku po urazie.

Streszczenie

Wraz z rosnącą częstością występowania urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) zarówno w populacjach cywilnych, jak i wojskowych, TBI jest obecnie uważane za chorobę przewlekłą; jednak niewiele badań badało długoterminowe skutki urazów w modelach TBI u gryzoni. Pokazano tutaj miary behawioralne, które są dobrze ugruntowane w badaniach nad TBI dla czasów wczesnych po urazie, takich jak dwa tygodnie, do dwóch miesięcy. Niektóre z tych metod były wcześniej stosowane w późniejszym czasie po urazie, do jednego roku, ale przez bardzo niewiele laboratoriów. Zademonstrowane tutaj metody to krótka ocena neurologiczna w celu zbadania odruchów, Beam-Balance w celu sprawdzenia równowagi, Beam-Walk w celu sprawdzenia równowagi i koordynacji ruchowej oraz wersja labiryntu wodnego Morrisa w pamięci roboczej, która może być wrażliwa na deficyty w pamięci referencyjnej. Samce szczurów były traktowane i wstępnie szkolone do testów neurologicznych, równowagi i koordynacji ruchowej przed otrzymaniem urazów przystrzałkowych (FPI) lub pozorowanych. Szczury mogą być wielokrotnie testowane na podstawie krótkiej oceny neurologicznej (neuroscore), balansu belki i spaceru po belce, podczas gdy testy w labiryncie wodnym można wykonać tylko raz. Różnica ta wynika z tego, że szczury mogą zapamiętać zadanie, co zakłóca wyniki, jeśli próbuje się powtórzyć testy na tym samym zwierzęciu. Podczas testowania od jednego do trzech dni po urazie wykrywa się znaczące różnice we wszystkich trzech zadaniach niepoznawczych. Jednak różnice w zadaniu Beam-Walk nie były wykrywalne w późniejszych punktach czasowych (po 3 miesiącach). Deficyty wykryto po 3 miesiącach w Beam-Balance i po 6 miesiącach w neuroscore. Deficyty w pamięci operacyjnej wykryto do 12 miesięcy po urazie, a deficyt w pamięci referencyjnej pojawił się po raz pierwszy po 12 miesiącach. W związku z tym standardowe testy behawioralne mogą być użytecznymi miarami utrzymujących się deficytów behawioralnych po FPI.

Wprowadzenie

Przedstawione tutaj metody są przeznaczone do wykrywania deficytów funkcjonalnych w określonych obszarach mózgu wywołanych przez eksperymentalny model TBI u szczura. Opisane zostaną cztery różne testy behawioralne. Po pierwsze, krótka ocena neurologiczna, zwana neuroscore, może być wykonana bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu, ale wymaga praktyki; Ten test wykrywa deficyty w odruchach. Po drugie, test Beam-Balance wykrywa braki w zdolności do wyważania. To zadanie wymaga od przewodnika oceny szczura na podstawie skali porządkowej i wymaga pewnego przeszkolenia przewodnika. Test Beam-Balance wymaga wąskiej wiązki i jest wrażliwy na deficyty w układzie przedsionkowym. Trzeci test ocenia koordynację przedsionkowo-ruchową. Ten test jest znany jako zadanie Beam-Walk i chociaż wymagane jest pewne wstępne szkolenie szczura, ta procedura jest bardziej obiektywna niż dwie poprzednie, ponieważ opóźnienie w przejściu wiązki jest obiektywną miarą, która nie zależy od subiektywnej oceny. Różnica ta wynika z tego, że mierzony jest czas pokonywania wąskiej belki, aby dotrzeć do sejfu. Test Beam-Walk wymaga dłuższej belki niż Beam-Balance, a także skrzynki ewakuacyjnej. Ten test mierzy deficyty zarówno w koordynacji ruchowej, jak i równowadze, a zatem jest wrażliwy na uszkodzenia móżdżku i obszarów mózgu związanych z motoryką. Wersja labiryntu wodnego Morrisa (MWM-WM) z pamięcią roboczą testuje przede wszystkim funkcję hipokampa i integrację z korą przedczołową lub funkcją wykonawczą. Pokazana wersja labiryntu wodnego Morrisa może być również używana do wykrywania deficytów w pamięci referencyjnej1.

Te metody zostały wybrane na podstawie ich ugruntowanej pozycji w literaturze. Każdy z nich był skuteczny w wielu rękach z różnych laboratoriów z wieloma szczepami szczurów w ciągu wielu lat badań. Jednak w przeszłości działania po urazie do dwóch tygodni po urazie były uważane za "przewlekłe" punkty czasowe. W związku z tym, aby ustalić techniki behawioralne do badania przewlekłych skutków TBI u gryzoni, te dobrze znane metody musiały zostać ocenione pod kątem czułości w wykrywaniu deficytów wywołanych TBI w dłuższych punktach czasowych po urazie. Chociaż obecnie istnieje kilka modeli TBI u gryzoni, model FPI jest jednym z najczęściej stosowanych i jest stosowany w tym badaniu. Model ten został po raz pierwszy opublikowany w latach pięćdziesiątych XX wieku2, a od tego czasu ponad 1000 artykułów wykorzystało FPI w rats3. Neuropatologia tego typu urazów została dobrze opisana przez nas4 i inni5,6,7. Krótko mówiąc, wykazano, że uszkodzenie neuronów w hipokampie jest zależne od dawki przy użyciu barwienia fluoro-jadeitem w krótkim czasie po urazie, tj. 24-48 godzin; Podczas gdy duża atrofia i kawitacja, w tym ścieńczenie wewnętrznej torebki i kory, zostały zgłoszone po roku od urazu6,7.

Najbardziej znaczącą reprezentacją funkcji mózgu jest oceniana za pomocą miar wyników behawioralnych po eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu. Jednak zdecydowana większość eksperymentów FPI, w których wykorzystuje się wyniki behawioralne, dokonuje pomiarów stosunkowo wcześnie, zwykle od 1 do 14 dni po urazie. Korzystając z przedstawionych tutaj metod, niektóre deficyty behawioralne można wykryć do 12 miesięcy po urazie1. Funkcje neurologiczne, funkcje przedsionkowo-motoryczne i koordynację ruchowo-ruchową oceniano w dniach po urazie (PID) 1-3 oraz po 3, 6 i 12 miesiącach po operacji, przy użyciu krótkiej oceny neurologicznej (Neuroscore; zmodyfikowana z Schallert8), zadania Beam-Balance i zadania Beam-Walk9,10,11. Referencja i pamięć robocza zostały ocenione przy użyciu wersji pamięci roboczej labiryntu wodnego Morrisa1,12,13.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są najpierw zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego, Galveston, Teksas, zgodnie z zaleceniami National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, National Research Council).

1. Zabiegi chirurgiczne i płynowa stymulacja TBI

  1. Zdobądź dorosłego samca 300 g szczurów Sprague-Dawley od sprzedawcy i trzymaj dwa w klatce z jedzeniem i wodą ad libitum w wiwarium o stałych warunkach: cyklu światła (600 godzin do 1800 godzin), temperaturze (21 °C do 23 °C) i wilgotności (40-60%).
  2. Przed zabiegiem należy opiekować się szczurami przez trzy do pięciu dni, a następnie przeszkolić szczury do procedur Neuroscore, Beam-Balance i Beam-Walk od jednego do trzech dni przed oceną wyjściową. Ocenę wyjściową należy przeprowadzić w dniu lub rano przed zabiegiem.
    UWAGA: Szczury kontrolne, takie jak szczury operowane pozorowo lub nieleczone chirurgicznie, należy zawsze przygotowywać w taki sam sposób, jak te, które doznają urazu i, losowo lub w sposób zrównoważony, grupować szczury w grupy leczone.
  3. Operacje należy wykonywać w warunkach aseptycznych (sterylne narzędzia, czyste fartuchy chirurgiczne, sterylne rękawiczki, maski i nakrycia głowy).
  4. Znieczulenie szczurów za pomocą izofluranu w stężeniu 4% do indukcji i 1,5-2% do konserwacji. Zaintubuj i mechanicznie przewietrz szczury (używając izofluranu w powietrzu:tlen (70:30) i przygotuj się na uraz parastrzałkowy spowodowany płynem i uderzeniem, jak opisano wcześniej14,15.
  5. Naciekać miejsca ran 0,10% bupiwakanem przed szyciem i włożyć doodbytniczy czopek z paracetamolem (120 mg/kg) przed wybudzeniem ze znieczulenia. Monitorować szczury przez co najmniej 4 godziny w okresie rekonwalescencji i następnego dnia pod kątem objawów infekcji, ciężkiego urazu neurologicznego (np. paraliżu) lub silnego dyskomfortu (np. uporczywa pozycja popielicy).
    UWAGA: Szczury wykazujące którykolwiek z tych objawów powinny zostać poddane eutanazji (4% izofluranu w komorze anestezjologicznej, a następnie ścięcie).

2. Szkolenia i testy Neuroscore

  1. Szkolenie Neuroscore
    1. W przypadku treningu na szczurach, o których wiadomo, że są eksperymentalnie nieeksperymentalne, należy przeprowadzić testy w następującej kolejności (kroki 2.2.1-2.2.5) od początku do końca, wrócić do klatki domowej na 1 minutę, a następnie powtarzać, aż do uzyskania wyniku zerowego.
    2. Zaznacz wyniki na arkuszu wyników, aby uzyskać zapis prób treningowych dla każdego szczura. Po treningu wykonaj jedną sesję testową (patrz poniżej) tego samego lub następnego dnia.
      UWAGA: Jeśli sesja testowa nie da zerowego wyniku dla linii bazowej, trening i testy mogą zostać powtórzone lub szczur może zostać przekierowany do eksperymentu niezwiązanego z zachowaniem.
  2. Testy Neuroscore
    UWAGA: Przeprowadź testy w następującej kolejności, wróć do klatki domowej na 1 minutę, a następnie powtórz dwa razy, w sumie trzy razy.
    1. Test zgięcia kończyn przednich
      1. Podnieś szczura za ogon i przytrzymaj około 6 - 12 cali nad powierzchnią stołu.
      2. Obserwuj, czy szczur wysuwa lub zgina kończyny przednie. Oceniaj obecność zgięcia (1) lub brak (0).
        UWAGA: Zgięcie jest nieprawidłowe. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (Suma możliwa = 3).
    2. Test zgięcia kończyn tylnych
      1. Podnieś szczura za ogon i przytrzymaj około 6 - 12 cali nad powierzchnią stołu.
      2. Obserwuj, czy szczur rozciąga lub zgina tylne kończyny. Oceniaj obecność zgięcia (1) lub brak (0).
        UWAGA: Zgięcie jest nieprawidłowe. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (możliwa skumulowana suma = 6).
    3. Wizualnie wyzwalany test umieszczania
      1. Podnieś szczura za ogon.
      2. Powoli opuść szczura w kierunku krawędzi stołu, aż nos znajdzie się około 10 cm od krawędzi.
      3. Powoli przesuwaj szczura w kierunku krawędzi (nie pozwól, aby wąsy dotykały krawędzi).
      4. Obserwuj, czy szczur sięga i wyciąga przednie łapy w kierunku stołu. Oceń obecność (0) lub brak (1) wysuniętych przednich łap.
        UWAGA: Sięganie po stół w odpowiedzi na sygnały wizualne jest normalne. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (możliwa skumulowana suma = 9).
    4. Test umieszczania wyzwalany kontaktowo
      1. Trzymaj szczura z ciałem w dłoni, równolegle do krawędzi stołu i wolnymi przednimi łapami.
      2. Powoli opuść szczura w kierunku krawędzi stołu, aż wąsy po jednej stronie dotkną krawędzi stołu.
      3. Obserwuj, czy szczur wysuwa przednią kończynę po tej samej stronie, co wąsy, które dotykają stołu, w kierunku krawędzi stołu, gdy tylko wąsy się zetkną.
        UWAGA: Wywołanie tej odpowiedzi wymaga znacznej praktyki, a badacze muszą być dobrze przeszkoleni, aby konsekwentnie wykonywać ten test.
      4. Oceniaj obecność (0) lub brak (1) sięgania w kierunku stołu.
        UWAGA: Sięganie w odpowiedzi na stymulację dotykową jest normalne. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (Całkowita możliwa = 12).
      5. Powtórz kroki 2.2.4.1-2.2.4.4 dla przeciwnej strony. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (możliwa skumulowana suma = 15).
    5. Test odruchu chwytania tylnej łapy
      1. Trzymaj szczura w jednej ręce kciukiem i palcem wskazującym wokół klatki piersiowej pod kończynami przednimi.
      2. Delikatnie dotknij dłoni jednej tylnej łapy drugim palcem wskazującym.
      3. Obserwuj, czy szczur chwyta palec wskazujący. Oceniaj obecność (0) lub brak (1) chwytania.
        UWAGA: Chwytanie jest normalne. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (Suma możliwa = 18).
      4. Powtórz kroki 2.2.5.1-2.2.5.3 dla przeciwnej strony. Możliwy wynik 1 x 3 = 3 (Suma możliwa = 21).
    6. Punktacji
      1. Zsumuj wyniki, aby uzyskać możliwą łączną sumę 7 x 3 = 21. Wynik zero jest normalny.

3. Trening i testowanie balansu belki

  1. sprzęt
    1. Użyj belki o długości 60 cm, szerokości 1,75 cm, wysokości 4,0 cm, ustawionej 90 cm nad podłogą, z barierką o wysokości 30 cm, szerokości 30 cm. Przymocuj belkę do stołu z przymocowaną barierą tak, aby 50 cm belki wystawało z bariery, z dala od stołu.
    2. Umieść amortyzowaną skrzynkę bezpieczeństwa pod belką, aby złagodzić wpływ spadających szczurów.
  2. Trening Beam-Balance
    1. Na 24-48 godzin przed zabiegiem umieść szczura na belce na próbę 60 sekund.
    2. Jeśli szczur nie jest w stanie samodzielnie utrzymać równowagi, pozwól szczurowi wpaść do pudełka bezpieczeństwa.
    3. Rozpocznij odmierzanie czasu, gdy szczur jest bezpiecznie umieszczony na belce.
    4. Obserwuj szczura przez okres 60 s i oceń jego zachowanie w oparciu o następującą skalę: 1 = Wykazuje stabilną równowagę (stajenny, chodzi, próby wejścia na barierę), 2 = Wykazuje chwiejną równowagę (chwyta boki belki i/lub ma niestabilne ruchy), 3 = Próbuje utrzymać równowagę, ale ślizga się lub obraca na belce, zawiesza się, przytulając się do belki, 4 = Próbuje utrzymać równowagę, ale upada po 10 s, 5 = Zwisa nad belką lub z belki i spada w czasie krótszym niż 10 sekund, 6 = Spada, nie próbując utrzymać równowagi ani zawiesić się na belce.
    5. Zapisz wynik w arkuszu.
    6. Pozwól szczurowi odpocząć przez 15 sekund w klatce domowej, a następnie powtarzaj kroki 3.2.1-3.2.5, aż szczur osiągnie trzy wyniki 1 lub 2. Szczur jest wtedy uważany za wyszkolonego.
    7. Wykonaj jedną ocenę wstępną po 24 godzinach lub w dniu zabiegu przed zabiegiem.
  3. Testowanie wyważenia belki
    1. Zaczynając 24 godziny po zabiegu i kontynuując przez okres do 4 dni, testuj szczury codziennie.
      1. Umieść szczura na belce i uruchom stoper. Obserwuj uważnie szczura przez 60 sekund. Zapisz wynik w arkuszu.
      2. Zwróć szczura do klatki domowej na krótki okres odpoczynku (1-3 min).
      3. Powtórzyć kroki 3.3.1.1-3.3.1.2, aby uzyskać łącznie trzy badania.

4. Trening i testowanie chodzenia po belkach

  1. sprzęt
    1. Użyj drewnianej belki o długości 100 cm, szerokości 2,5 cm i wysokości 4,0 cm.
    2. Przygotuj regulowany stojak, regulowany stół i cztery kołki o wysokości 2 cm oraz czarną skrzynkę na bramkę o długości 28 cm, wysokości 18 cm i szerokości 18 cm, z otworem na jednym końcu wystarczająco dużym, aby szczur mógł przez niego przejść.
    3. Przymocuj docelowy koniec belki do otwartej strony skrzynki na bramki, która jest umieszczona na regulowanym stole. Umieść generator jasnego światła i białego szumu w pobliżu początkowego końca wiązki. Początkowy koniec belki jest przymocowany do regulowanego stojaka tak, aby belka i skrzynka znajdowały się na tym samym poziomie, około 1 m nad podłogą.
  2. Trening Beam-Walk
    1. Rozpocznij trening 24-48 godzin przed zabiegiem.
    2. Umieść szczura w pudełku na bramkę na 1 minutę. Po 1 minutach usuń szczura i rozpocznij próbę.
    3. Aby rozpocząć próbę, włącz światło i biały szum i umieść szczura na belce w miejscu otworu na kołek najbliżej pola bramki i pozwól szczurowi wejść do skrzynki bramkowej.
    4. Gdy przednie łapy szczura przekroczą próg pola bramkowego, natychmiast wyłącz źródła światła i hałasu (to koniec jednej próby).
    5. Pozwól szczurowi odpocząć w pudełku z bramkami przez 30 sekund między każdą próbą.
    6. Powtórz procedurę opisaną w kroku 4.2.3-4.2.5 dwa razy w każdym miejscu kołków i od pozycji wyjściowej. Włóż kołki w otwory i przeprowadź jeden pełny spacer po belce z kołkami na miejscu.
    7. Wykonaj trzy próby chodzenia po belce z pomiarem czasu.
      1. Usuń szczura z pudełka na bramkę. Włącz światło i biały szum i uruchom stoper po umieszczeniu szczura na belce. Zatrzymaj stoper natychmiast, gdy przednie łapy szczura przekroczą próg pola bramkowego, a następnie natychmiast wyłącz światło i hałas.
      2. Zapisz czas w arkuszu.
      3. Powtarzać kroki 4.2.7.1-4.2.7.2, aż szczur osiągnie trzykrotny czas 5 s lub mniej. Szczur jest teraz uważany za wyszkolonego.
  3. Ocena linii bazowej Beam-Walk
    1. W dniu lub rano przed zabiegiem wykonaj trzy próby czasowe z założonymi kołkami.
    2. Zacznij od umieszczenia szczura w skrzynce na bramkę na 30 sekund. Usuń szczura z pudełka na bramkę i włącz biały szum i światło. Umieść szczura na początkowym końcu belki i jednocześnie uruchom stoper. Gdy przednie łapy szczura przekroczą próg pola bramkowego, natychmiast wyłącz źródła światła i hałasu oraz zatrzymaj stoper.
    3. Zapisz czas w arkuszu. Pozwól szczurowi pozostać w skrzynce bramkowej przez 30 sekund.
    4. Powtarzaj kroki 4.3.2-4.3.3, aż w arkuszu zostaną zarejestrowane trzy opóźnienia. Zwróć szczura do klatki domowej po wykonaniu trzech prób z pomiarem czasu.
  4. Testowanie Beam-Walk
    1. Testuj szczury codziennie, zaczynając 24 godziny po zabiegu i kontynuując przez okres do 4 dni. Wykonaj trzy próby z pomiarem czasu, jak w krokach 4.3.

5. Pamięć robocza Labirynt wodny

  1. sprzęt
    1. Używać zbiornika wypełnionego wodą do wysokości 28 cm i utrzymywanego w temperaturze 26 ± 1 °C.
    2. Użyj platformy z przezroczystego szkła akrylowego o średnicy 10 cm na stojaku o wysokości 26 cm.
      UWAGA: Górna powierzchnia platformy powinna być pokryta silikonem w kształcie koła z X w poprzek. Dzięki temu szczury mogą wspiąć się na platformę i zapewniają im przyczepność, dzięki czemu nie ześlizgują się.
    3. Zbierz stoper, lampę grzewczą, jednorazowe ręczniki, chłonne wkładki, dodatkowe klatki i małą siatkę akwariową z długą rączką. Użyj skomputeryzowanego systemu śledzenia wideo, który jest podłączony do kamery wideo, aby nagrać pływającego szczura i wysłać dane do komputera. Zapisz wideo i dane na komputerze do późniejszej analizy.
  2. Testowanie labiryntu wodnego pamięci roboczej
    1. Daj szczurom cztery pary prób każdego dnia przez pięć kolejnych dni, umieść platformę w każdym z czterech kwadrantów i rozpocznij szczury od każdego z czterech punktów początkowych (N, S, E, W), jak opisano poniżej.
    2. Najpierw zdefiniuj pary lokalizacja-platforma początkowa, które mają być używane w całym eksperymencie.
      UWAGA: Kolejność kwadrantów, w których znajduje się platforma, i używany punkt początkowy muszą być w innej kolejności dla każdego z pięciu dni pływania, ale taka sama dla każdego szczura.
      1. Użyj czterech punktów początkowych (N, S, E lub W) i czterech lokalizacji platform (ćwiartki 1, 2, 3 lub 4; Rysunek 1). Na przykład (N, 2; E, 4; S, 1; W, 3; patrz Rysunek 1). Zaplanuj zrównoważoną kolejność (nie losową), aby uniknąć punktów początkowych zbyt blisko platform (żaden punkt początkowy nie znajduje się w tym samym kwadrancie co lokalizacja platformy). Skonfiguruj arkusz danych, korzystając z kwadrantów platformy i czterech punktów początkowych.
      2. Napisz protokół, który będzie używany przez oprogramowanie do śledzenia wideo w celu filmowania pływających szczurów i zbierania określonych danych (np. czasu pływania, prędkości, odległości przebytej przed znalezieniem platformy).
        UWAGA: Oprogramowanie śledzące automatycznie zatrzyma nagrywanie po określonym czasie. Protokół powinien umożliwiać określenie, gdzie znajduje się platforma, ile prób należy przeprowadzić na jedno zwierzę i ile zwierząt zostanie przebadanych podczas sesji, a także maksymalny dozwolony czas trwania (np. 120 s).
      3. Przetestuj 4-6 szczurów na sesję.
        UWAGA: Więcej niż 6 szczurów stwarza problem w synchronizacji między szczurami i może prowadzić do błędu przewodnika. Pudełka grzewcze również stają się zatłoczone.
    3. Próba 1
      1. Otwórz oprogramowanie do śledzenia wideo i załaduj odpowiedni protokół, w tym mapę labiryntu wodnego.
      2. Umieść platformę w wyznaczonym miejscu (np. 2; Rysunek 1) i sprawdź, czy jest zgodna z mapą w oprogramowaniu. Przygotuj oprogramowanie śledzące do uruchomienia, gdy szczur znajdzie się w polu widzenia kamery wideo.
      3. Umieść szczura w zbiorniku przodem do ściany w wyznaczonym miejscu (np. N; Rysunek 1) i natychmiast uruchom stoper.
      4. Pozwól szczurowi 120 s znaleźć platformę. Gdy szczur znajdzie platformę, zatrzymaj minutnik i zapisz czas w arkuszu. Jeśli szczur nie znajdzie platformy, zaprowadź go na platformę ręcznie i nagraj 120 sekund. Pozwól szczurowi pozostać przez 15 s na platformie.
    4. Próba 2
      1. Sprawdź, czy oprogramowanie jest gotowe do wersji próbnej 2. Umieść szczura z powrotem w zbiorniku w tej samej pozycji początkowej (N). Powtórzyć krok 5.2.3.4.
    5. Po próbie 2 umieść szczura w ogrzewanej komorze na 4 minuty. Przenieś platformę do drugiej lokalizacji (4; Rysunek 1) i sprawdź, czy gra pasuje do mapy w oprogramowaniu.
    6. Powtarzaj procedury próby 1 i 2 (kroki 5.2.3-5.2.4), aż wszystkie cztery pary miejsca startowego/platformy zostaną zakończone.

6. Analiza danych

  1. Neuroscore (Neuroscore)
    1. Ręczne przenoszenie wyników pisma ręcznego do komputerowego arkusza kalkulacyjnego.
    2. Zsumuj wyniki każdego badania, aby uzyskać trzy wyniki na szczura każdego dnia.
    3. Formatowanie danych do analizy statystycznej (w długim lub szerokim formacie, w zależności od preferencji oprogramowania).
      UWAGA: Długi format zawiera pojedynczą kolumnę dla leczenia (w tym przypadku wypełnioną "Naiwny", "Pozorny" lub "TBI"), pojedynczą kolumnę dla dnia (w tym przypadku "0", "1", "2" lub "3") i pojedynczą kolumnę dla próby ("1", "2" lub "3"). Szeroki format zawiera jedną kolumnę dla każdej kombinacji poziomów czynników (czyli jedną kolumnę dla naiwnych, dzień 0, próba 1, inna kolumna dla naiwnych, dzień 0, próba 2 itd.)
    4. Uśrednij wynik dla każdego zwierzęcia w każdym dniu. Ponieważ każdego dnia przeprowadzono trzy próby, dla każdego zwierzęcia dziennie będą obowiązywały trzy wartości.
    5. Oceń, czy dane mają rozkład normalny. Użyj nieparametrycznego testu statystycznego (np. testu Kruskala-Wallisa), aby przeanalizować, czy wynik w każdym dniu jest różny w różnych grupach. W tym przypadku, ponieważ dane te nie są ciągłe, nie mają rozkładu normalnego.
    6. Aby określić, gdzie leżą różnice, wykonaj testy post-hoc, takie jak analiza post-hoc Tukeya.
      UWAGA: W tym przypadku użyto pakietu oprogramowania statystycznego R16, funkcji Kruskal.test() i funkcji posthoc.kruskal.nemenyi.test w pakiecie Pairwise Multiple Comparison of Mean Ranks Package (PMCMR)17.
    7. Dodatkowo sprawdź, czy są jakieś różnice między dniami w każdej grupie.
      UWAGA: Na przykład, aby sprawdzić, czy zwierzęta SHAM zachowują się inaczej w dniu 0 w porównaniu z dniem 1, dniem 2 lub dniem 3. W tym celu uruchom jednokierunkową powtarzaną synchronizację pomiarów. Można to osiągnąć w języku R za pomocą funkcji ezANOVA w pakiecie ez.
    8. Aby uruchomić powtarzaną pomiary ANOVA, najpierw sprawdź założenie dotyczące sferyczności.
      UWAGA: W tym przypadku dane wskazują, że współczynnik wewnętrzny (dzień) spełnia założenie sferyczności dla NAÏVE i SHAM, ale nie dla TBI. Tak więc korekta nie jest konieczna dla NAÏVE lub SHAM. W przypadku danych TBI należy użyć poprawki Greenhouse'a-Geissera.
    9. Jeśli zostaną znalezione znaczące różnice, uruchom test post-hoc, aby określić, gdzie leżą różnice. Osiąga się to w R za pomocą funkcji testu t parami. Wykreśl wyniki jako wykres pudełkowy, jak pokazano na reprezentatywnych wynikach (Rysunek 2).
  2. Balans belki
    1. Ręcznie przenieś odręczne wyniki do komputerowego arkusza kalkulacyjnego. Formatowanie danych do analizy statystycznej (w długim lub szerokim formacie, w zależności od preferencji oprogramowania). Patrz uwaga w kroku 6.1.3.
    2. Uśrednij wyniki dla każdego szczura każdego dnia, tak aby każdy szczur miał jeden wynik dziennie. Aby sprawdzić, czy wynik w każdym dniu jest różny między NAÏVE, SHAM i TBI, oceń, czy dane mają rozkład normalny.
      UWAGA: W tym przypadku, ponieważ dane nie są ciągłe, dane te nie mają rozkładu normalnego. Dlatego należy stosować nieparametryczny test statystyczny (np. test Kruskala-Wallisa).
    3. Aby określić, gdzie leżą różnice, wykonaj testy post-hoc, np. analizę post-hoc Tukeya. Aby sprawdzić różnice między dniami w każdej grupie leczonej, należy przeprowadzić jednoczynnikową ANOVA powtarzanych pomiarów (patrz krok 6.1.7). Sprawdź założenie dotyczące kulistości.
      UWAGA: W tym badaniu dane wskazują, że współczynnik wewnętrzny (dzień) nie spełnia założenia kulistości dla żadnej z grup, dlatego zastosowano poprawki ciągłości. Użyj korekcji ciągłości Greenhouse'a-Griera.
    4. Wykreśl wyniki na wykresie pudełkowym, jak pokazano na reprezentatywnych wynikach (Rysunek 3).
  3. Spacer po belce
    1. Ręczne przenoszenie wyników odręcznych do komputerowego arkusza kalkulacyjnego. Uśrednij trzy opóźnienia Beam-Walk dla każdego zwierzęcia na każdy dzień. Sformatuj dane do analizy statystycznej (patrz krok 6.1.3).
    2. Oceń, czy dane mają rozkład normalny.
      UWAGA: W tym przypadku dane są ciągłe i mają rozkład normalny. W związku z tym należy użyć jednokierunkowej analizy ANOVA, aby określić, czy opóźnienie każdego dnia jest różne między Naïve, SHAM i TBI.
    3. Aby sprawdzić, czy istnieje jakakolwiek różnica między dniami w grupie leczonej, należy przeprowadzić jednokierunkowe powtarzane pomiary ANOVA. Najpierw sprawdź założenie dotyczące kulistości.
      UWAGA: W tym badaniu dane wskazują, że współczynnik wewnętrzny (Day) nie spełnia założenia kulistości dla żadnej z naszych grup, dlatego stosuje się poprawki ciągłości. Użyj poprawki Greenhouse-Grier.
    4. Wykreśl wyniki na wykresie pudełkowym, jak pokazano na reprezentatywnych wynikach (Rysunek 4).
  4. Pamięć robocza labirynt wodny
    1. Przenieś dane z arkusza roboczego lub komputerowego programu śledzącego do arkusza kalkulacyjnego. Wybierz wyniki do analizy.
      UWAGA: Wiele możliwych wyników jest dostępnych do analizy z komputerowych programów śledzących. Przykłady wyników wybranych do analizy mogą obejmować: opóźnienie, długość ścieżki, tigmotaksję i prędkość pływania. Najczęściej zgłaszanym wynikiem jest opóźnienie, zgodnie z podanym przykładem.
    2. Formatowanie danych do analizy statystycznej (w długim lub szerokim formacie, w zależności od preferencji oprogramowania).
      UWAGA: Długi format zawiera pojedynczą kolumnę dla leczenia (w tym przypadku wypełnioną "Naïve", "Sham" lub "TBI"), pojedynczą kolumnę dla dnia (w tym przypadku "1", "2", "3", "4" lub "5") i pojedynczą kolumnę dla próby ("1", "2", "3", "4", "5", "6", "7" lub "8"). Potrzebna jest nam również dodatkowa kolumna identyfikująca próbę ("1" lub "2"). Format duży zawiera jedną kolumnę dla każdej kombinacji poziomów czynników (na przykład jedna kolumna dla opcji Naiwny, dzień 1, próba 1, próba 1, kolejna kolumna dla opcji Naiwny, dzień 1, próba 2, próba 2). Ponadto różnica między Próbą 1 a Próbą 2 może być obliczana dla każdej sesji i analizowana jako wynik różnicy.
    3. Aby sprawdzić, czy istnieje ogólna różnica między grupami urazów, wykonaj następujące czynności.
      1. Najpierw uśrednij opóźnienie labiryntu wodnego dla każdego zwierzęcia dla dnia 1,
        UWAGA: Każdego dnia odbywały się cztery sesje, więc uśrednij cztery wartości na zwierzę dla każdej z Próby 1 i Próby 2. Wykonaj to obliczenie również dla pozostałych dni.
      2. Aby sprawdzić ogólne różnice w obrażeniach, uruchom dwukierunkową powtarzaną analizę ANOVA. Są dwa czynniki, kontuzja i dzień. Kontuzja jest czynnikiem pośrednim, a dzień jest czynnikiem wewnątrzgrupowym. Uwaga: Tutaj użyto R.
      3. Jeśli wyniki wskazują na znaczącą różnicę spowodowaną kontuzją, uruchom test post-hoc Tukeya, aby zobaczyć, gdzie leżą różnice.
    4. Aby dowiedzieć się, czy istnieją różnice między grupami urazów w poszczególnych dniach, wykonaj następujące czynności.
      UWAGA: Dzień 1 jest używany jako przykład i tę samą analizę należy przeprowadzić dla wszystkich kolejnych dni. Ponadto analiza ta jest wykonywana na kilka sposobów, po pierwsze tylko dla Próby 1, po drugie tylko dla Próby 2, a po trzecie dla różnicy między Próbą 1 a Próbą 2. Jako przykład posłużono się próbą 1; Te same kroki należy zastosować w przypadku innych analiz.
      1. Po pierwsze, uśrednij opóźnienie labiryntu wodnego dla każdego zwierzęcia w dniu 1. Ponieważ każdego dnia odbyły się cztery powtórzenia "Próby 1", uśrednij cztery wartości dla każdego zwierzęcia.
      2. Oceń, czy dane mają rozkład normalny.
        UWAGA: W tym przypadku dane są ciągłe i mają rozkład normalny. Dlatego użyj jednokierunkowej ANOVA, aby określić, czy opóźnienie labiryntu wodnego w dniu 1 różni się między NAÏVE, SHAM i TBI. Wykorzystano tu pakiet oprogramowania statystycznego R oraz funkcję aov().
      3. Użyj 5% poziomu istotności. Jeśli wynikowa wartość p jest mniejsza niż 0,05, istnieją znaczne różnice między grupami.
      4. Aby określić, gdzie leżą te różnice, użyj testu post-hoc Tukeya. Jest to funkcja TukeyHSD() w R.
    5. Aby dowiedzieć się, czy istnieją różnice między dniami w grupach leczenia, wykonaj następujące kroki.
      1. Najpierw uruchom jednokierunkową powtarzaną wartość pomiarów ANOVA. Można to osiągnąć w języku R za pomocą funkcji ezANOVA w pakiecie ez.
      2. Przed uruchomieniem powtarzanych pomiarów ANOVA najpierw sprawdź założenie dotyczące sferyczności.
        UWAGA: Współczynnik wewnętrzny (dzień) spełnia założenie kulistości dla wszystkich grup, dlatego nie ma potrzeby stosowania poprawek ciągłości.
      3. Jeśli zostaną znalezione różnice między dniami (wartości p mniejsze niż 0,05), uruchom test post-hoc, aby dokładnie określić, gdzie leżą różnice. Ten krok jest wykonywany w języku R przy użyciu funkcji pairwise.t.test.
    6. Wykres wyników za pomocą wykresów liniowych (Rysunek 5). Można również przedstawić wykresy Próba 1-Próba 2.

Wyniki

Wyniki procedury neuroscore (Rysunek 2) wykazują zarówno potencjał do wystąpienia wyników fałszywie dodatnich (grupy SHAM i TBI w dniu 0), jak i czułość tego testu w wykrywaniu niewielkich różnic. Wyniki fałszywie dodatnie mogą wystąpić, gdy szczur nie jest odpowiednio przyzwyczajony do procedury, przez co nie jest w pełni zrelaksowany. Dzień 0 przypada przed operacją, zatem w idealnym przypadku wszystkie szczury powinny osiągnąć kryterium wyniku 0 przed przystąpieniem do badania. Dni 1–3 wykazują czułość tego testu w wykrywaniu niewielkich zmian w punktacji. Choć teoretycznie możliwy jest wynik aż do 21, wartości powyżej 3 są w tym modelu rzadkością. W tym przykładzie ANOVA z powtarzanymi pomiarami nie wykazała różnic między dniami dla grupy NAÏVE (p = 0,78) ani SHAM (p = 0,09); jednak w grupie TBI odnotowano różnice między dniami (p < 0,05). Porównania parzyste post-hoc wskazały, że dzień 0 różni się znacząco od dni 1, 2 i 3. Wynik ten dowodzi, że uraz spowodował niewielkie, lecz istotne zmiany w ocenie neurologicznej.

Dalsza analiza z wykorzystaniem testu Kruskala-Wallisa pozwoliła na porównanie grup NAÏVE, SHAM i TBI w każdym z dni, a następnie zastosowano test Tukeya post hoc test w celu dokładnego określenia, w czym tkwią różnice. Dla dnia 0 wartość statystyki testowej wyniosła 13,37, p = 0,001, a grupa SHAM różniła się istotnie od grupy NAÏVE (p = 0,008). W idealnym przypadku w dniu 0 nie powinno być różnic między grupami, ponieważ nie podano żadnych leków ani nie przeprowadzono żadnych procedur. W takim przypadku szczury powinny zostać poddane dalszej habituacji do procedury lub przeniesione do badania niebehawioralnego. W dniu 1 statystyka testowa wyniosła 32,39, p = 9,75e-8, przy czym post hoc test, wskazujący, że grupy SHAM i TBI różniły się istotnie od grupy NAÏVE (p = 0.002, p = 5,9e-7, odpowiednio). W przypadku drugiego dnia statystyka testowa wyniosła 23,39, p = 8,34e-6, a grupy SHAM i TBI różniły się od grupy NAÏVE (p = 0.002, p = 6,8e-5). W przypadku dnia 3. statystyka testowa wyniosła 38,4, p = 4,59e-9, a grupy SHAM i TBI istotnie różniły się od grupy NAÏVE (p = 0.001, p = 2,1e-8, odpowiednio). Wyniki te wskazują na fakt, że preparacja SHAM również powoduje pewne deficyty w ocenie neurologicznej w okresach wczesnych po urazie.

Reprezentatywne wyniki testu równowagi na belce (Rysunek 3) demonstrują czułość tego testu na deficyty krótko po urazie (Rysunek 3, lewo) oraz w punkcie czasowym znacznie później po urazie (Rysunek 3, prawo). Czułość testu równowagi na belce na skutki urazu mózgu zmniejsza się z upływem czasu, ponieważ wraz z wiekiem i przyrostem masy ciała szczurów nieurazowanych, trudniej im jest utrzymać równowagę na belce. W późniejszych punktach czasowych belkę obraca się tak, aby szczury balansowały na jej szerszej stronie. Niemniej jednak, 6 miesięcy po urazie test ten nie jest już czuły na skutki urazu, gdyż wiek i/lub masa ciała zakłócają zdolność do wykonania zadania (Rysunek 3, prawo). Alternatywnie, w układzie przedsionkowym mogło dojść do wygojenia, a dane te dokładnie odzwierciedlają fakt, że zdolność szczurów do utrzymania równowagi osiągnęła ten sam poziom co w grupach kontrolnych.

Do porównania grup Naïve, SHAM i TBI w każdym dniu wykorzystano test Kruskala-Wallisa. Wyniki dla punktów czasowych wczesnych etapów po urazie przedstawiono na Rycini 3, po lewej stronie. W dniu 0 test Kruskala-Wallisa wykazał wartość statystyki testowej równą 6,81, p = 0,033. Odnotowano istotną różnicę między grupami, a test post-hoc Tukeya wykazał, że grupa Naïve różniła się od grupy SHAM (p = 0,038); jednak we wszystkich trzech grupach średnie wartości znajdowały się znacznie poniżej 2,0, co wskazuje, że wszystkie szczury spełniły kryteria kontynuacji badania. Preferowane byłoby brak różnic między grupami w dniu 0, ale ponieważ we wszystkich grupach wartości są poniżej 2, mogą one kontynuować udział w badaniu. W PID 1 statystyka testu Kruskala-Wallisa wyniosła 69,72, p = 7,25e-16. Test post-hoc Tukeya wykazał, że grupa TBI różniła się istotnie zarówno od grupy Naïve, jak i grupy Sham (p = 4,9e-14 oraz p = 9,1e-08, odpowiednio). W dniu 2 statystyka testu Kruskala-Wallisa wyniosła 62,84 i p = 2,26e-14, a test post-hoc wykazał różnicę między TBI a grupami NAÏVE i SHAM (p = 1,0e-10 oraz p = 2,1e-10, odpowiednio). W dniu 3 statystyka testu Kruskala-Wallisa wyniosła 62,69 i p = 2,44e-14. Test post-hoc wykazał różnicę między TBI a grupami Naïve i SHAM (p = 9,6e-12 oraz p = 1,7e-08, odpowiednio). Dodatkowo sprawdzono, czy występują różnice między dniami w obrębie każdej grupy. Przy zastosowaniu ANOVA z powtarzanymi pomiarami, w grupie NAÏVE nie stwierdzono różnic między dniami (p = 0,367). W grupach SHAM i TBI stwierdzono różnice między dniami (p = 0,002 oraz p = 3,90e-29, odpowiednio). Porównania parowe post-hoc wykazały, że dla grupy SHAM dzień 1 różni się istotnie od dnia 2 i dnia 3 (p = 0,001 oraz p = 0,01, odpowiednio), a dla grupy TBI dzień 0 różni się istotnie od dni 1, 2 i 3 (p < 2e-16, p = 5,5e-16 oraz p = 2,7e-13, odpowiednio). Dzień 1 różni się również istotnie od dnia 3 (p = 0,036).

W 6. miesiącu po urazie, każdego dnia przeprowadzono porównania między grupami NAÏVE, SHAM i TBI przy użyciu testu Kruskala-Wallisa (Rysunek 3, po prawej). W dniu 0 wartość statystyki testowej wyniosła 3,36, a p = 0,187, zatem w dniu 0 nie odnotowano różnic. Wszystkie średnie wynosiły poniżej 2, co wskazuje, że wszystkie szczury i grupy spełniły kryteria kontynuacji udziału w badaniu. W 1. dniu po indukcji (PID 1) statystyka testowa wyniosła 6,11, p = 0,047; jednakże, post hoc analiza przy użyciu testu Tukeya post-hoc test wykazał, że żadna z grup nie różniła się istotnie po uwzględnieniu wielokrotnego testowania hipotez. W dniu 2. wartość statystyki testowej wyniosła 4,09, p = 0,13, ns, a w dniu 3. statystyka testowa wyniosła 2,91, p = 0,23, ns. Zatem w żaden z badanych dni nie stwierdzono różnic między grupami z urazami.

Dodatkowo, analizując różnice między dniami w obrębie grup badawczych, analiza ANOVA z powtarzanymi pomiarami wykazała istotne różnice między dniami dla grup NAÏVE, SHAM i TBI (p = 0.0003, p = 2.61e-5, p = 5.59e-7, odpowiednio; Rysunek 3, po prawej). Testy post-hoc wykazały następujące różnice. W grupie NAÏVE dzień 0 różnił się istotnie od dni 1, 2 i 3 (p = 0.002, p = 0.044, p = 0.004, odpowiednio). W grupie SHAM wszystkie dni różniły się od siebie istotnie: dzień 0 różnił się istotnie od dni 1, 2 i 3 (p = 0.0006, p = 0.001, p = 0.0006, odpowiednio); dzień 1 różnił się istotnie od dni 2 i 3 (p = 0.031, p = 0.0006, odpowiednio); a dzień 2 różnił się istotnie od dnia 3 (p = 0.044). W grupie TBI dzień 0 różni się istotnie od dni 1, 2 i 3 (p = 0.0005, p = 0.0008, p = 0.0005, odpowiednio).

Wyniki testu Beam-Walk przedstawiono dla dwóch punktów czasowych (Rysunek 4). Podobnie jak w przypadku testu Beam-Balance, test ten wykrywa deficyty wczesnej fazie po urazie (Rysunek 4, lewa strona). Jednakże 6 miesięcy po urazie nie występują już istotne różnice między grupami (Rysunek 4, prawa strona), co sugeruje, że w grupie z urazem nastąpiło gojenie. Wynik ten może odzwierciedlać wpływ większego wieku oraz zwiększonej masy ciała.

W celu porównania grup NAÏVE, SHAM i TBI w poszczególnych dniach wczesnej fazy po urazie zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). W dniu 0 nie stwierdzono różnic (F = 0.859, p = 0.426), a wszystkie czasy latencji wynosiły poniżej 5 s, co wskazuje, że wszystkie szczury spełniły kryteria kontynuacji badania. W dniu PID 1 uzyskano istotną statystykę testową wynoszącą 15,36, p = 1.18e-6. Test post hoc Tukeya wykazał istotną różnicę między grupą TBI a NAÏVE (p = 0.000004) oraz między grupą TBI a SHAM (p = 0.0001). W dniu 2 stwierdzono istotną różnicę między grupami (F = 9.49, p = 0.0002). Analiza post-hoc ujawniła różnice między grupą TBI a NAÏVE (p = 0.0002) oraz między grupą TBI a SHAM (p = 0.005). W dniu 3 ogólna statystyka testowa wyniosła 6,27, p = 0.0025, co wskazuje na występowanie różnic między grupami. Test post-hoc Tukeya wykazał, że ponownie grupa TBI różniła się od grup NAÏVE i SHAM (p = 0.003 oraz p = 0.035, odpowiednio).

Za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami zbadano różnice między dniami w obrębie grup badawczych. W pierwszej kolejności dla każdej grupy sprawdzono założenie sferyczności. Czynnik wewnątrzgrupowy (Dzień) nie spełniał założenia sferyczności dla grup NAÏVE lub SHAM, w związku z czym dla tych grup zastosowano korektę Greenhouse-Grier. W grupie SHAM nie stwierdzono różnic między dniami (p = 0,066), natomiast w grupach NAÏVE i TBI różnice były istotne (p = 0,006 oraz p = 2,89E-7, odpowiednio). Porównania post-hoc wykazały, że dla grupy NAÏVE różnica występowała między Dniem 0 a Dniem 1 (p = 0,003). Dla grupy TBI różnice odnotowano między Dniem 0 a Dniami 1, 2 i 3 (p = 9,2e-6, p = 0,0005, p = 0,002, odpowiednio), a także między Dniem 1 a Dniem 3 (p = 0,018).

W 6. miesiącu po urazie nie stwierdzono istotnych różnic między grupami NAÏVE, SHAM lub TBI w żadnym z dni (Dzień 0, F = 0,315, p = 0,732; Dzień 1, F = 0,336, p = 0,717; Dzień 2, F = 0,5, p = 0,61; Dzień 3, F = 1,17, p = 0,322; Rysunek 4, prawa strona). Porównując różnice między dniami w obrębie każdej grupy, odnotowano istotną różnicę w grupie TBI (p = 0,026), przy czym Dzień 0 różnił się od Dni 1, 2 i 3 (p = 0,026, p = 0,002, p = 0,002). W grupach NAÏVE oraz SHAM nie stwierdzono różnic między żadnymi dniami (p = 0,104 i p = 0,063, odpowiednio).

Dane z wersji labiryntu wodnego Morrisa badającej pamięć operacyjną można przedstawić na wykresach na kilka różnych sposobów. Poniżej prezentujemy wyniki dla okresu 3 miesięcy (Rycina 5, lewa strona) oraz 12 miesięcy (Rycina 5, prawa strona) po urazie, wykorzystując zarówno wykresy liniowe do przedstawienia przebiegu czasowego, jak i wykresy pudełkowe do zbiorczego podsumowania danych (Rycina 5, dół). Pozwala to na niezależną wizualizację porównań dla pierwszej próby (Trial 1) i drugiej próby (Trial 2) w każdym dniu, a także ogólnych różnic wynikających z urazu. Latencje w pierwszej próbie odzwierciedlają pamięć referencyjną, natomiast latencje w drugiej próbie obrazują pamięć operacyjną.

Dane uzyskane od szczurów 3 miesiące po urazie przedstawiono w Rysunek 5, lewa. Dla Próby 1 (Rysunek 5, górny lewy róg), w porównaniu grup NAÏVE, SHAM i TBI, tylko w 4. dniu odnotowano istotną różnicę między grupami (F = 4.12, p = 0,025), przy czym post-hoc test Tukeya wskazujący, że grupa TBI różniła się od grupy NAÏVE (p = 0,019). Dla próby 2 (Rysunek 5, środek po lewej), odnotowano istotną różnicę w dniu 1 (F = 5.93, p = 0,006), przy czym post hoc analiza wskazująca, że TBI różniło się od SHAM (p = 0,005). Analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami nie wykazała ogólnej różnicy między grupami z urazami w 3. miesiącu (p = 0,56). Wyniki te sugerują, że u szczurów tych występują niewielkie, lecz istotne deficyty pamięci referencyjnej oraz operacyjnej w 3 miesiącach po urazie.

W 12. miesiącu po urazie, podczas porównania grup NAÏVE, SHAM i TBI w Próbie 1 (Rysunek 5, prawo), ANOVA z powtarzanymi pomiarami wykazała istotny ogólny wpływ urazu (F = 3.94, p = 0.03). Porównania parowe ujawniły, że grupa TBI różniła się istotnie zarówno od grupy NAÏVE, jak i SHAM (p = 0.043 oraz p = 0.006, odpowiednio) (Rysunek 5, prawy dół). Dodatkowo, porównując grupy z urazem w każdym dniu za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, wykryto istotną różnicę w Dniu 3 (F = 7.28, p = 0.003). Porównanie post-hoc wykazało, że grupa TBI różniła się od grupy SHAM (p = 0.0018) (Rysunek 5, prawy górny róg). W Próbie 2 ANOVA z powtarzanymi pomiarami wykazała istotną różnicę wynikającą z urazu (F = 3.97, p = 0.029), a parowe porównania post-hoc wykryły różnicę między grupą TBI a SHAM (p = 0.017) (Rysunek 5, prawy dół). Jednoczynnikowa ANOVA przeprowadzona dla każdego dnia wykazała istotne różnice w Dniu 2 i 4. W Dniu 2 (F = 4.02, p = 0.028) test post-hoc Tukeya wykazał, że grupa TBI różniła się od grupy SHAM (p = 0.023). W Dniu 4 (F = 4.12, p = 0.026) analiza post-hoc wykazała różnicę między grupą TBI a SHAM (p = 0.025) (Rysunek 5, prawy środek).

Schemat róży wiatrów z czterema ponumerowanymi punktami wskazującymi kierunki N, E, S, W.
Rycina 1. Schemat labiryntu wodnego. Ten schemat przedstawia możliwe lokalizacje platformy (1, 2, 3, 4) oraz punkty startowe (N, S, E, W) w labiryncie wodnym Morrisa do badania pamięci operacyjnej. Szczurom przysługują dwie próby dla każdej pary lokalizacji startowej i platformy. Między próbami zachowany jest 15 s odstępu, a między parami prób następuje 4 min odpoczynku w komorze ogrzewającej; łącznie przeprowadzanych jest cztery pary prób podczas każdej codziennej sesji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący wyniki grup naive, sham i TBI w ciągu trzech dni po urazie; wyniki analizy statystycznej.
Rysunek 2. Wyniki testu neuroscore. Wszystkie szczury zostały przeszkolone w prostych zadaniach testowania odruchów przed dniem 0 (szczegóły dotyczące treningu, testowania i punktacji opisano w tekście). Wyniki przedstawiono jako medianę (czarna linia), pierwszy i trzeci kwartyl (granice prostokąta) oraz 10ty i 90ty percentyl (słupki błędów). Średnią zaznaczono czerwonymi liniami, a wartości odstające czarnymi kropkami. Dane przedstawiono dla poziomu bazowego w dniu 0 oraz dla dni 1–3 po urazie. Wyniki testu post-hoc t dla każdego punktu czasowego zaznaczono na wykresach: * p < 0.001 vs TBI dzień 0; ^ p < 0.001 vs grupa NAÏVE w tym samym dniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wykresów pudełkowych wyników regeneracji po TBI; przedstawia dane z okresu od 0-3 dni oraz 6 miesięcy po urazie.
Rycina 3. Wyniki testu Beam-Balance. Wszystkie szczury były trenowane w utrzymywaniu równowagi na belce do momentu, aż były w stanie zachować ją przez 60 s w trzech kolejnych próbach (szczegóły dotyczące treningu, testowania i punktacji znajdują się w tekście). W kolejnych testach szczury oceniano w skali od 1 do 6, gdzie 1 oznaczało prawidłową równowagę, a 6 brak prób utrzymania się na belce. Wyniki przedstawiono jako medianę (czarna linia), pierwszy i trzeci kwartyl (granice pudełka) oraz 10th i 90th percentyl (słupki błędów). Średnia jest również zaznaczona czerwonymi liniami, a wartości odstające czarnymi kropkami. Dane przedstawiono dla wyniku bazowego w dniu 0, dni 1-3 po urazie (lewa strona) oraz 6 miesięcy po urazie (prawa strona). Wyniki testu post-hoc t dla każdego punktu czasowego są przedstawione na wykresach. Dla dni 0-3: * p < 0.001vs TBI Day 0; ^ p < 0.001 vs ta sama doba NAÏVE; @ p < 0.001 vs ta sama doba SHAM. Dla 6 miesięcy: * p < 0.001vs TBI Day 0; # p < 0.001 vs NAÏVE Day 0; & p < 0.001 vs SHAM Day 0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres pudełkowy wyników po urazie porównujący grupy: naiwną, pozorowaną i TBI w czasie; dane eksperymentalne.
Rycina 4. Wyniki testu Beam-Walk. Wszystkie szczury zostały przeszkolone w pokonywaniu belki, lawirując między słupkami, aby dostać się do skrzynki bezpieczeństwa. Trening trwał do momentu spełnienia kryterium ≤ 5 s w trzech kolejnych próbach (szczegóły dotyczące treningu, testowania i punktacji znajdują się w tekście). Testy bazowe przeprowadzono w dniu 0, a następnie szczury testowano w dniach 1–3 po urazie (po lewej). Podgrupa szczurów została ponownie przebadana 6 miesięcy po urazie (po prawej). Wyniki przedstawiono jako medianę (czarna linia), pierwszy i trzeci kwartyl (granice pudełka) oraz 10th i 90th percentyle (słupki błędów). Średnią zaznaczono czerwonymi liniami, a wartości odstające czarnymi kropkami. Wyniki testów post-hoc dla każdego punktu czasowego są przedstawione na wykresach. Dla dni 0–3: * p < 0.001 względem TBI dzień 0; ^ p < 0.001 względem grupy NAÏVE w tym samym dniu; @ p <0.001 względem grupy SHAM w tym samym dniu; dla 6 miesięcy: * p < 0.001 względem TBI dzień 0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy wydajności poznawczej; latencja względem prób po TBI, obejmujące grupy naive, sham i TBI.
Rycina 5. Wyniki testu pamięci operacyjnej w wodnym labiryncie Morrisa. Wyniki przedstawiono dla osobnych grup szczurów w 3. miesiącu (lewa kolumna) i 12. miesiącu (prawa kolumna). Górne panele przedstawiają średnie latencje (czas, w jakim szczury odnalazły ukrytą platformę) podczas pierwszych prób w parowaniu dwupróbny dla każdego z pięciu dni testowania. Środkowe panele przedstawiają średnie latencje podczas drugich prób każdego dnia. Wyniki analizy post-hoc są zaznaczone na wykresach (* p < 0.05 względem grupy SHAM w tym samym dniu; ^ p < 0.05 względem grupy NAÏVE w tym samym dniu). Dolne panele podsumowują wyniki, przedstawiając medianę (czarna linia), 25.th i 75.th percentyl (granice pudełka) oraz 10.th i 90.th percentyl (słupki błędów). Średnią zaznaczono czerwonymi liniami, a wartości odstające czarnymi kropkami. Wyniki analizy post-hoc są zaznaczone na wykresach (*p < 0.05 względem grupy SHAM w tej samej próbie, ^ p < 0.05 względem grupy NAÏVE w tej samej próbie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Podczas przeprowadzania wszelkiego rodzaju testów behawioralnych bardzo ważne jest, aby być konsekwentnym. Ten szczegół zawiera wiele czynników, które wydają się nieistotne, ale mają duży wpływ na reakcję zwierzęcia. Ważnym krokiem, którego nie można pominąć, jest aklimatyzacja zwierząt do ich domowej klatki/pomieszczenia przed jakimkolwiek eksperymentem. Preparat ten zmniejsza skutki fizjologicznej reakcji zwierząt na stres, co może zmienić wyniki behawioralne18. Podobnie, absolutnie konieczne jest dołożenie wszelkich starań, aby obchodzić się ze wszystkimi zwierzętami w ten sam sposób. Spójność ta obejmuje, jak wspomniano wcześniej, aklimatyzację do pomieszczeń, a także aklimatyzację do obsługi i transportu między pomieszczeniami przed szkoleniem lub testami. Tej koncepcji nie można przecenić. Niechlujne obchodzenie się ze zwierzętami ma katastrofalne skutki dla wszelkich testów behawioralnych19. Podobnie, należy dołożyć wszelkich starań, aby badać zwierzęta o tej samej porze dnia, zarówno w ich ciemnym, jak i jasnym cyklu. W przypadku omawianych tutaj testów, testowanie w fazie jasnej lub ciemnej jest dopuszczalne, o ile testy są wykonywane konsekwentnie. Wykazano, że testy przeprowadzone w różnych momentach cyklu okołodobowego zmieniają wyniki behawioralne18,20. Dodatkowo przewodnik, jak i zwierzę muszą być w stanie bezstresowym, spokojnym, aby zmaksymalizować dokładność wyników.

Szczególnie w przypadku Neuroscore powszechne są wyniki fałszywie dodatnie i ujemne. Wyniki fałszywie dodatnie zwykle występują, gdy zwierzę nie jest w pełni przyzwyczajone do obsługi i testowania. Zwierzę musi być całkowicie zrelaksowane, aby obserwowana reakcja była odruchowa, a nie spowodowana napięciem mięśni w wyniku reakcji ze stresu lub strachu. Spięty przewodnik może wpływać na wyniki, przenosząc stres na zwierzę. Dlatego trzymanie szczura zbyt mocno lub zbyt luźno może być problematyczne. Dodatkowo, jeśli treser jest zdenerwowany, może to zakłócić reakcję szczurów. Istnieje również ryzyko, że niedoświadczony obserwator źle zinterpretuje reakcję szczura. Dobre szkolenie i dużo praktyki są niezbędne do sukcesu i spójności Neuroscore.

Ogólnie rzecz biorąc, głównym problemem związanym z tymi testami jest brak dużej różnicy, a czasem brak różnicy między grupami leczonymi. Ponieważ zwierzęta mogą różnie reagować na różnych opiekunów, hałasy, pory dnia i potencjalniepory roku 21, należy dołożyć wszelkich starań, aby zredukować wszystkie możliwe czynniki zakłócające.

Przedstawione tutaj wyniki zadań Beam-Balance i Beam-Walk pokazują, że testy te są przydatne wcześnie po urazie do wykrywania deficytów w funkcji przedsionkowo-motorycznej. Deficyty te zwykle ustępują z czasem 1,14. W tym modelu, w ciągu 6 miesięcy od urazu, deficyty wywołane kontuzją ustąpiły. Wyniki 6-miesięcznego punktu czasowego wskazują, że nie ma różnic między szczurami naiwnymi, pozorowanymi lub rannymi; Jednak wszystkie szczury odpoczywają w swoich domowych klatkach od 6 miesięcy, starzejąc się i przybierając na wadze. W związku z tym, zanim zostaną ponownie przetestowane po 6 miesiącach od operacji (lub równoważne w przypadku NAIVE), zasadniczo stają się stare i grube, a zatem wszystkie grupy nie radzą sobie tak dobrze, jak w porównaniu z ich wyjściowymi wynikami z dnia 0.

Inną ważną kwestią jest to, że zastosowany test zachowania jest prawidłowym testem. Na przykład uważa się, że zastosowane tutaj testy reprezentują funkcję określonych obszarów mózgu. Jednym z przykładów jest układ przedsionkowy, który jest ważny dla równowagi. Obszary mózgu zaangażowane w funkcje sensomotoryczne, takie jak kora, w tym kora sensomotoryczna, wzgórze, neurony korowo-rdzeniowe, zwoje podstawy, prążkowie nigro-prążkowiowe, by wymienić tylko kilka, są zaangażowane w koordynację przedsionkowo-ruchową. Tak więc deficyty w Beam-Balance lub Beam-Walk wskazują na potencjalne deficyty w tych obszarach. Ponadto hipokamp i kora przedczołowa są zaangażowane w funkcje uczenia się i pamięci testowane przez labirynt wodny pamięci roboczej. Nawet jeśli zostanie wybrany właściwy test, należy pamiętać o ograniczeniach zastosowanych testów. Na przykład żaden z przedstawionych tutaj testów nie jest wrażliwy na deficyty nastroju, takie jak depresja, lęk lub interakcje społeczne, takie jak agresja, podejmowanie decyzji lub impulsywność. Powtórzmy, konieczne jest wybranie odpowiedniego testu dla ocenianego zachowania i obszaru mózgu.

Do interpretacji i analizy danych behawioralnych należy podchodzić z ostrożnością. Zdecydowanie zaleca się dołączanie analiz mocy dla każdego rodzaju testu osobno, ponieważ użycie wyniku behawioralnego jako miary deficytu neuronalnego jest ze swej natury surową miarą subtelnego efektu. Ponadto różne testy wymagają różnych rodzajów analiz statystycznych. Na przykład opisane testy Neuroscore i Beam-Balance są zależne od interpretacji wyszkolonego obserwatora, który ocenia zachowanie za pomocą skali porządkowej. Tego typu dane nie są ciągłe i nie mają rozkładu normalnego, dlatego należy stosować statystyki nieparametryczne, takie jak test Kruskala-Wallisa, jak wykazano w sekcjach 6.1 i 6.2. Alternatywnie, testy Beam-Walk i labiryntu wodnego pamięci roboczej dają dane, które są ciągłe i mają rozkład normalny, dzięki czemu można stosować statystyki parametryczne, takie jak jednoczynnikowa ANOVA lub dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami, jak pokazano w sekcjach 6.3 i 6.4.

Przedstawione tutaj zadania behawioralne przetrwały próbę czasu i dają powtarzalne wyniki, szczególnie w połączeniu z modelem FPI u szczurów, chociaż istnieje wiele innych metod testów behawioralnych pod kątem uszkodzenia mózgu. Neuroscore to krótka ocena wykonywana przy użyciu minimalnego sprzętu. Dostępne są inne testy odruchów i siły, które można włączyć do oceny neurologicznej, takie jak zadanie pulsacji bocznej, test akinezji, test pochyłej płaszczyzny i siła chwytu (patrz Fujimoto i wsp.22 oraz Gold i wsp.23). Opisane zadania Beam-Balance i Beam-Walk są miarami deficytów przedsionkowo-ruchowych po urazie. Koordynacja przedsionkowo-ruchowa może być uważana za jedną z miar dużego zachowania lokomotorycznego, podczas gdy inne miary dużych deficytów lokomotorycznych obejmują Rotarod, obracający się biegun i aktywność w otwartym polu. Zdolność pływania, mierzona jako prędkość pływania podczas labiryntu wodnego, jest również wskaźnikiem dużej koordynacji ruchowej22,23. Zadanie labiryntu wodnego pamięci roboczej uzupełnia ten zestaw testów, wykrywając zarówno deficyty pamięci referencyjnej (wskazane przez Próbę 1), jak i deficyty pamięci roboczej (wskazane przez Próbę 2 lub różnicę między Próbą 1 a Próbą 2). Inne miary funkcji poznawczych obejmują ośmioramienny labirynt promieniowy, labirynt Barnesa, nowy test rozpoznawania obiektów i różne odmiany labiryntu wodnego. Warianty te obejmują oryginalny labirynt wodny Morrisa i labirynt Lashley III (ponownie patrz Fujimoto i wsp.22 oraz Gold i wsp.23). Ten zestaw testów okazał się przydatny na wczesnym etapie po urazie i, w różnym stopniu, do 12 miesięcy po urazie1.

Dodatkowo przedstawione tutaj zadania można stosować z różnymi szczepami, płcią i wiekiem szczurów; Może jednak zaistnieć potrzeba dostosowania do różnych rozmiarów i w przypadku większej kruchości. Na przykład starsze, cięższe szczury potrzebują szerszej wiązki do zadania Beam-Balance, a stare, wątłe szczury mogą potrzebować krótszego czasu pływania w labiryncie wodnym. W związku z tym istnieje możliwość elastyczności w tych testach i możliwości opracowania nowych testów w celu uwzględnienia różnych sytuacji i hipotez.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Ianowi Boldingowi za pomoc w chirurgicznym przygotowaniu tematów oraz Elizabeth Sumner za jej skrupulatną edycję. Badania te zostały przeprowadzone w ramach zespołu finansowanego przez The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczury Sprague-DawleyCharles Rivers Laboratories
251 Ballardvale St
Wilmington, MA 01887-1096
Telefon: 800-522-7287		Szczury CD-IGS, kod szczepu 001samiec, albinos, 300-350g po przyjeździe
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Beam-Balance
Belkadrewniana do domu, 25" dł. x 1" wys. x 3/4" szer. uszczelniona lakierem poliuretanowym
Zacisk CHome Depot1422-C2 1/2"
barierowyHome Depot, 18" x 17 1/2"
stół (zarówno do BB, jak i BW)ogólne zaopatrzenie37" h x 30" w x 60" l
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Beam-Walk
Beamdom zbudowanyDrewno 38-1/2" L x 1-3/4" H x 1" W uszczelnione lakierem poliuretanowym (~ 37" poza podłogą)
Escape BoxHome BuiltWoodpainted Black 12 1/2 " L x 9" h x 7-1/4" W
Gwoździe (kołki)2"
Zaciski
Biała
maszynaszumowaSan Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Telefon: (858)530-2600		http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
lightHome Depot
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Morris Water Maze< / strong>
basenu z włókna szklanegonieznany
(podobny do tego wyprodukowanego przez SDI)San Diego Instruments7000-072372" średnica x 30" głębokość (~ 500 galonów)
platforma z pleksiręcznie wykonana przez Maggie ParsleyŚrednica 10 cm, wysokość 26 cali z silikonem nałożonym na powierzchnię platformy, aby zapewnić powierzchnię chwytną
(podobną do tej wykonanej przez SDI)SDI7500-0272
pudełka dla zwierząt z pleksi z pokrywkamiWarsztat2 pudełka, 10 "szer. x 16" dł. x 9 "wys
punktowe / lampy grzewczeHome Depot3 wokół basenu, 2 pudełka do suszenia zwierząt
AnyMazeSan Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121
Telefon: (858)530-2600		/9001http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/
Styropian biurowe zawiasówproducent mechaniczny UTMB . światła

Bibliografia

  1. Sell, S. L., Johnson, K., DeWitt, D. S., Prough, D. S. Persistent Behavioral Deficits in Rats after Fluid Percussion Injury. J Neurotrauma. 34 (5), 1086-1096 (2017).
  2. Gurdjian, E. S., Lissner, H. R., Webster, J. E., Latimer, F. R., Haddad, B. F. Studies on experimental concussion: relation of physiologic effect to time duration of intracranial pressure increase at impact. Neurology. 4, 674-681 (1954).
  3. Anonymous. US National Library of Medicine. , (last accessed Jan. 9, 2018) www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/$term=fluid+percussion+injury+rat (2017).
  4. Hellmich, H. L., Capra, B., Eidson, K., Garcia, J., Kennedy, D., Uchida, T., et al. Dose-dependent neuronal injury after traumatic brain injury. Brain Research. 1044, 144-154 (2005).
  5. Bramlett, H. M., Detrich, W. D. Long-Term consequences of Traumatic Brain Injury: Current Status of Potential Mechanisms of Injury and Neurological Outcomes. J. Neurotrauma. 32, 1-15 (2015).
  6. Pierce, J. E. S., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. Enduring cognitive neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats. Neuroscience. 87 (2), 359-369 (1998).
  7. Smith, D. H., Chen, X. H., Pierce, J. E. S., Wolf, J. A., Trojanowski, J. Q., Graham, D. I., McIntosh, T. K. Progressive atrophy and neuron death for one year following brain trauma in the rat. J Neurotrauma. 14 (10), 715-727 (1997).
  8. Schallert, T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 3 (4), 497-504 (2006).
  9. Sell, S. L., Avila, M. A., Yu, G., Vergara, L., Prough, D. S., Grady, J. J., DeWitt, D. S. Hypertonic resuscitation improves neuronal and behavioral outcomes after traumatic brain injury plus hemorrhage. Anesthesiology. 108 (5), 873-881 (2008).
  10. Hamm, R. J. Neurobehavioral assessment of outcome following traumatic brain injury in rats: an evaluation of selected measures. J Neurotrauma. 18 (11), 1207-1216 (2001).
  11. Feeney, D. M., Gonzalez, A., Law, W. A. Amphetamine, haloperidol, and experience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury. Science. 217, 855-857 (1982).
  12. Hamm, R. J., Temple, M. D., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Buck, D. L., Lyeth, B. G. Working memory deficits following traumatic brain injury in the rat. J Neurotrauma. 13, 317-323 (1996).
  13. Morris, R. G., Hagan, J. J. Allocentric spatial learning by hippocampectomised rats: A further test of the "Spatial Mapping" and "Working Memory" Theories of hippocampal function. The Quart J of Exp Psych. 38 (4), 365-395 (1986).
  14. Dixon, C. E., Lyeth, B. G., Povlishock, J. T., Findling, R. L., Hamm, R. J., Marmarou, A., Young, H. F., Hayes, R. L. A fluid-percussion model of experimental brain injury in the rat. J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).
  15. DeWitt, D. S., Smith, T. G., Deyo, D. J., Miller, K. R., Uchida, T., Prough, D. S. L-arginine and superoxide dismutase prevent or reverse cerebral hypoperfusion after fluid-percussion traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 14, 223-233 (1997).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2017).
  17. Pohlert, T. The Pairwise Multiple comparison of Mean Ranks Package (PMCMR) R package. , http://CRAN.R-project.org/package=PMCMR (2014).
  18. Verma, P., Hellemans, K. G., Choi, F. Y., Yu, W., Weinberg, J. Circadian phase and sex effects on depressive/anxiety-like behaviors and HPA axis responses to acute stress. Physiol Behav. 99, 276-285 (2010).
  19. Schallert, T., Woodlee, M. T., Fleming, S. M. Experimental Focal Ischemic Injury: Behavior-Brain Interactions and Issues of Animal Handling and Housing. ILAR J. 44 (2), 130-143 (2003).
  20. Ruis, J. F., Rietveld, W. J., Buys, J. P. Properties of parametric photic entrainment of circadian rhythms in the rat. Physiol Behav. 50, 1233-1239 (1991).
  21. Ferguson, S. A., Maier, K. L. A review of seasonal/circannual effects of laboratory rodent behavior. Physiol Behav. 119, 130-136 (2003).
  22. Fujimoto, S. T., Longhi, L., Saatman, K. E., McIntosh, T. K. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neurosci & Biobehav Reviews. , (2004).
  23. Gold, E. M., Su, D., Lopez-Velazquez, L., Haus, D. L., Perez, H., Lacuesta, G. A., Anderson, A. J., Cummings, B. J. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. Regen. Med. 8 (4), 483-516 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena neurologicznabalans na belcech d po belcewodny labirynt Morrisauraz metod perkusji cieczowejpami operacyjnapami referencyjnaobchodzenie si ze szczurami
Wykrywanie deficytów behawioralnych u szczurów po urazowym uszkodzeniu mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.