Artykuł metodologiczny

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56056

⸱

25 października 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Streszczenie

Właściwości mechaniczne złożonej, miękkiej materii na bazie polimerów, takich jak komórki czy sieci biopolimerowe, nie mogą być zrozumiane ani w klasycznej ramie elastycznych polimerów, ani w sztywnych prętach. Włókna leżące pod spodem pozostają rozciągnięte ze względu na ich niezanikającą sztywność kręgosłupa, która jest określana ilościowo za pomocą długości trwałości (lp), ale podlegają one również silnym wahaniom termicznym. Ich skończona sztywność na zginanie prowadzi do unikalnej, nietrywialnej mechaniki zbiorowej sieci masowych, umożliwiając tworzenie stabilnych rusztowań przy małych frakcjach objętościowych przy jednoczesnym zapewnieniu dużych rozmiarów oczek. Ta podstawowa zasada jest powszechna w przyrodzie (np. w komórkach lub tkankach), minimalizując wysoką zawartość molekularną, a tym samym ułatwiając transport dyfuzyjny lub aktywny. Ze względu na ich implikacje biologiczne i potencjalne zastosowania technologiczne w biokompatybilnych hydrożelach, polimery półelastyczne są przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Jednak zrozumiałe badania pozostały trudne, ponieważ opierały się na naturalnych polimerach, takich jak włókna aktynowe, których nie można swobodnie przestrajać. Pomimo tych ograniczeń i ze względu na brak syntetycznych, mechanicznie przestrajalnych i półelastycznych polimerów, włókna aktynowe zostały ustanowione jako powszechny system modelowy. Głównym ograniczeniem jest to, że centralna wielkość lp nie może być dowolnie dostrojona w celu zbadania jej wpływu na makroskopowe struktury masowe. Ograniczenie to zostało rozwiązane dzięki zastosowaniu strukturalnie programowalnych nanorurek DNA, umożliwiających kontrolowaną zmianę sztywności włókna. Są one tworzone przez projekty oparte na płytkach, w których dyskretny zestaw częściowo uzupełniających się pasm hybrydyzuje w strukturę pierścieniową o dyskretnym obwodzie. Pierścienie te mają lepkie końce, co umożliwia efektywną polimeryzację do włókien o długości kilku mikronów i wykazują podobną kinetykę polimeryzacji jak naturalne biopolimery. Ze względu na swoją programowalną mechanikę, rurki te są wszechstronnymi, nowatorskimi narzędziami do badania wpływu lp na pojedynczą cząsteczkę, a także na skalę masową. W przeciwieństwie do filamentów aktynowych, pozostają stabilne przez tygodnie, bez zauważalnych zwyrodnień, a ich obsługa jest porównywalnie prosta.

Wprowadzenie

Ze względu na złożone zachowania, które umożliwiają ich unikalne właściwości mechaniczne, półelastyczne polimery są podstawowymi elementami budulcowymi żywej materii. W przeciwieństwie do polimerów elastycznych, polimery półelastyczne przyjmują konfigurację rozciągniętą ze względu na ich niezanikającą sztywność kręgosłupa, a jednocześnie podlegają silnym wahaniom temperatury1. W związku z tym modele czysto stochastyczne nie mogą być stosowane do ich zachowań, jak w przypadku skrajności w pełni elastycznych lub sztywnych polimerów. Tak zwany model łańcucha przypominającego robaka2,3,4 został opracowany w celu ilościowego określenia tej sztywności za pomocą lp, która jest stałą zaniku korelacji styczne-stycznej wzdłuż filamentu4. Jeśli lp jest porównywalne z długością konturu (lc) filamentu, polimer jest uważany za półelastyczny1. Analogicznie do słupów namiotu, ich ułożenie w sieci lub wiązkach stabilizuje cały układ zbiorowy przy małych frakcjach objętościowych, prowadząc do niezwykłych właściwości lepkosprężystości5,6,7,8,9. Struktury te zapewniają wysoką elastyczność przy dużych rozmiarach oczek10, zachowując integralność mechaniczną, a jednocześnie ułatwiając dyfuzyjne i aktywne procesy transportowe. Ta właściwość jest szczególnie przydatna w systemach biologicznych, takich jak cytoszkielet lub macierz zewnątrzkomórkowa, ale jest również szeroko stosowana w inżynierii żywności1,11,12.

Wykraczając poza ich znaczenie dla materii żywej, kluczowe jest kompleksowe zbadanie właściwości fizycznych tych struktur, aby mieć narzędzia do opracowania materiałów biomimetycznych lub nowych hydrożeli. W odniesieniu do polimerów półelastycznych oznacza to systematyczne określanie właściwości zbiorowych sieci wynikających z właściwości pojedynczych włókien, takich jak lp, oraz opracowanie opisowych ram teoretycznych. W pionierskich badaniach biopolimer komórkowy aktyna została uznana za system modelowy dla polimerów półelastycznych i nadal jest powszechnie uważana za złoty standard5,13,14,15,16,17. Jednak wyczerpujące badania nad tym systemem są ograniczone, ponieważ są one związane z nieodłącznymi właściwościami tego białka. Różne podejścia teoretyczne miały na celu zbudowanie opisu nietrywialnych zachowań mechanicznych na poziomie pojedynczego włókna i doprowadziły do wyraźnie różnych przewidywań skalowania zależności liniowego modułu ścinania płaskowyżu sprężystości, G0 (tj. "sprężystości" sieci), w odniesieniu do koncentracji (c) i lp6,7, 13,14,15,18,19,20,21,22,23. Chociaż skalowanie stężenia jest łatwo dostępne w eksperymentach z systemami opartymi na aktynie lub innych systemach modelowych, a przewidywania teoretyczne zostały rygorystycznie zweryfikowane13,16,24,25, skalowanie w odniesieniu do lp pozostało eksperymentalnie niedostępne. Jest to jednak poważne ograniczenie, ponieważ lp jest również zmienną niezależną, która jest ilością definiującą polimery półelastyczne.

To centralne, naturalne ograniczenie narzucone przez stałe lp aktyny lub innych biologicznie pochodnych polimerów, takich jak kolagen, zostało ostatnio rozwiązane poprzez zastosowanie kafelków DNA, które są regulowane pod względem właściwości mechanicznych9,26,27,28. Niewielkie różnice w architekturze probówek (np. różna liczba składowych nici DNA w pierścieniu jednostkowym) dają różne wartości dla lp, które można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, albo analizując jedną fluktuującą rurkę, albo oceniając zakrzywione konfiguracje kilku przylegających rurek, jak opisano wcześniej9,28. Analizy te wykazały, że wartości lp w różnych populacjach probówek różnią się w więcej niż jednym rzędzie wielkości i że różne techniki oceny dają spójne wyniki9,28.

Zaskakująco, ogólne skalowanie liniowego modułu ścinania płaskowyżu sprężystego G0 w odniesieniu do stężenia i lp okazało się niespójne ze wszystkimi wcześniejszymi podejściami teoretycznymi9, w szczególności wykazując znacznie silniejszą niż przewidywano zależność od lp. Odkrycia te podkreślają wartość nowego systemu modelowego do badania głównych właściwości polimerów półelastycznych. Zastosowanie probówek DNA z n-helisą znacznie poszerza zakres tych badań. Nie tylko można dowolnie zmieniać obraz bez zmiany materiału podstawowego, ale wrodzona programowalna natura DNA może umożliwić systematyczne badanie dodatkowych elementów, takich jak usieciowania krzyżowe lub kinetyczne procesy przełączania. Dodatkowo probówki te są rozpuszczalne w wodzie i w przeciwieństwie do większości białek stabilne w odpowiednich warunkach pH i jonowych przez kilka tygodni, bez wykrywalnej degradacji9.

Do złożenia tych rurek używany jest dyskretny zestaw oligonukleotydów DNA, z których każdy zawiera dwie domeny, które dzielą komplementarne sekwencje zasad z dwoma sąsiednimi niciami (ze względu na specyficzne sekwencje, pojedyncza nić nie może tworzyć struktur takich jak spinki do włosów). Komplementarne sekwencje hybrydyzują w sposób cykliczny, tworząc zamknięte, na wpół nakładające się na siebie pierścienie n połączonych ze sobą segmentów podwójnej helisy (Rysunek 1A i B). Pierścienie te tworzą się o dyskretnej średnicy (Rysunek 1C), a ich półnakładająca się konfiguracja odsłania osiowe lepkie końce komplementarne do lepkich końców innego pierścienia. To selektywne dodawanie pasujących oligonukleotydów powoduje układanie się pierścieni, co prowadzi do efektywnej polimeryzacji nitkowatych helisowych rurek DNA o wielkości n (nHT). Ich długości konturów zazwyczaj mierzą kilka mikronów długości, a ich rozkład długości jest porównywalny z rozkładem włókien aktynowych9,26,27,28. Wykazano w przypadku podobnych nanorurek DNA, że rzeczywiście wykazują one kinetykę polimeryzacji podobną do filamentów aktynowych i mikrotubul29. W zależności od liczby n pojedynczych nici DNA tworzących podstawową strukturę pierścienia, architektura nHT, a także jej obwód i średnica, mogą być kontrolowane i zmieniane. Użycie większej liczby nici DNA zwiększa obwód pierścieni/rurek, a odpowiednia zmiana architektoniczna przesuwa właściwości mechaniczne na wyższe wartości lp (Rysunek 1C), co odpowiada wyższej sztywności. W skali mezoskopowej te większe wartości lp przekładają się na mniejsze konformacje zgięcia ze względu na wyższą sztywność (Rysunek 1D i E).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie n HTs

UWAGA: Tutaj n oznacza liczbę różnych pojedynczych nici DNA biorących udział w tworzeniu spiralnych rurek o określonym rozmiarze. Dla n=8, osiem różnych pojedynczych nici DNA tworzy pierścień jednostkowy.

  1. Zakupić sekwencje DNA (stopień czystości HPLC lub wyższy) w odpowiedniej usłudze syntezy DNA lub przeprowadzić wysokiej jakości syntezę i oczyszczanie (przykładowe sekwencje podane w tabeli 1).
  2. Zawiesić liofilizowane oligonukleotydy w oczyszczonej wodzie i postępować zgodnie z dalszymi krokami ponownego zawieszania podanymi w odpowiedniej instrukcji firmy. Dostosuj ilość wody, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.
  3. Określić stężenia pojedynczych nici DNA w celu zweryfikowania wartości podanych przez dystrybutora (np. za pomocą spektroskopii UV-Vis przy 260 nm), ponieważ dokładna stechiometria ma kluczowe znaczenie dla procesu składania. Obliczyć stężenie oligonukleotydów, biorąc pod uwagę właściwą masę molową i współczynnik ekstynkcji dla każdego oligonukleotydu jednoniciowego DNA.
    UWAGA: Wartości współczynnika ekstynkcji z natury różnią się dla różnych sekwencji i są podane w dokumentacji komercyjnie zakupionego DNA. Można je również obliczać zgodnie z modelem najbliższego sąsiada za pomocą szeregu ogólnodostępnych narzędzi online. Aby zachować zgodność z zakresem liniowym spektrometru, należy rozważyć rozcieńczenie próbki używanej do oznaczania stężenia.
  4. Za pomocą mikropipety wymieszaj nici DNA - każda w tym samym stężeniu - w pojemniku odpowiednim dla termocyklera (np. probówka PCR o pojemności 200 μl), aby utworzyć pożądane nHT (końcowe warunki buforowe: 1xTE (10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 8) i 12,5 mM MgCl2).
    UWAGA: Końcowe próbki DNA nHT składają się z nici n-1, U1− Un−1 i jednej nici Tn. Stężenie na nić może wahać się od submikromolowego do ponad 10 μM, w zależności od potrzeb użytkownika (np. <1 μm na nić do późniejszego rozcieńczenia w celu obserwacji pojedynczych włókien lub wyższe stężenia do badania mechaniki gęstych sieci).
  5. Hybrydyzacja nHT w termocyklerze (denaturacja przez 10 minut w temperaturze 90 °C, a następnie szybki spadek do 65 °C; powolny spadek temperatury z 65 °C do 55 °C, z komplementarnym parowaniem zasad w 20 krokach temperaturowych -0,5 K przez 30 minut każdy; i szybki spadek z 55 °C do 20 °C); patrz Rysunek 2A.
    UWAGA: Powolne zmniejszanie od 65 °C można wydłużyć, aby zwiększyć średnią długość rury; jednak późniejszy szybki spadek do 20 °C ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia agregacji spolimeryzowanych rur.
  6. Zhybrydyzowane nHT należy przechowywać do 3 tygodni w temperaturze 4 °C bez wykrywalnej degradacji.
    UWAGA: W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej znakowane nHT są hybrydyzowane przez (częściowo) podstawienie U1 zmodyfikowanym U1-Cy3 (Tabela 1). W przypadku dłuższych czasów obserwacji zaleca się dodanie uznanych środków przeciwwybielających.
  7. W razie potrzeby ostrożnie rozcieńczyć próbkę do pożądanego stężenia końcowego (np. 4 μM dla sieci lub 20 nM dla obserwacji pojedynczych włókien) przy użyciu buforu do próbki. Aby zminimalizować możliwe źródła błędów, należy zebrać próbki o pożądanym stężeniu końcowym.

2. Reologia ścinania

  1. Wybierz odpowiednią geometrię (płyta-płyta lub stożek-płytka) dla dynamicznego reometru ścinania. W przypadku małych objętości (tj. poniżej 200 μl) należy użyć geometrii stożek-płytka.
  2. Załadować próbkę do reometru dynamicznego ścinania.
  3. Pasywować granicę faz powietrze-woda próbki i środowiska, wykonując następujące czynności, aby zapobiec potencjalnym skutkom parowania.
    1. Otocić próbkę 2,5 ml kąpieli buforowej próbki.
    2. Dodaj środek powierzchniowo czynny tuż poniżej stężenia micel.
    3. Użyj strzykawki Hamiltona, aby otoczyć próbkę lipidem, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu próbki z powietrzem.
  4. Uszczelnić komorę próbki nakrętką wyposażoną w mokre gąbki oraz, jeśli to możliwe, dodatkową łaźnią wodną (niestykającą się z próbką) w celu dalszego zahamowania parowania.
  5. Rozpocznij pomiar za pomocą oprogramowania specyficznego dla reometru w temperaturze pokojowej; alternatywnie wykonaj pomiar w różnych temperaturach, takich jak 37 °C (jeśli potrzebne są warunki fizjologiczne).
    UWAGA: Chłodzeniu próbki często towarzyszy kondensacja pary wodnej z otaczającego powietrza, podczas gdy ogrzewanie prowadzi do zwiększonego parowania. Oba efekty mogą w niekontrolowany sposób zmienić stężenie próbki, dlatego wszystkie pomiary w serii powinny być wykonywane w stałej temperaturze.
  6. Pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Ewolucja czasu może być monitorowana za pomocą przemiatania w czasie (jeden punkt danych na minutę; odkształcenie γ = 5%; częstotliwość f = 1 Hz).
  7. Zmierz właściwości mechaniczne za pomocą żądanych protokołów testowych. Zacznij od serii przemiatania częstotliwości (f-sweeps), ponieważ pozostawiają one próbkę nienaruszoną i pozwalają na więcej pomiarów.
    UWAGA: Dodatkowo, krótkie przemiatanie f powinno być przeprowadzane przed i po dłuższych pomiarach (takich jak długie przemiatanie f ze znacznie wyższą rozdzielczością), aby sprawdzić, czy próbka pozostała niezmieniona przez cały pełny protokół pomiarowy.
    1. Wykonaj krótkie przemiatanie f (np. γ = 5%; f = od 0,01 Hz do 30 Hz; 5 punktów danych na dekadę).
    2. Wykonaj długie przeciągnięcie f (np. γ = 5%; f = od 0,001 Hz do 30 Hz; 21 punktów danych na dekadę); Reżim niskich częstotliwości można pominąć, jeśli nie jest to konieczne w celu skrócenia czasu pomiaru.
    3. Wykonaj krótkie przeciągnięcie f.
    4. Wykonaj γ-sweep (np. f = 1 Hz; γ = od 0,0125% do 100%; 20 punktów danych na dekadę).
      UWAGA: Najpierw użyj krótkiego przeciągnięcia f, ponieważ jest ono zwykle niespójne z poprzednimi przeciągnięciami f, ponieważ sieci zwykle pękają podczas γ-sweep lub odrywają się od płyt. Alternatywnie użyj rampy γ (np. = 0,025 s-1, t = 60 s); Jednak rampy zwykle wymagają zmiany trybu silnika, więc kolejne krótkie przemiatanie f byłoby sfałszowane.
  8. Umieść surowe dane w koszu i/lub wygładź je za pomocą jądra Gaussa.

3. Analiza wspomagana fluorescencją wyżarzania DNA

  1. Przygotuj 8 podwielokrotności po 12 μl dla każdej próbki, używając 1-4 μM DNA na nić, 12,5 mM MgCl2 w 1x buforze TE i 1x barwienie żelem kwasu nukleinowego z 10 000x DMSO. Wykonaj kontrolę ujemną bez DNA, ale uwzględnij barwienie żelem kwasu nukleinowego.
  2. Przenieś podwielokrotności na płytkę PCR w czasie rzeczywistym i uszczelnij folią samoprzylepną (np. 96-dołkową płytką reakcyjną).
    UWAGA: Wysokie temperatury stosowane w protokołach wyżarzania termicznego powodują odparowanie próbek. Dlatego upewnij się, że studzienki są szczelnie uszczelnione folią samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu wody i wzrostowi stężenia, szczególnie podczas długotrwałych eksperymentów.
  3. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków gazu; jeśli pęcherzyki gazu rozszerzają się, studzienki nie mogą być analizowane.
  4. Załaduj zapieczętowaną płytkę do ilościowego systemu PCR w czasie rzeczywistym.
  5. Uruchom program wyżarzania. Denaturacja DNA w temperaturze 90 °C przez 10 minut. Szybko obniż temperaturę do 72 °C. Następnie powoli zmniejszaj temperaturę o 0,5 °C co 30 minut. Po zaniku sygnału przyspiesz rampę temperatury.
    UWAGA: 72 °C jest wystarczająco powyżej rzeczywistej temperatury hybrydyzacji; W ten sposób sygnał jest rejestrowany w szerokim zakresie temperatur odpowiednim do określenia wymaganego zakresu temperatur.
  6. Upewnij się, że pokrywa cyklera nagrzewa się do co najmniej 100 °C, aby zapobiec kondensacji odparowanej próbki na folii samoprzylepnej.
  7. Podczas montażu należy wzbudzić próbki za pomocą lasera argonowo-jonowego o długości fali 488 nm i wykryć fluorescencję przy długości fali 550 nm w przypadku barwienia żelem z kwasem nukleinowym (lub podobnego spektralnie). W przypadku innych barwników należy wybrać odpowiednią kombinację wzbudzenia/emisji. Mierz sygnał fluorescencji tak często, jak to możliwe, aby zwiększyć ogólną jakość sygnału za pomocą wbudowanej kamery.
    UWAGA: Tutaj pomiary były wykonywane co 9 s.
  8. Jeśli stosowane są wstępnie ustawione programy topienia i wyżarzania, użyj dostarczonego oprogramowania do analizy danych. Jeśli nie, odejmij poprzednią wartość średnią od średniej wartości dla każdego kroku temperatury, aby uzyskać względną zmianę sygnału fluorescencyjnego.

4. Obrazowanie AFM

  1. Rozszczepić mikę (np. mikę "V1") poprzez przymocowanie dostępnej w handlu taśmy klejącej i oderwanie jej; należy usunąć najwyższą warstwę miki.
  2. Za pomocą mikropipety nanieś wstępnie uformowany nHT w buforze składanym Mg2+ na świeżo rozdrobnionej mice i pozostaw na 10 minut.
  3. Obracaj próbki w krótkich 3-sekundowych odstępach czasu z prędkością 2 000 x g na małej wirówce stołowej, aby usunąć pozostałą ciecz. Kilka nHT powinno być nadal przymocowanych do powierzchni miki.
  4. Użyj końcówki wspornikowej o dużej sztywności (np. 54 Nm-1) i określ jej częstotliwość rezonansową za pomocą wewnętrznego oprogramowania AFM.
  5. Zapisz profil wysokości, gdy AFM znajduje się w powietrzu w trybie stukania przy niskich szybkościach skanowania (np. 1 linia/s), aby uniknąć uszkodzenia lub przemieszczenia nHT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Montaż nanorurek DNA za pomocą rampy temperaturowej (Rycina 2) jest bardzo niezawodną metodą tworzenia tych sztucznych polimerów półelastycznych. Polimery te posiadają charakterystykę porównywalną do ich naturalnych odpowiedników, takich jak filamenty aktynowe, ale zapewniają znacznie szersze ramy eksperymentalne, ponieważ ich właściwości mechaniczne mogą być kontrolowanie modyfikowane9,27. Podobnie j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzyskać prawidłowo uformowane sieci, kluczowym krokiem jest złożenie nanorurek DNA. Błędy podczas procesu syntezy negatywnie wpływają na jakość lampy; dlatego zaleca się stosowanie HPLC lub bardziej rygorystycznego procesu do oczyszczania oligonukleotydów. Ponieważ tworzenie dyskretnych, a nie zagregowanych nanorurek DNA, a także ich rozkład długości, zależy od równomolowej stechiometrii n oligonukleotydów składowych w zbiorze, konieczne jest ponowne zmierzenie stężeń zakupionych nici, ponieważ podane wartoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Potwierdzamy finansowanie przez DFG (1116/17-1) oraz Szkołę Nauk Przyrodniczych w Lipsku "BuildMoNa" (GSC 185). Prace te zostały wsparte w ramach projektu Fraunhofer Attract 601 683. T. H. potwierdza finansowanie z Europejskiego Funduszu Społecznego (ESF-100077106).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wspornik AFM ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
Kamera CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
Oligonukleotydy DNABiomers.netAby zapoznać się z sekwencjami, patrz Tabela 1
Oligonukleotydy znakowane DNA Cy3Biomers.netAby zapoznać się z sekwencją, patrz Tabela 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Epi-fluorescencyjny mikroskopLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm okrągłyPlano GmbH50-12
MicroAmp® Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaThermo Fisher Scientific Inc.
Mikrowzmacniacz i rejestracja; Optyczna folia samoprzylepnaThermo Fisher Scientific Inc.
Spektrofotometr NanoDrop 1000firmy Thermo Fisher Scientific Inc.
100x obiektywLeica5506168
Woda oczyszczonaMerk Millipore - Milli-Q & Probówki do PCR Elix
SapphireGreiner Bio-One683271
Profesjonalny standardowy termocykler do PCRCore Life Sciences Inc.070- Standard
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymBiosystemy stosowane4351405
ReometrTA InstrumentyARES
SYBR® Zielona I barwnik żelowa z kwasem nukleinowymThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Hamuje parowanie próbki na granicy faz powietrze-woda
43469074306311

Bibliografia

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001(2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274(2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

D ugo persistencyjnapomiar reologicznydynamiczny reometr cinaj cydetekcja fluorescencyjnahybrydyzacja w termocyklerzePCR w czasie rzeczywistymkinetyka polimeryzacjizastosowanie hydro eli

Powiązane artykuły