Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny magazyn węglowodanów węgla z CO₂ utrwalonego w świetle w procesie fotosyntezy. Glikogen to glikan składający się z liniowego glukanu połączonego α-1,4 z gałęziami utworzonymi przez wiązania glukozylowe połączone α-1,6. Biosynteza glikogenu w sinicach rozpoczyna się od przekształcenia glukozo-6-fosforanu w ADP-glukozę poprzez sekwencyjne działanie fosfoglukutazy i pirofosforylazy ADP-glukozy. Ugrupowanie glukozy w ADP-glukozie jest przenoszone do nieredukującego końca szkieletu α-1,4-glukanu glikogenu przez jedną lub więcej syntaz glikogenu (GlgA). Następnie rozgałęziające się enzymy wprowadzają wiązanie glukozylowe połączone z α-1,6, które jest dalej rozszerzane w celu wytworzenia cząsteczki glikogenu. W ciemności glikogen jest rozkładany przez fosforylazę glikogenu, enzymy rozgałęziające glikogen, α-glukanotransferazę i fosforylazę malto-dekstrynową na fosforylowaną glukozę i wolną glukozę. Zasilają one szlaki kataboliczne, w tym oksydacyjny szlak pentozofosforanowy, szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza) i szlak Entnera-Doudoroffa^1,2,3,4.

Metabolizm glikogenu u cyjanobakterii cieszy się coraz większym zainteresowaniem w ostatnich latach ze względu na możliwość przekształcenia się cyjanobakterii w fabryki komórek mikrobiologicznych napędzanych światłem słonecznym do produkcji chemikaliów i paliw. Metabolizm glikogenu można zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności produktów, ponieważ glikogen jest największą elastyczną pulą węgla w tych bakteriach. Przykładem jest sinica Synechococcus sp. PCC 7002, która została genetycznie zmodyfikowana w celu produkcji mannitolu; Genetyczne zakłócenie syntezy glikogenu zwiększa wydajność mannitolu 3-krotnie5. Innym przykładem jest produkcja bioetanolu z Synechococcus sp. z nasyconym glikogenem dzikim typem PCC 7002⁶. Zawartość glikogenu w komórkach typu dzikiego może wynosić do 60% suchej masy komórki podczas głodu azotu⁶.

Nasze zrozumienie metabolizmu i regulacji glikogenu również poszerzyło się w ostatnich latach. Podczas gdy wiadomo, że glikogen gromadzi się w świetle i jest katabolizowany w ciemności, szczegółowa kinetyka metabolizmu glikogenu podczas cyklu dziennego została ujawniona dopiero niedawno w Synechocystis sp. PCC 6803⁷. Ponadto zidentyfikowano kilka genów wpływających na akumulację glikogenu. Godnym uwagi przykładem jest odkrycie, że przypuszczalna kinaza histydynowa PmgA i niekodujące RNA PmgR1 tworzą kaskadę regulatorową i kontrolują akumulację glikogenu. Co ciekawe, mutanty delecyjne pmgA i pmgR1 gromadzą dwa razy więcej glikogenu niż dziki szczep Synechocystis sp. PCC 6803^8,9. Wiadomo również, że inne elementy regulatorowe wpływają na akumulację glikogenu, w tym alternatywny czynnik sigma E i czynnik transkrypcyjny CyAbrB2^10,11.

Wraz ze wzrostem zainteresowania regulacją i metabolizmem glikogenu, uzasadniony jest szczegółowy protokół opisujący określanie zawartości glikogenu. W literaturze stosuje się kilka metod. Hydroliza kwasowa, po której następuje oznaczenie zawartości monosacharydów za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej anionowymiennej w połączeniu z pulsacyjnym detektorem amperometrycznym lub oznaczanie spektrometryczne po traktowaniu kwasem i fenolem są szeroko stosowanymi metodami przybliżania zawartości glikogenu9^,10,12,13. Jednak wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy z anionowymiennością jest bardzo drogi i nie odróżnia glukozy pochodzącej z glikogenu od glukozy pochodzącej z innych koniugatów glikokoniugatów zawierających glukozę, takich jak sacharoza¹⁴, glucosylglycerol¹⁵ i cellulose^16,17,18, o których wiadomo, że kumulują się w niektórych gatunkach sinic. Metoda kwasowo-fenolowa może być wykonywana przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Używa jednak wysoce toksycznych odczynników i nie odróżnia glukozy pochodzącej z różnych glikokoniugatów, ani nie odróżnia glukozy od innych cukrów prostych, które stanowią materiał komórkowy, takiego jak glikolipidy, lipopolisacharydy i matryce zewnątrzkomórkowe¹². Warto zauważyć, że test gorący kwasowo-fenolowy jest często stosowany do oznaczania całkowitej zawartości węglowodanów, a nie do konkretnego oznaczania zawartości glukozy¹². Enzymatyczna hydroliza glikogenu do glukozy przez α-amyloglukozydazę, a następnie wykrywanie glukozy za pomocą testu sprzężonego z enzymami generuje odczyt kolorymetryczny, który jest bardzo czuły i specyficzny dla glukozy pochodzącej z glikogenu. Swoistość można dodatkowo zwiększyć dzięki preferencyjnemu wytrącaniu glikogenu z lizatów komórkowych przez etanol^5,8,19.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół enzymatycznego testu zawartości glikogenu w dwóch najczęściej badanych gatunkach sinic, Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002, w szczepach typu dzikiego i zmutowanych. Aby zapewnić efektywną hydrolizę, stosuje się koktajl α-amylazy i α-amyloglukozydazy⁸. Endodziałająca α-amylaza hydrolizuje wiązania α-1,4 w różnych glukanach do dekstrytyn, które są dalej hydrolizowane do glukozy przez egzodziałającą α-amylogozydazę²⁰. Synergiczne działanie tych enzymów jest dobrze znane, a enzymy te są rutynowo wykorzystywane do selektywnej hydrolizy skrobi, która jest α połączonym glukanem, podobnym do glikogenu, bez wpływu na inne glikokoniuganty, takie jak celuloza, w biomasie roślinnej ²¹. Uwolniona glukoza jest wykrywana ilościowo po teście sprzężonym z enzymami składającym się z oksydazy glukozowej - która katalizuje redukcję tlenu do nadtlenku wodoru i utlenianie glukozy do laktonu - i peroksydazy - która wytwarza różowy barwnik chinoneiminowy z nadtlenku wodoru, związku fenolowego i 4-aminoantypiryny²².

1. Przygotowanie

1. Kultury sinic
   1. Uprawę Synechocystis sp. PCC 6803 w temperaturze 30 °C w płynie BG11 medium⁸, ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO₂. Oświetlać kultury w sposób ciągły światłem przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 50 μmol fotonów/^m2/s.
   2. Uprawiaj Synechococcus sp. PCC 7002 w płynnym podłożu A+²³ (można również użyć podłoża BG11), ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO₂ . Temperatura powinna wynosić 37 °C. Oświetlać kultury światłem w sposób ciągły przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 150 μmol fotonów/^m2/s.
   3. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultury przy długości fali 730 nm za pomocą kuwety o ścieżce światła wynoszącej 1 cm. Jeśli wartość OD jest wyższa niż 0,8, należy dokonać odpowiednich rozcieńczeń, aby uzyskać pomiary OD, które są proporcjonalne do stężenia w komórkach.
      UWAGA: Przedstawione poniżej protokoły są odpowiednie dla kultur płynnych, o gęstości komórek odpowiadającej wartości OD_{730 nm} 2 lub wyższej. Gdy pożądane są hodowle w fazie wzrostu wykładniczego, które zazwyczaj mają wartość OD_{730 nm} poniżej 1, należy skoncentrować gęstość komórek przez odwirowanie i ponowne zawieszenie w buforze lub pożywce, aby osiągnąć wartość OD_{730 nm} 2 lub wyższą.
2. i odczynniki
   1. Zrobić 50 mM buforu Tris-HCl o pH 8.
   2. Przygotować 50 mM buforu octanu sodu o pH 5.
   3. Przygotować roztwór podstawowy 8 j./ml amyloglukozydazy w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5.
   4. Przygotować roztwór podstawowy 2 μ/ml α-amylazy w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5.
   5. Używając wody destylowanej, przygotować roztwory wzorcowe glukozy w stężeniach od 0 do 100 μg/ml.
   6. Przygotuj odczynnik GOD-POD z zestawu do oznaczania D-glukozy (format GODPOD), postępując zgodnie z instrukcją producenta.

2. Oznaczanie suchej masy komórki (opcjonalnie)

1. Przenieść 2 ml kultury lub zawiesiny komórek (patrz krok 1.1) do probówki o pojemności 2,0 ml i odwirować przy 6 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
2. Zawiesić osad w 1 ml wody i odwirować w temperaturze 6 000 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml wody.
3. Przenieść zawiesinę na wstępnie zważoną aluminiową tacę. Przenieść blachę do suszarki w temperaturze 105 °C w celu wysuszenia przez noc (około 18 godzin).
   KRYTYCZNE: Ważne jest, aby taca była obsługiwana za pomocą kleszczy, aby uniknąć przenoszenia materiału z palców. Wysuszyć pustą, wstępnie zważoną aluminiową tacę w tych samych warunkach, aby określić utratę masy tac podczas suszenia.
4. Po wysuszeniu wyjmij blachę z piekarnika i pozwól jej wyrównać się w warunkach otoczenia przez 5 minut, a następnie zważyć ją z dokładnością do 0,0001 g.
   UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu w przeliczeniu na suchą masę komórkową.

3. Liza komórek sinic

1. Przenieść 1 ml kultury lub zawiesiny komórkowej (patrz krok 1.1) do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 6 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.
2. Zawiesić osad w 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 i odwirować przy 6 000 x g i 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu Tris-HCl. Powtórz proces.
3. Dokładnie zawiesić osad w 500 μl 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,
   KRYTYCZNE: Dobrze zawiesić osad, aby uzyskać efektywną lizę komórek. Zawiesinę należy przechowywać w lodzie.
4. Zawiesić komórki w temperaturze 4 °C, wykonując 30 cykli ultradźwięków, z których każdy trwa 30 s z częstotliwością 20 kHz o maksymalnej amplitudzie, a następnie 90 s bez nich.
   UWAGA: Ta metoda może skutecznie lizować Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. Alternatywnie, przenieś refuzję komórek do probówki z nakrętką i dodaj kulki tlenku cyrkonu do probówki, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Umieścić probówkę w homogenizatorze tkankowym i poddać komórki lizie w temperaturze 4 °C, wykonując 2 cykle ubijania, z których każdy trwa 5 minut przy ustawieniu częstotliwości 5,
      UWAGA: Ta metoda może skutecznie lizować Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Odwirować probówkę zawierającą lizat przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Granulka powinna składać się głównie z dużych resztek komórkowych. Jeśli istnieje znaczna liczba nieuszkodzonych komórek, powtórz krok 3.4. Utrzymać supernatant na lodzie.
6. Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białek BCA.
   UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu na podstawie zawartości białka.

4. Wytrącanie glikogenu

1. Usunąć chlorofil a z lizatu komórkowego, mieszając 900 μl 96% (v/v) etanolu i 100 μl supernatantu z kroku 3.5 w probówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Po zamknięciu nakrętki podgrzewać probówkę w temperaturze 90 °C przez 10 minut za pomocą standardowego laboratoryjnego bloku grzewczego.
2. Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut.
3. Odwirować probówkę o ciśnieniu 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 30 minut i ostrożnie usunąć sklarowany nadosad; osad zawiera glikogen. Lekko wysuszyć granulat na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu.
   KRYTYCZNY: Należy unikać nadmiernego wysuszania granulek, w przeciwnym razie trudno będzie je rozpuścić w kroku 5.1.
4. OPCJONALNIE: Zmierzyć absorbancję supernatantu otrzymanego w kroku 4.3 przy długości fali 664 nm w celu oznaczenia zawartości chlorofilu A. Użyj współczynnika absorpcji 84,6 L/g/cm²⁴,
   UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu.

5. Hydroliza enzymatyczna i oznaczanie glikogenu

1. Rozpuścić osad otrzymany w kroku 4.3 w 100 μl 50 mM octanu sodu o pH 5 i dodać 50 μl 8 U/ml amylogozydazy i 50 μl 2 U/ml α-amylazy. Dobrze wymieszaj te materiały za pomocą vortex.
   UWAGA: Mieszanie przez pipetowanie nie jest zalecane, ponieważ granulki glikogenu są lepkie.
2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 60 °C na bloku grzewczym przez 2 godziny, aby umożliwić trawienie glikogenu do cząsteczek glukozy.
3. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 5 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

6. Oznaczanie całkowitej zawartości glukozy za pomocą odczynnika GOD-POD

1. Zmierzyć stężenie glukozy w supernatantze otrzymanym w kroku 5.3 za pomocą odczynnika GOD-POD. Przenieść 100 μl supernatantu z etapu 5.3 do studzienki na płytce 96-dołkowej. Jako kontrolę ujemną użyj 100 μl 50 mM octanu sodu o pH 5. Aby wygenerować krzywą kalibracyjną, należy również zmierzyć roztwory wzorcowe glukozy.
2. Dodać 150 μl odczynnika GOD-POD do każdej próbki i szybko wymieszać przez pipetowanie.
3. Inkubować płytkę statycznie w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Zapisać wartość absorbancji przy długości fali 510 nm za pomocą czytnika płytek.
4. Obliczyć stężenie glukozy przy użyciu krzywej kalibracyjnej otrzymanej z wzorców glukozy.
   UWAGA: Stężenie glikogenu w lizacie komórkowym jest wyrażone jako stężenie glukozy (μg/ml).

10 ml Synechocystis sp. PCC 6803 typu dzikiego uprawiano w warunkach fotoautotroficznych, aż wartość OD730nm osiągnęła około 0,8. Komórki zebrano i ponownie zawieszono w 50 mM Tris-HCl, pH 8. Wartość OD730nm została dostosowana do 2-3. Zawartość glikogenu analizowano zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Zawartość glikogenu w OD730nm wynosiła 13 ± 1,8 μg/mL/OD730nm (N = 12). Zawartość glikogenu w stosunku do zawartości białka wynosiła 0,24 ± 0,03 μg/μg (N = 12), a zawartość glikogenu w stosunku do zawartości chlorofilu A wynosiła 5,7 ± 0,6 μg/μg (N = 12). Ze względu na niewielką ilość dostępnego materiału pominięto pomiar suchej masy ogniwa. Biorąc pod uwagę, że zawartość białka w cyjanobakteriach hodowanych w porównywalnych warunkach wynosi około 50% suchej masy komórki25, zawartość glikogenu szacuje się na 12% suchej masy komórki, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami26.

Granice wykrywalności testu GOD-POD wykazały liniową korelację między stężeniem glukozy a absorbancją przy 510 nm w zakresie stężenia glukozy między 10 a 100 μg/ml, co odpowiada wartościom absorbancji 0,08 i 0,7 przy 510 nm. Minimalny limit jest prawdopodobnie spowodowany granicą wykrywalności instrumentalnej. Gdy zastosowano stężenia glukozy wyższe niż 150 μg/ml, tworzyły się ciemnozielone osady, powodujące duże różnice w odczycie absorbancji. Jeśli chodzi o ilość użytych materiałów komórkowych, rutynowo uzyskiwaliśmy odtwarzalną zawartość glikogenu, gdy wartość OD730 nm ponownego zawieszenia komórek przed lizą komórek wynosiła od 2 do 10. Ponowne zawieszenie komórek o wartości OD730 nm wynoszącej 1 lub mniejszej powodowało sygnały bliskie minimalnej granicy wykrywalności, co prowadziło do bardzo zróżnicowanych wyników. Ponowne zawieszenie komórek o wartości OD730 nm wyższej niż 20 nie było odpowiednie, ponieważ liza komórek była niekompletna i wymagana była albo przedłużona liza, albo rozcieńczenia.

Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne wyniki zawartości glikogenu w Synechocystis sp. PCC 6803 typu dzikiego i dwóch zmutowanych szczepach (ΔpmgA i ΔpmgR1). Wykorzystano komórki wyhodowane w fazie wzrostu wykładniczego. Zawartość glikogenu została najpierw znormalizowana przez całkowitą zawartość białka, a następnie wyrażona w stosunku do wartości dla typu dzikiego. Wyniki pokazują, że zmutowane szczepy mają zawartość glikogenu co najmniej dwukrotnie wyższą niż w przypadku szczepu dzikiego.

Następnie przeanalizowano zawartość glikogenu w szczepach Synechococcus sp. PCC 7002 opracowanych do produkcji mannitolu5. Pierwszy szczep (Glg+) zawiera geny glgA1 i glgA2 typu dzikiego kodujące dwie funkcjonalne syntazy glikogenu, podczas gdy drugi szczep (Glg-) nie ma funkcjonalnych kopii tych genów5. Następnie zmierzono zawartość glikogenu i mannitolu w obu szczepach (Rysunek 2). Wyniki pokazują, że Glg- nie miał wykrywalnego poziomu glikogenu, podczas gdy produkował więcej mannitolu niż szczep Glg+. Sugeruje to, że węglowodan syntetyzowany w procesie fotosyntezy jest przekierowywany do mannitolu w zmutowanym szczepie, który nie ma zdolności do syntezy glikogenu. Wartości OD730 nm w kulturach wynosiły około 10, co zapewniało wystarczającą ilość materiałów komórkowych do analizy suchej masy komórek. Zawartość glikogenu znormalizowano przy użyciu suchej masy komórki.

Rysunek 1: Zawartość glikogenu mierzona w różnych liniach Synechocystis sp. PCC 6803. Pokazano względną zawartość glikogenu w WT i w dwóch mutantach (ΔpmgA9 i ΔpmgR18). Poziom glikogenu został znormalizowany przez całkowitą zawartość białka. Przedstawiono średnie trzech kontrprób biologicznych, ze słupkami błędów reprezentującymi odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Produkcja glikogenu i mannitolu w genetycznie modyfikowanym Synechococcus sp. PCC 70025. Glg+, szczep syntetyzujący mannitol i glikogen. Glg-, szczep syntetyzujący mannitol, ale bez glikogenu. Przedstawione wartości są średnią z trzech kontrprób biologicznych, przy czym słupki błędu reprezentują odchylenia standardowe. CDW: sucha masa komórki, N.D.: nie wykryto. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.