Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56068

⸱

17 lipca 2017

 ,  , 
1Carlsberg Research Laboratory, 2Department of Biology, University of Copenhagen, 3Copenhagen Plant Science Center, Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Streszczenie

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny wewnątrzkomórkowy magazyn węgla i energii podczas fotosyntezy. Ostatnie osiągnięcia w badaniach zwróciły uwagę na złożone mechanizmy metabolizmu glikogenu, w tym cykl diel biosyntezy i katabolizmu, regulację redoks oraz udział niekodującego RNA. Jednocześnie podejmowane są wysiłki na rzecz przekierowania węgla z glikogenu do pożądanych produktów w genetycznie modyfikowanych cyjanobakteriach w celu zwiększenia wydajności produktu. Do oznaczania zawartości glikogenu w sinicach stosuje się kilka metod, o różnej dokładności i złożoności technicznej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wiarygodnego oznaczania zawartości glikogenu w sinicach, który można wykonać w standardowym laboratorium nauk przyrodniczych. Protokół obejmuje selektywne wytrącanie glikogenu z lizatu komórkowego i enzymatyczną depolimeryzację glikogenu w celu wytworzenia monomerów glukozy, które są wykrywane za pomocą testu sprzężonego z enzymem oksydazy glukozowej i peroksydazy (GOD-POD). Metodę zastosowano do Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002, dwóch modelowych gatunków sinic, które są szeroko stosowane w inżynierii metabolicznej. Co więcej, metoda z powodzeniem wykazała różnice w zawartości glikogenu między typem dzikim a mutantami z niedoborem elementów regulatorowych lub genów biosyntezy glikogenu.

Wprowadzenie

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny magazyn węglowodanów węgla z CO2 utrwalonego w świetle w procesie fotosyntezy. Glikogen to glikan składający się z liniowego glukanu połączonego α-1,4 z gałęziami utworzonymi przez wiązania glukozylowe połączone α-1,6. Biosynteza glikogenu w sinicach rozpoczyna się od przekształcenia glukozo-6-fosforanu w ADP-glukozę poprzez sekwencyjne działanie fosfoglukutazy i pirofosforylazy ADP-glukozy. Ugrupowanie glukozy w ADP-glukozie jest przenoszone do nieredukującego końca szkieletu α-1,4-glukanu glikogenu przez jedną lub więcej syntaz glikogenu (GlgA). Następnie rozgałęziające się enzymy wprowadzają wiązanie glukozylowe połączone z α-1,6, które jest dalej rozszerzane w celu wytworzenia cząsteczki glikogenu. W ciemności glikogen jest rozkładany przez fosforylazę glikogenu, enzymy rozgałęziające glikogen, α-glukanotransferazę i fosforylazę malto-dekstrynową na fosforylowaną glukozę i wolną glukozę. Zasilają one szlaki kataboliczne, w tym oksydacyjny szlak pentozofosforanowy, szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza) i szlak Entnera-Doudoroffa1,2,3,4.

Metabolizm glikogenu u cyjanobakterii cieszy się coraz większym zainteresowaniem w ostatnich latach ze względu na możliwość przekształcenia się cyjanobakterii w fabryki komórek mikrobiologicznych napędzanych światłem słonecznym do produkcji chemikaliów i paliw. Metabolizm glikogenu można zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności produktów, ponieważ glikogen jest największą elastyczną pulą węgla w tych bakteriach. Przykładem jest sinica Synechococcus sp. PCC 7002, która została genetycznie zmodyfikowana w celu produkcji mannitolu; Genetyczne zakłócenie syntezy glikogenu zwiększa wydajność mannitolu 3-krotnie5. Innym przykładem jest produkcja bioetanolu z Synechococcus sp. z nasyconym glikogenem dzikim typem PCC 70026. Zawartość glikogenu w komórkach typu dzikiego może wynosić do 60% suchej masy komórki podczas głodu azotu6.

Nasze zrozumienie metabolizmu i regulacji glikogenu również poszerzyło się w ostatnich latach. Podczas gdy wiadomo, że glikogen gromadzi się w świetle i jest katabolizowany w ciemności, szczegółowa kinetyka metabolizmu glikogenu podczas cyklu dziennego została ujawniona dopiero niedawno w Synechocystis sp. PCC 68037. Ponadto zidentyfikowano kilka genów wpływających na akumulację glikogenu. Godnym uwagi przykładem jest odkrycie, że przypuszczalna kinaza histydynowa PmgA i niekodujące RNA PmgR1 tworzą kaskadę regulatorową i kontrolują akumulację glikogenu. Co ciekawe, mutanty delecyjne pmgA i pmgR1 gromadzą dwa razy więcej glikogenu niż dziki szczep Synechocystis sp. PCC 68038,9. Wiadomo również, że inne elementy regulatorowe wpływają na akumulację glikogenu, w tym alternatywny czynnik sigma E i czynnik transkrypcyjny CyAbrB210,11.

Wraz ze wzrostem zainteresowania regulacją i metabolizmem glikogenu, uzasadniony jest szczegółowy protokół opisujący określanie zawartości glikogenu. W literaturze stosuje się kilka metod. Hydroliza kwasowa, po której następuje oznaczenie zawartości monosacharydów za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej anionowymiennej w połączeniu z pulsacyjnym detektorem amperometrycznym lub oznaczanie spektrometryczne po traktowaniu kwasem i fenolem są szeroko stosowanymi metodami przybliżania zawartości glikogenu9,10,12,13. Jednak wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy z anionowymiennością jest bardzo drogi i nie odróżnia glukozy pochodzącej z glikogenu od glukozy pochodzącej z innych koniugatów glikokoniugatów zawierających glukozę, takich jak sacharoza14, glucosylglycerol15 i cellulose16,17,18, o których wiadomo, że kumulują się w niektórych gatunkach sinic. Metoda kwasowo-fenolowa może być wykonywana przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Używa jednak wysoce toksycznych odczynników i nie odróżnia glukozy pochodzącej z różnych glikokoniugatów, ani nie odróżnia glukozy od innych cukrów prostych, które stanowią materiał komórkowy, takiego jak glikolipidy, lipopolisacharydy i matryce zewnątrzkomórkowe12. Warto zauważyć, że test gorący kwasowo-fenolowy jest często stosowany do oznaczania całkowitej zawartości węglowodanów, a nie do konkretnego oznaczania zawartości glukozy12. Enzymatyczna hydroliza glikogenu do glukozy przez α-amyloglukozydazę, a następnie wykrywanie glukozy za pomocą testu sprzężonego z enzymami generuje odczyt kolorymetryczny, który jest bardzo czuły i specyficzny dla glukozy pochodzącej z glikogenu. Swoistość można dodatkowo zwiększyć dzięki preferencyjnemu wytrącaniu glikogenu z lizatów komórkowych przez etanol5,8,19.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół enzymatycznego testu zawartości glikogenu w dwóch najczęściej badanych gatunkach sinic, Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002, w szczepach typu dzikiego i zmutowanych. Aby zapewnić efektywną hydrolizę, stosuje się koktajl α-amylazy i α-amyloglukozydazy8. Endodziałająca α-amylaza hydrolizuje wiązania α-1,4 w różnych glukanach do dekstrytyn, które są dalej hydrolizowane do glukozy przez egzodziałającą α-amylogozydazę20. Synergiczne działanie tych enzymów jest dobrze znane, a enzymy te są rutynowo wykorzystywane do selektywnej hydrolizy skrobi, która jest α połączonym glukanem, podobnym do glikogenu, bez wpływu na inne glikokoniuganty, takie jak celuloza, w biomasie roślinnej 21. Uwolniona glukoza jest wykrywana ilościowo po teście sprzężonym z enzymami składającym się z oksydazy glukozowej - która katalizuje redukcję tlenu do nadtlenku wodoru i utlenianie glukozy do laktonu - i peroksydazy - która wytwarza różowy barwnik chinoneiminowy z nadtlenku wodoru, związku fenolowego i 4-aminoantypiryny22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Kultury sinic
    1. Uprawę Synechocystis sp. PCC 6803 w temperaturze 30 °C w płynie BG11 medium8, ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO2. Oświetlać kultury w sposób ciągły światłem przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 50 μmol fotonów/m2/s.
    2. Uprawiaj Synechococcus sp. PCC 7002 w płynnym podłożu A+23 (można również użyć podłoża BG11), ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO2 . Temperatura powinna wynosić 37 °C. Oświetlać kultury światłem w sposób ciągły przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 150 μmol fotonów/m2/s.
    3. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultury przy długości fali 730 nm za pomocą kuwety o ścieżce światła wynoszącej 1 cm. Jeśli wartość OD jest wyższa niż 0,8, należy dokonać odpowiednich rozcieńczeń, aby uzyskać pomiary OD, które są proporcjonalne do stężenia w komórkach.
      UWAGA: Przedstawione poniżej protokoły są odpowiednie dla kultur płynnych, o gęstości komórek odpowiadającej wartości OD730 nm 2 lub wyższej. Gdy pożądane są hodowle w fazie wzrostu wykładniczego, które zazwyczaj mają wartość OD730 nm poniżej 1, należy skoncentrować gęstość komórek przez odwirowanie i ponowne zawieszenie w buforze lub pożywce, aby osiągnąć wartość OD730 nm 2 lub wyższą.
  2. i odczynniki
    1. Zrobić 50 mM buforu Tris-HCl o pH 8.
    2. Przygotować 50 mM buforu octanu sodu o pH 5.
    3. Przygotować roztwór podstawowy 8 j./ml amyloglukozydazy w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5.
    4. Przygotować roztwór podstawowy 2 μ/ml α-amylazy w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5.
    5. Używając wody destylowanej, przygotować roztwory wzorcowe glukozy w stężeniach od 0 do 100 μg/ml.
    6. Przygotuj odczynnik GOD-POD z zestawu do oznaczania D-glukozy (format GODPOD), postępując zgodnie z instrukcją producenta.

2. Oznaczanie suchej masy komórki (opcjonalnie)

  1. Przenieść 2 ml kultury lub zawiesiny komórek (patrz krok 1.1) do probówki o pojemności 2,0 ml i odwirować przy 6 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  2. Zawiesić osad w 1 ml wody i odwirować w temperaturze 6 000 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml wody.
  3. Przenieść zawiesinę na wstępnie zważoną aluminiową tacę. Przenieść blachę do suszarki w temperaturze 105 °C w celu wysuszenia przez noc (około 18 godzin).
    KRYTYCZNE: Ważne jest, aby taca była obsługiwana za pomocą kleszczy, aby uniknąć przenoszenia materiału z palców. Wysuszyć pustą, wstępnie zważoną aluminiową tacę w tych samych warunkach, aby określić utratę masy tac podczas suszenia.
  4. Po wysuszeniu wyjmij blachę z piekarnika i pozwól jej wyrównać się w warunkach otoczenia przez 5 minut, a następnie zważyć ją z dokładnością do 0,0001 g.
    UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu w przeliczeniu na suchą masę komórkową.

3. Liza komórek sinic

  1. Przenieść 1 ml kultury lub zawiesiny komórkowej (patrz krok 1.1) do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 6 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.
  2. Zawiesić osad w 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 i odwirować przy 6 000 x g i 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu Tris-HCl. Powtórz proces.
  3. Dokładnie zawiesić osad w 500 μl 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,
    KRYTYCZNE: Dobrze zawiesić osad, aby uzyskać efektywną lizę komórek. Zawiesinę należy przechowywać w lodzie.
  4. Zawiesić komórki w temperaturze 4 °C, wykonując 30 cykli ultradźwięków, z których każdy trwa 30 s z częstotliwością 20 kHz o maksymalnej amplitudzie, a następnie 90 s bez nich.
    UWAGA: Ta metoda może skutecznie lizować Synechococcus sp. PCC 7002.
    1. Alternatywnie, przenieś refuzję komórek do probówki z nakrętką i dodaj kulki tlenku cyrkonu do probówki, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Umieścić probówkę w homogenizatorze tkankowym i poddać komórki lizie w temperaturze 4 °C, wykonując 2 cykle ubijania, z których każdy trwa 5 minut przy ustawieniu częstotliwości 5,
      UWAGA: Ta metoda może skutecznie lizować Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002.
  5. Odwirować probówkę zawierającą lizat przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Granulka powinna składać się głównie z dużych resztek komórkowych. Jeśli istnieje znaczna liczba nieuszkodzonych komórek, powtórz krok 3.4. Utrzymać supernatant na lodzie.
  6. Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białek BCA.
    UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu na podstawie zawartości białka.

4. Wytrącanie glikogenu

  1. Usunąć chlorofil a z lizatu komórkowego, mieszając 900 μl 96% (v/v) etanolu i 100 μl supernatantu z kroku 3.5 w probówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Po zamknięciu nakrętki podgrzewać probówkę w temperaturze 90 °C przez 10 minut za pomocą standardowego laboratoryjnego bloku grzewczego.
  2. Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut.
  3. Odwirować probówkę o ciśnieniu 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 30 minut i ostrożnie usunąć sklarowany nadosad; osad zawiera glikogen. Lekko wysuszyć granulat na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu.
    KRYTYCZNY: Należy unikać nadmiernego wysuszania granulek, w przeciwnym razie trudno będzie je rozpuścić w kroku 5.1.
  4. OPCJONALNIE: Zmierzyć absorbancję supernatantu otrzymanego w kroku 4.3 przy długości fali 664 nm w celu oznaczenia zawartości chlorofilu A. Użyj współczynnika absorpcji 84,6 L/g/cm24,
    UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu.

5. Hydroliza enzymatyczna i oznaczanie glikogenu

  1. Rozpuścić osad otrzymany w kroku 4.3 w 100 μl 50 mM octanu sodu o pH 5 i dodać 50 μl 8 U/ml amylogozydazy i 50 μl 2 U/ml α-amylazy. Dobrze wymieszaj te materiały za pomocą vortex.
    UWAGA: Mieszanie przez pipetowanie nie jest zalecane, ponieważ granulki glikogenu są lepkie.
  2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 60 °C na bloku grzewczym przez 2 godziny, aby umożliwić trawienie glikogenu do cząsteczek glukozy.
  3. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 5 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

6. Oznaczanie całkowitej zawartości glukozy za pomocą odczynnika GOD-POD

  1. Zmierzyć stężenie glukozy w supernatantze otrzymanym w kroku 5.3 za pomocą odczynnika GOD-POD. Przenieść 100 μl supernatantu z etapu 5.3 do studzienki na płytce 96-dołkowej. Jako kontrolę ujemną użyj 100 μl 50 mM octanu sodu o pH 5. Aby wygenerować krzywą kalibracyjną, należy również zmierzyć roztwory wzorcowe glukozy.
  2. Dodać 150 μl odczynnika GOD-POD do każdej próbki i szybko wymieszać przez pipetowanie.
  3. Inkubować płytkę statycznie w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Zapisać wartość absorbancji przy długości fali 510 nm za pomocą czytnika płytek.
  4. Obliczyć stężenie glukozy przy użyciu krzywej kalibracyjnej otrzymanej z wzorców glukozy.
    UWAGA: Stężenie glikogenu w lizacie komórkowym jest wyrażone jako stężenie glukozy (μg/ml).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

10 mL szczepu dzikiego Synechocystis sp. PCC 6803 hodowano w warunkach fotoautotroficznych do momentu, aż wartość OD730nm osiągnęła około 0,8. Komórki zebrano i zawieszono ponownie w 50 mM Tris-HCl, pH 8. Wartość OD730nm dostosowano do poziomu 2-3. Zawartość glikogenu przeanalizowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Zawartość glikogenu w przeliczeniu na OD730nm wyniosła 13 ± 1,8 µg/mL/OD730nm (N = 12). Zawartość glikogenu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytycznymi etapami w ramach protokołu są wytrącanie glikogenu i jego ponowne zawieszenie. Po odwirowaniu po wytrąceniu etanolu glikogen tworzy półprzezroczyste osadki, które luźno przylegają do ścianek probówek do mikrowirówek. Dlatego podczas usuwania supernatantu należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie usunąć osadu. Granulka glikogenu jest lepka, a solubilizacja może być trudna, jeśli wyschnie. Należy zauważyć, że całkowite rozpuszczenie osadu glikogenu jest ważne, ponieważ niepełne rozpuszczenie doprowadzi do nieefe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Nordic Energy Research (AquaFEED, projekt nr 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, projekt nr 12-131844) i Villum Fonden (projekt nr 13363)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
QSonica Sonicators Q700Qsonica, LLCNAQSonica
SpectraMax 190 Czytnik mikropłytek Urządzenia molekularneNACzytnik płytek Eliza
Bullet Blender StormNext AdvanceBBY24M-CEUbijak do koralików
Ultrospec 3100 pro Spektrofotometr UV/VisibleAmersham BiosciencesNASpektrofotometr
Tris Sigma-AldrichT1503Bufor
HClMerck1-00317Adiustacja pH
Octan soduSigma-Aldrich32319Bufor
Amyloglykozydaza (Rhizopus sp.)MegazymeE-AMGPUEnzym do depolimeryzacji glikogenu
&alfa;-Amylaza, termostabilna (Bacillus licheniformis)Sigma-AldrichA3176Enzym do depolimeryzacji glikogenu
D-GlucoseMerch8337Standard do oznaczania glukozy
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA Thermo Fisher scientific23225Do oznaczania stężeń białka
Aluminiowe tacki do suszenia, jednorazoweVWR611-1362Do oznaczania suchej masy komórek
Zestaw do oznaczania D-glukozy (format GODPOD)MegazymeK-GLUCDo oznaczania stężenia glukozy
Chlebki z tlenku cyrkonu, 0,15 mmNext AdvanceZrOB015Koraliki do lizy komórek w Rurki RINO Bullet Blendar Storm
Next AdvanceNAdo lizy komórek w Bullet Blendar Storm

Bibliografia

  1. Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
  2. Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
  3. Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
  4. You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
  5. Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
  6. Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64(2014).
  7. Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
  8. de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
  9. Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
  10. Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
  11. Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
  12. Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
  13. Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
  14. Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
  15. Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
  16. Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
  17. Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004(2015).
  18. Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
  19. Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
  20. Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
  21. Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
  22. Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
  23. Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
  24. Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
  25. López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
  26. Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
  27. Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
  28. Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
  29. Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hydroliza enzymatycznaoksydaza glukozy i peroksydazaoznaczanie białkausuwanie chlorofilusonikacjawirowanieamyloglukozydazaalfa-amylaza
Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.