Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Streszczenie

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny wewnątrzkomórkowy magazyn węgla i energii podczas fotosyntezy. Ostatnie osiągnięcia w badaniach zwróciły uwagę na złożone mechanizmy metabolizmu glikogenu, w tym cykl diel biosyntezy i katabolizmu, regulację redoks oraz udział niekodującego RNA. Jednocześnie podejmowane są wysiłki na rzecz przekierowania węgla z glikogenu do pożądanych produktów w genetycznie modyfikowanych cyjanobakteriach w celu zwiększenia wydajności produktu. Do oznaczania zawartości glikogenu w sinicach stosuje się kilka metod, o różnej dokładności i złożoności technicznej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wiarygodnego oznaczania zawartości glikogenu w sinicach, który można wykonać w standardowym laboratorium nauk przyrodniczych. Protokół obejmuje selektywne wytrącanie glikogenu z lizatu komórkowego i enzymatyczną depolimeryzację glikogenu w celu wytworzenia monomerów glukozy, które są wykrywane za pomocą testu sprzężonego z enzymem oksydazy glukozowej i peroksydazy (GOD-POD). Metodę zastosowano do Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002, dwóch modelowych gatunków sinic, które są szeroko stosowane w inżynierii metabolicznej. Co więcej, metoda z powodzeniem wykazała różnice w zawartości glikogenu między typem dzikim a mutantami z niedoborem elementów regulatorowych lub genów biosyntezy glikogenu.

Wprowadzenie

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny magazyn węglowodanów węgla z CO₂ utrwalonego w świetle w procesie fotosyntezy. Glikogen to glikan składający się z liniowego glukanu połączonego α-1,4 z gałęziami utworzonymi przez wiązania glukozylowe połączone α-1,6. Biosynteza glikogenu w sinicach rozpoczyna się od przekształcenia glukozo-6-fosforanu w ADP-glukozę poprzez sekwencyjne działanie fosfoglukutazy i pirofosforylazy ADP-glukozy. Ugrupowanie glukozy w ADP-glukozie jest przenoszone do nieredukującego końca szkieletu α-1,4-glukanu glikogenu przez jedną lub więcej syntaz glikogenu (GlgA). Następnie rozgałęziające się enzymy wprowadzają wiązanie glukozylo....

Protokół

1. Przygotowanie

1. Kultury sinic
   1. Uprawę Synechocystis sp. PCC 6803 w temperaturze 30 °C w płynie BG11 medium⁸, ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO₂. Oświetlać kultury w sposób ciągły światłem przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 50 μmol fotonów/^m2/s.
   2. Uprawiaj Synechococcus sp. PCC 7002 w płynnym podłożu A+²³ (można również użyć podłoża BG11), ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO₂ . Temperatura powinna wynosić 37 °C. Oświetlać kultury światłem w sposób ciągły pr....

Wyniki

10 mL szczepu dzikiego Synechocystis sp. PCC 6803 hodowano w warunkach fotoautotroficznych do momentu, aż wartość OD_730nm osiągnęła około 0,8. Komórki zebrano i resuspensowano w 50 mM Tris-HCl, pH 8. Wartość OD_730nm dostosowano do poziomu 2-3. Zawartość glikogenu przeanalizowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Zawartość glikogenu w przeliczeniu na OD_730nm wyniosła 13 ± 1,8 µg/mL/OD_730nm (N = 12). Zawartość glikogenu w st.......

Dyskusja

Krytycznymi etapami w ramach protokołu są wytrącanie glikogenu i jego ponowne zawieszenie. Po odwirowaniu po wytrąceniu etanolu glikogen tworzy półprzezroczyste osadki, które luźno przylegają do ścianek probówek do mikrowirówek. Dlatego podczas usuwania supernatantu należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie usunąć osadu. Granulka glikogenu jest lepka, a solubilizacja może być trudna, jeśli wyschnie. Należy zauważyć, że całkowite rozpuszczenie osadu glikogenu jest ważne, ponieważ niepełne rozpuszczenie doprowadzi do nieefe.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Czytnik mikropłytek	Urządzenia molekularne	NA	Czytnik płytek Eliza
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Ubijak do koralików
Ultrospec 3100 pro Spektrofotometr UV/Visible	Amersham Biosciences	NA	Spektrofotometr
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Bufor
HCl	Merck	1-00317	Adiustacja pH
Octan sodu	Sigma-Aldrich	32319	Bufor
Amyloglykozydaza (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzym do depolimeryzacji glikogenu
&alfa;-Amylaza, termostabilna (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzym do depolimeryzacji glikogenu
D-Glucose	Merch	8337	Standard do oznaczania glukozy
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Fisher scientific	23225	Do oznaczania stężeń białka
Aluminiowe tacki do suszenia, jednorazowe	VWR	611-1362	Do oznaczania suchej masy komórek
Zestaw do oznaczania D-glukozy (format GODPOD)	Megazyme	K-GLUC	Do oznaczania stężenia glukozy
Chlebki z tlenku cyrkonu, 0,15 mm	Next Advance	ZrOB015	Koraliki do lizy komórek w Rurki RINO Bullet Blendar Storm
	Next Advance	NA	do lizy komórek w Bullet Blendar Storm