Artykuł metodologiczny

Mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) - proste i niezawodne protokoły przetwarzania i wizualizacji materiałów organicznych

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56071

⸱

7 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Udostępniamy proste i solidne protokoły przetwarzania materiału biopsyjnego różnych gatunków, zarodków organizmów modelowych biomedycznych i próbek innych tkanek organicznych, aby umożliwić cyfrowe generowanie danych objętościowych za pomocą metody mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Udostępniamy proste protokoły do generowania cyfrowych danych objętościowych metodą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości (HREM). HREM jest w stanie obrazować materiały organiczne o objętościach do 5 x 5 x 7 mm3 w typowych rozdzielczościach numerycznych od 1 x 1 x 1 do 5 x 5 x 5μm3. Próbki są zatapiane w żywicy metakrylanowej i dzielone na mikrotom. Po każdym przekroju rejestrowany jest obraz powierzchni bloku za pomocą cyfrowej kamery wideo, która znajduje się na fototubie podłączonej do głowicy mikroskopu złożonego. Oś optyczna przechodzi przez kostkę filtra z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) i jest wyrównana z pozycją, w której ramię uchwytu koźlaka zatrzymuje się po każdej sekcji. W ten sposób powstaje seria naturalnie wyrównanych obrazów cyfrowych, wyświetlających kolejne powierzchnie bloków. Wczytanie takiej serii obrazów do trójwymiarowego (3D) oprogramowania do wizualizacji ułatwia natychmiastową konwersję do cyfrowych danych objętościowych, które umożliwiają wirtualne przekroje w różnych płaszczyznach ortogonalnych i ukośnych oraz tworzenie modeli komputerowych renderowanych objętościowo i powierzchniowo. Przedstawiamy trzy proste, specyficzne dla tkanek protokoły przetwarzania różnych grup próbek organicznych, w tym zarodków myszy, piskląt, przepiórek, żab i danio pręgowanych, materiału biopsyjnego człowieka, papieru niepowlekanego i materiału zastępującego skórę.

Wprowadzenie

Analiza strukturalna materiałów organicznych i nieorganicznych jest pierwszym krokiem do zrozumienia ich właściwości fizycznych i funkcji. Podstawą takiej analizy są często dwuwymiarowe (2D) informacje uzyskane poprzez uważną obserwację przekrojów histologicznych, z wykorzystaniem wielu prostych i wyrafinowanych metod obrazowania, które wydobywają szczegóły dotyczące architektury tkanki, morfologii i topologii komórek, składu molekularnego i właściwości biomechanicznych1,2,3. Jednak informacje 2D nie nadają się do badania złożonych przestrzennie układów. W związku z tym w ostatnich dziesięcioleciach powstała rosnąca liczba metod in vivo i ex vivo, które pozwalają na generowanie cyfrowych danych objętościowych4 i wiele innych jest w trakcie opracowywania.

Metodyczną zasadą większości metod generowania danych objętościowych jest generowanie wirtualnych stosów obrazów cyfrowych, wyświetlających sekcje uzyskane przez wirtualne lub fizyczne przecięcie obiektu. Jeśli obrazy przekrojów są prawidłowo wyrównane, tworzy to objętość, którą można ponownie przeciąć w wirtualnych płaszczyznach przekroju lub użyć do tworzenia renderowanych powierzchni 3D i modeli objętościowych. Popularnymi technikami wizualizacji ludzi i większych próbek biologicznych są tomografia rezonansu magnetycznego (MRT), tomografia komputerowa (CT), pozytonowa tomografia emisyjna (PET) i tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT). Małe próbki są zwykle wizualizowane za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (μMRI), optycznej tomografii projekcyjnej (OPT), optycznej koherentnej tomografii (OCT), tomografii fotoakustycznej (PAT), metod opartych na przekrojach histologicznych, mikroskopii konfokalnej i tomografii elektronowej5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Stosunkowo nową techniką generowania danych objętościowych, która pozwala na uzyskanie cyfrowych danych z małych próbek i histologicznych próbek tkanek, jest metoda HREM, która została opracowana w ścisłej współpracy z Timem Mohunem18,19. Jest to prosta technika oparta na mikroskopie, która generuje cyfrowe dane objętościowe z materiału zatopionego w żywicy, który jest podzielony na mikrotom. Dane te ułatwiają szczegółową analizę architektury tkanek i rozmieszczenia komórek, a także analizę metryczną małych cech na pośrednim poziomie mikroskopii świetlnej.

HREM tworzy stosy naturalnie wyrównanych obrazów cyfrowych, które wyglądają tak, jakby zostały uchwycone z wycinków histologicznych wybarwionych eozyną. Kontrast tkankowy i rozdzielczość danych w odniesieniu do pola widzenia przewyższają dane uzyskane za pomocą μCT, μMRI i OPT, ale są niższe niż osiągalne za pomocą mikroskopii konfokalnej, arkusza świetlnego i mikroskopii elektronowej20. Jednak w przeciwieństwie do tych ostatnich, HREM jest w stanie uwidocznić próbki o stosunkowo dużych objętościach do 5 x 5 x 7 mm3 w jakości histologicznej. Szereg ostatnich badań dostarcza szczegółowych charakterystyk i porównań zalet i wad pojedynczych technik obrazowania, a dla obiektywizmu odnosimy się do nich w celu uzyskania dalszych informacji na temat ich ograniczeń i potencjalnych obszarów zastosowań4,21,22,23,24.

To badanie skupia się na metodzie obrazowania HREM i ma na celu dostarczenie bardzo prostych protokołów generowania danych HREM dla szerokiego spektrum materiałów organicznych, jak również przykładów ich zastosowania. Przepływ pracy tworzenia danych HREM jest prosty i dotyczy wszystkich materiałów, które mogą być zatopione w żywicy metakrylanowej (rysunek 1). Istnieją jednak specyficzne dla tkanek różnice w przygotowaniu próbek, które należy wziąć pod uwagę. W związku z tym udostępniamy trzy standardowe protokoły przygotowania różnych próbek. Kroki protokołu osadzania i generowania danych są identyczne dla wszystkich z nich.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi na Uniwersytecie Medycznym w Wiedniu.

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie zarodków i tkanek zarodków (do 5 x 5 x 5 mm3 )
    1. Utrwalić zarodki lub części zarodków w 4% PFA/PBS lub utrwalaczu Bouina w temperaturze 4 °C przez co najmniej 16 - 24 godziny pod ciągłym kołysaniem.
      UWAGA: Można wykorzystać zarodki kilku gatunków i o różnych stadiach rozwoju, takie jak 48-godzinny danio pręgowany, 19-godzinne pisklę i przepiórka, a także prenatalne zarodki myszy, które zostały tutaj wykorzystane (patrz Reprezentatywne wyniki). Próbki zebrano i przeniesiono do PBS w temperaturze pokojowej w celu postawienia w miejscu, zanim utrwalono je w utrwalaczu. W razie potrzeby przytnij próbki mikronożyczkami lub skalpelami przed utrwaleniem, aby pasowały do form do zatapiania.
    2. Usunąć utrwalacz i umyć tkankę zarodkową w PBS w temperaturze 4 °C pod ciągłym kołysaniem przez 24 godziny (2-3 zmiany).
    3. Próbki odwodnić w 70%, 80%, 90%, 96% etanolu w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 godziny każda. Umieścić probówki zawierające próbki na rotatorze.
      UWAGA: W przypadku małych próbek (< 2 x 2 x 2 mm3) czas spoczynku próbki w każdym etanolu może zostać skrócony do 60 minut. W przypadku dużych próbek (> 5 x 5 x 5 mm3) czas ten można wydłużyć do 4 godzin.
    4. Następujące czynności infiltracji należy wykonać pod wyciągiem w rękawicach ochronnych.
      1. Przygotować roztwór infiltracyjny, dodając 1,25 g nadtlenku benzoilu (uplastyczniony katalizator) i 0,4 g eozyny do 100 ml roztworu A (więcej szczegółów patrz Tabela materiałów). Wymieszać to w zlewce na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze 4 °C, aż eozyna i katalizator całkowicie się rozpuszczą (2-3 godziny).
      2. Umieścić próbki na 12 - 24 godziny w roztworze infiltracyjnym. Utrzymuj go w temperaturze 4 °C przy ciągłym kołysaniu lub obracaniu. Zastąp roztwór infiltracyjny świeżym roztworem po 3 i 12 godz.
        UWAGA: Wydłużenie czasu infiltracji do 48 godzin dla dużych zarodków (> 1 cm długości korony/zadu).
  2. Przygotowanie próbek tkanek dorosłych (do 5 x 5 x 7 mm3 )
    1. Utrwalić tkanki w 2% PFA/PBS zawierającym 4% kwasu karbolowego w temperaturze 4 °C przez co najmniej 3 dni.
      UWAGA: Próbka tkanki pochodząca ze skóry, wątroby, trzustki, nerek, tarczycy, serca, mięśni poprzecznie prążkowanych, mózgu, nerwów i modeli nowotworowych kilku noworodków i dorosłych ludzi, gryzoni, świń, muszek owocowych i ryb pręgowanego może być utrwalona w tym roztworze, a następnie przetworzona do obrazowania HREM (demonstrujemy utrwalanie próbek; patrz Reprezentatywne wyniki). Próbki tkanek należy wyciąć za pomocą skalpeli, nożyczek lub stempli biopsyjnych i bezpośrednio przenieść je do utrwalacza. Do utrwalenia tkanki nerwowej należy stosować 4% PFA/PBS.
    2. Usuń utrwalacz i umyj chusteczkę pod bieżącą wodą z kranu przez 3-6 godzin.
    3. Odwodnić próbki, umieszczając je następnie w 70%, 80%, 90%, 96% etanolu, zmieszanym z 0,4 g eozyny na 100 ml (2 - 3 godziny każda). Roztwory z próbkami należy przechowywać w temperaturze 4 °C pod ciągłym kołysaniem lub na rotatorze.
      UWAGA: W przypadku małych próbek (< 2 x 2 x 2 mm3) czas spoczynku próbki w każdym etanolu może zostać skrócony do 60 minut. W przypadku dużych próbek (> 5 x 5 x 5 mm3) można go wydłużyć do 4-8 godzin.
    4. Wszystkie poniższe czynności infiltracji należy wykonać pod wyciągiem w rękawicach ochronnych.
      1. Przygotować roztwór infiltracyjny, dodając 1,25 g nadtlenku benzoilu (uplastyczniony katalizator) i 0,4 g eozyny do 100 ml roztworu A (więcej szczegółów znajduje się w Tabeli Materiałów). Wymieszać w zlewce na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze 4 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia eozyny i katalizatora (2-3 godziny).
      2. Umieścić próbki w roztworze infiltracyjnym na 24-36 godzin. Przechowywać w temperaturze 4 °C pod ciągłym kołysaniem lub obracaniem. Zastąp roztwór infiltracyjny świeżym roztworem po 3 i 12 godz.
        UWAGA: W przypadku dużych próbek (> 5 x 5 x 5 mm3) należy wydłużyć czas infiltracji do 48 godzin.
  3. Przygotowanie innego materiału organicznego
    UWAGA: Przytnij substytuty skóry i papier do pożądanego rozmiaru zwykłymi nożyczkami. Nie jest potrzebna żadna fiksacja.
    1. Pomiń etapy fiksacji, mycia i odwadniania.
    2. Wszystkie poniższe czynności infiltracji należy wykonać pod wyciągiem w rękawicach ochronnych.
      1. Przygotować roztwór infiltracyjny, dodając 1,25 g nadtlenku benzoilu (uplastyczniony katalizator) i 0,4 g eozyny do 100 ml roztworu A (więcej szczegółów znajduje się w Tabeli Materiałów). Wymieszać w zlewce o temperaturze 4 °C na magnetycznej płytce mieszającej, aż eozyna i katalizator całkowicie się rozpuszczą (2-3 godziny).
      2. Umieścić próbki w roztworze infiltracyjnym na 3 - 12 godzin. Przechowywać w temperaturze 4 °C pod ciągłym kołysaniem lub obracaniem. Zastąp roztwór infiltracyjny świeżym roztworem po 1 i 2 - 4 godzinach.

2. Osadzanie

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki pod wyciągiem w rękawicach ochronnych.

  1. Przygotować świeży roztwór infiltracyjny, jak opisano powyżej (krok 1.1.4.1). Dodać 4 ml roztworu B (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów) do 100 ml roztworu infiltracyjnego, aby przygotować roztwór do zatapiania.
    UWAGA: Jeżeli wymagana jest dokładna orientacja próbki w formach do zatapiania i aby umożliwić równoległe osadzanie kilku próbek, należy spowolnić polimeryzację roztworu podstawowego, umieszczając zlewkę w łaźni lodowej.
  2. Używaj tacek na kubki do formowania (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów) z formami o rutynowej objętości 6 x 8 x 5 mm3 lub 13 x 19 x 5 mm3 lub niestandardowymi formami o objętościach do 8 x 10 x 15 mm3 (Rysunek 2).
  3. Napełnij foremki roztworem do zatapiania i przenieś próbkę do formy za pomocą łyżki. Podczas przenoszenia upewnij się, że próbka jest całkowicie pokryta roztworem do zatapiania, aby uniknąć uwięzienia powietrza.
    UWAGA: Można to zrobić w temperaturze pokojowej, jeśli rozpocznie się natychmiast po pobraniu próbek i roztworu do zatapiania z lodówki.
    1. Zorientuj próbkę wewnątrz formy za pomocą igieł lub kleszczy.
    2. Gdy tylko roztwór do zatapiania zacznie stawać się lepki, umieść uchwyt bloku (patrz Tabela materiałów) na wierzchu formy i dodaj roztwór do zatapiania przez środkowy otwór uchwytu bloku, aż podstawa uchwytu bloku zostanie pokryta 1 - 2 mm roztworu do zatapiania.
    3. Uszczelnij tackę na kubek do formowania, pokrywając ją płynnym woskiem parafinowym i poczekaj, aż stwardnieje. Alternatywnie umieść drugą tackę na kubki do formowania do góry nogami na tacce na kubki do formowania z próbkami i uszczelnij ją taśmą samoprzylepną, aby była szczelna.
  4. Pozwól blokom zakończyć polimeryzację, przechowując szczelnie zamknięte tacki na kubki do formowania przez 1-2 dni w temperaturze pokojowej.
  5. W celu obróbki po polimeryzacji należy umieścić tacki na kubki formierskie ze spolimeryzowanymi blokami w standardowym piecu laboratoryjnym i piec w temperaturze 70 - 80 °C przez co najmniej 1 - 2 dni, aż staną się ciemnoczerwone. Wyjmij blachy z piekarnika i wyjmij bloki z formy.
    UWAGA: Pieczenie można wykonać w normalnych warunkach środowiskowych. Tackę na kubek do formowania przykrywki, która zapewnia szczelne uszczelnienie w pierwszej fazie po zatopieniu, można wyjąć, aby umożliwić sprawdzenie koloru żywicy po 10 godzinach. Natychmiast po upieczeniu żywica jest miękka, a bloki można łatwo wyjąć z tacki na kubki formierskie. W ciągu 2 - 3 godzin są twarde i można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

3. Generowanie danych

UWAGA: Prototyp HREM18,25 używany tutaj składa się z następujących elementów: (i) Mikrotom obrotowy z uchwytem blokowym, który zatrzymuje się po każdym cięciu w górnym punkcie zwrotu. (ii) Standardowy, jednorazowy nóż do mikrotomów, twardy metal, profil D (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów). (iii) Głowica mikroskopu fluorescencyjnego złożonego z rewolwerem obiektywowym i kostką filtra GFP (wzbudzenie 470/40; filtr emisyjny 525/50) w swojej osi optycznej. Oś optyczna jest ustawiona prostopadle do świeżo ściętej powierzchni bloku zamontowanego na mikrotomie i jest utrzymywana przez urządzenie, które umożliwia ruch w górę i w dół. (iv) Zmotoryzowany stół krzyżowy z mikrotomem. Stół można przesuwać w kierunku osi optycznej i w bok. (v) Cyfrowa kamera wideo podłączona do fluorescencyjnego mikroskopu złożonego. (vi) monochromatyczne źródło światła (470 nm). (vii) Komputer podłączony do aparatu z oprogramowaniem do generowania danych (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów).

  1. procedura
    1. Wskaż obszar zainteresowania.
      1. Użyj standardowego laboratoryjnego źródła światła (patrz Tabela materiałów) do kierowania białego światła ukośnie na powierzchnię bloku.
      2. Zidentyfikuj kontury osadzonego materiału podczas jego rzutowania na powierzchnię bloku. Wskaż obszar zainteresowania i późniejsze pole widzenia na powierzchni bloku za pomocą pisaka lub żyletki.
        UWAGA: Ten krok jest obowiązkowy do zdefiniowania zakresu pola widzenia przed przekrojem.
    2. Określ pole widzenia.
      1. Zamontuj blok żywicy z próbką na mikrotomie.
      2. Przesuń uchwyt bloku do pozycji zatrzymania (górny punkt obrotu przesunięcia uchwytu bloku).
      3. Uruchom aparat cyfrowy i oprogramowanie do generowania danych, a następnie uzyskaj obraz na żywo.
      4. Wybierz soczewkę obiektywową o odpowiednim powiększeniu, aby pokryć obszar zainteresowania wskazany na powierzchni bloku.
        UWAGA: Powszechnie stosowane są obiektywy o powiększeniach 2,5x, 5x, 10x, 20x i przysłonach numerycznych od 0,07 do 0,40.
      5. Przesuwaj optykę w górę i w dół, a mikrotom na boki za pomocą zmotoryzowanego stołu krzyżowego, aż obszar zainteresowania dopasuje się do pola widzenia wyświetlanego na ekranie komputera.
    3. ognisko.
      1. Wykonuj ręczne cięcie krok po kroku, aż pierwsze struktury próbki staną się widoczne.
      2. Ułóż powierzchnię bloku w płaszczyźnie ostrości układu optycznego, przesuwając mikrotom w kierunku osi optycznej.
      3. Wybierz grubość przekroju; zalecane są grubości przekroju od 0,5 do 5 μm.
  2. Generowanie i przetwarzanie danych
    1. Uruchom procedurę oprogramowania, która koordynuje sekcje i przechwytywanie obrazów. Postępuj zgodnie z udokumentowanymi instrukcjami oprogramowania do przechwytywania obrazowania.
    2. Przerwij procedurę oprogramowania i umieść szkiełko skalujące przed powierzchnią bloku, gdy tylko próbka zostanie całkowicie przecięta.
    3. Interaktywne przechwytywanie obrazu w celu późniejszej kalibracji.
      UWAGA: Należy to zrobić za każdym razem, gdy cel jest używany w nowo zaaranżowanej konfiguracji.
    4. Przekonwertuj serię obrazów na 8-bitowe obrazy w skali szarości in.jpg formatem.
    5. Załaduj serie obrazów do oprogramowania do wizualizacji 3D i dostosuj kontrasty.
      UWAGA: Konwersję obrazu i wizualizację 3D można wykonać za pomocą różnych dostępnych na rynku lub bezpłatnie standardowych pakietów oprogramowania, postępując zgodnie z instrukcjami odpowiedniego oprogramowania.

Wyniki

HREM generuje serie naturalnie wyrównanych obrazów cyfrowych o kontraście zbliżonym do obrazów histologicznych przekrojów barwionych hematoksyliną i eozyną. W przeciwieństwie do dwuwymiarowych obrazów przekrojów, stosy obrazów HREM umożliwiają wizualizację i analizę architektury tkankowej, morfologii oraz topologii szerokiej gamy materiałów organicznych w 3D. Wysoki kontrast często ułatwia szybką i prostą wizualizację 3D komputerowych modeli renderowanych objętościowo oraz półautomatyczne wyznaczanie konturów w celu generowania modeli renderowanych powierzchniowo.

Rozmiar danych HREM różni się w zależności od rozmiaru pola widzenia kamery, trybu przechwytywania obrazów (8, 12, 16 bitów, skala szarości, kolor) oraz liczby obrazów pojedynczych powierzchni bloków. Mniejsze zestawy danych zawierające 1 000 obrazów w skali szarości w formacie 8-bit.jpg o rozdzielczości 2 048 pikseli x 2 048 pikseli mają rozmiar około 900 MB. Większe zestawy danych obejmujące 3 000 obrazów w skali szarości w formacie 8-bit.jpg o rozdzielczości 4 096 pikseli x 4 096 pikseli mają objętość około 20 GB.

Przedstawione protokoły są proste i niezawodne i w ciągu ostatniej dekady były wykorzystywane do generowania danych HREM dla wielu różnych okazów. Sekcja 1.1 protokołu została zoptymalizowana pod kątem przetwarzania całych embrionów organizmów modelowych z zakresu biomedycyny o długości do 1 cm oraz próbek tkanek embrionalnych o wymiarach do 5 x 5 x 5 mm3; metodę tę zastosowaliśmy do uzyskania danych HREM embrionów następujących gatunków: myszy (Mus musculus), kurczaka (Gallus gallus), danio pręgowanego (Danio rerio), przepiórki (Coturnix coturnix), żaby pazuremnej afrykańskiej (Xenopus laevis), konia (Equus ferus caballus), pluskwiaka mleczowego (Oncopeltus fasciatus), krokodyla (Crocodylia) oraz ośmiornicy (Octopus vulgaris). Dane dla wszystkich gatunków były bardzo wysokiej jakości (np. Rysunek 3)

Sekcja 1.2 protokołu została zoptymalizowana do przetwarzania próbek tkanek młodzieńczych i dorosłych o wymiarach do 5 x 5 x 7 mm3 i zastosowana do wizualizacji próbek tkanek skóry, wątroby, trzustki, nerek, tarczycy, serca, mięśni poprzecznie prążkowanych, mózgu, nerwów oraz modeli nowotworowych pobranych od ludzi (Homo sapiens), myszy (Mus musculus), szczurów (Rattus norvegicus), świń (Sus scrofa domestica), fretki (Mustela furo), muszki owocowej (Drosophila melanogaster) i danio pręgowanego (Danio rerio). Chociaż w przypadku większości okazów wyniki były doskonałe (np. Rysunek 4, Animacja 1), bardzo centralne części próbek skóry (z naskórkiem) oraz mózgu o wymiarach większych niż 3 x 3 x 3 mm3 często pozostawały niebarwione z powodu niewystarczającej penetracji eozyny przez te tkanki.

Sekcja 1.3 protokołu została zoptymalizowana pod kątem przetwarzania włóknistego materiału organicznego i wykorzystana do wizualizacji architektury włókien papieru powlekanego, papieru niepowlekanego, natywnego materiału substytutu skóry oraz materiału substytutu skóry zasianego komórkami macierzystymi. Próbki te były łatwe i szybkie w obróbce. Dane dotyczące papieru niepowlekanego oraz większości substytutów skóry były wysokiej jakości (Rycina 5, Animacja 2). Problemy wystąpiły podczas przetwarzania papieru powlekanego, gdy materiał nieorganiczny utrudniał penetrację eozyny. Inny problem pojawił się podczas przetwarzania substytutów skóry na bazie agaru, ponieważ zostały one częściowo strawione przez roztwór infiltracyjny.

Schemat przygotowania komórkowego: fiksacja, odwodnienie, infiltracja, zatapianie, proces generowania danych HREM.
Rysunek 1: Schemat postępowania. Kroki przedstawione w czerwonych polach wymagają modyfikacji w zależności od charakterystyki próbki. Kroki w zielonych polach są takie same dla wszystkich próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja formy silikonowej do procesu odlewania, zawierająca otwory okrągłe i kopułkowate, tworzenie materiału.
Rycina 2: Dostosowane formy. Formy można modyfikować poprzez wycięcie otworu w oryginalnej formie, włożenie końcówki pipety Pasteura i uszczelnienie jej materiałem modelarskim. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Etapy rozwoju zarodka, obrazy z mikroskopii świetlnej, widoki przekrojów, badanie struktury anatomicznej.
Rycina 3: Przykładowe wizualizacje zarodków. (A, B) Zarodek myszy pobrany w dniu embryonicznym E=9.5. W części (A) przedstawiono obraz przekroju HREM. W części (B) pokazano 3D model z renderowaniem objętościowym przedstawiający powierzchnię. (C) Wirtualny przekrój strzałkowy przez model z renderowaniem objętościowym szyi zarodka myszy w stadium E15.5. (D) Zarodek kurczaka w stadium rozwoju Hamburger-Hamilton (HH) 18. Model powierzchniowy światła komponentów sercowo-naczyniowych połączony z renderowaniem objętościowym wszystkich tkanek zarodka. Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Oceny histologiczne; obrazy z mikroskopii elektronowej; struktury komórkowe; analiza tkanek; badanie.
Rycina 4: Przykładowa wizualizacja próbek tkanek dorosłych. (A) Fragment obrazu z przekroju HREM przez ludzki nerw. Wstawka przedstawia szczegółowy fragment obrazu. (B) Fragment obrazu z przekroju HREM przez wątrobę świni. Zwróć uwagę na jądra komórkowe. (C) Fragment obrazu z przekroju HREM ludzkiej tkanki limfatycznej. (D, E) Gruba skóra opuszki kciuka człowieka. Model 3D z renderowaniem objętościowym całej biopsji. (D) Modele z renderowaniem powierzchni tętnic, żył i nerwów na tle wirtualnego przekroju wykonanego na podstawie danych HREM (E). (F) Nowotwór eksperymentalny w tkance dorosłej myszy. Model 3D z renderowaniem objętościowym na tle trzech wirtualnych przekrojów wykonanych na podstawie danych HREM. Zwróć uwagę na obszary martwicze (groty strzałek). Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikroskopowa włókien naturalnych; obejmuje badanie struktury celulozy i tekstury powierzchni.
Rysunek 5: Przykładowa wizualizacja materiału włóknistego. (A, B) Obraz przekroju HREM niepowlekanego brązowego papieru. (B) przedstawia fragment obrazu (A). Zwróć uwagę na włókna i ich kanały światła. (C) Przekrój HREM papieru powlekanego. Zauważ, że włókna pozostają niebarwione. (D) Model renderowany objętościowo natywnego materiału zastępczego skóry właściwej. Zwróć uwagę na różny kaliber i formę włókien. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obraz tomografii komputerowej meduzy ukazujący anatomię wewnętrzną w wizualizacji 3D do badań biologicznych.
Animacja 1: Model z renderowaniem objętościowym grubej skóry opuszki kciuka człowieka. Rozmiar bloku tkanki wynosi około 4.2 x 2.7 x 2.7 mm3. Rozmiar woksela to 1.07 x 1.07 x 2 µm3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Renderowany obraz mikroskopowy 3D przedstawiający strukturę sieci neuronowej w tkance mózgowej do badań z zakresu neuronauki.
Animacja 2: Model renderowany objętościowo natywnego materiału substytutu skóry. Rozmiar próbki wynosi w przybliżeniu 1.2 x 0.85 x 0.4 mm3. Rozmiar woksela wynosi 0.54 x 0.54 x 2 µm3. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

HREM to wysoce wytrzymała metoda mikroskopowa, która idealnie nadaje się do wizualizacji szerokiego spektrum materiałów organicznych stosowanych w biomedycynie i przemyśle 18,21,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37, 38,39,40. Może być stosowany jako wyłączna metoda obrazowania, jak to jest obecnie używane w programie Mechanizmy Zaburzeń Rozwojowych (DMDD) 41,42,43,44, lub jako integralna część procesów obrazowania multimodalnego45.

W pełni funkcjonalna aparatura do generowania danych HREM może być złożona z konwencjonalnych komponentów laboratoryjnych i składa się z zmotoryzowanego mikrotomu, mikroskopu, zmotoryzowanego stołu krzyżowego oraz komputera z odpowiednim oprogramowaniem25. Bardzo ważne jest, aby używać mikrotomu wyposażonego w uchwyt blokowy, który w powtarzalny sposób zatrzymuje się po każdej sekcji w określonej pozycji oraz kostki filtra GFP wewnątrz ścieżki optycznej. Jednak w pełni funkcjonalne rozwiązania all-inclusive można nabyć w firmach takich jak Indigo Scientific.

HREM napotyka te same ograniczenia, co wszystkie techniki histologiczne, z wyjątkiem tego, że podczas cięcia lub montażu sekcji nie są wprowadzane żadne artefakty. Istnieją jednak ograniczenia, które wynikają z konieczności barwienia próbek przed sekcją oraz z charakterystyki materiału do zatapiania. Przenikanie eozyny przez całą próbkę jest wymagane w celu uzyskania wystarczających kontrastów tkankowych; Bardzo gęsty materiał, tkanki tłuszczowe i substancje nieorganiczne skutecznie utrudniają przenikanie eozyny, co skutkuje powstawaniem niezabarwionych tkanek w centrum obiektów. Stosowanie specjalnych utrwalaczy pomaga zabarwić próbki skóry, ale nadal nie ma właściwej metody na pełne przezwyciężenie problemu. Kolejnym ograniczeniem jest to, że żywice, które blokują się wyżej niż 2 cm, mają tendencję do pękania podczas cięcia. Można tego częściowo uniknąć, wycinając próbki i przetwarzając części oddzielnie.

Prawidłowe umieszczanie małych próbek lub próbek o nieregularnych powierzchniach w formach podczas zatapiania jest często problematyczne. Pokrycie próbek agarozą i przetworzenie bloków agarozy zgodnie z opisem w protokole zwykle rozwiązuje ten problem19. Alternatywnym podejściem, które pomaga również w przypadku pęknięcia klocków podczas cięcia, jest wyjęcie już utwardzonego bloku z jego uchwytu i osadzenie go na nowo, zgodnie z opisaną procedurą zatapiania.

Typowy zestaw danych HREM składa się z 500 do 3 000 pojedynczych obrazów. Jego rozdzielczość numeryczna zależy od odległości między kolejnymi obrazami (tj. grubości przekroju), charakterystyki celu kamery oraz właściwości zastosowanej optyki. Zastosowaliśmy grubości przekrojów od 1 μm do 5 μm i osiągnęliśmy dobre wyniki, chociaż przedstawione protokoły nie eliminują całkowicie błyszczenia artefaktów 20,46. Artefakty te są spowodowane przez intensywnie wybarwione tkanki znajdujące się głęboko w bloku, co powoduje rozmycie informacji tkankowych na powierzchni bloku.

Kamery miały docelowe wymiary 2 560 x 1 920 pikseli2, 2 048 x 2 048 pikseli2 i 4 096 x 4 096 pikseli2 i były połączone z obiektywami 1,25X, 2,5X, 5X, 10X i 20X. W rezultacie uzyskano numeryczne rozmiary pikseli od 0,18 x 0,18μm2 do 5,92 x 5,92μm2, które okazały się wystarczające do analizy 3D architektury tkanek i kształtów komórek, a nawet do wizualizacji jąder. Biorąc pod uwagę wysoką rozdzielczość numeryczną, inne organelle komórkowe również powinny być widoczne. Niewystarczające kontrasty spowodowane prostym barwieniem eozyną oraz właściwości optyczne obiektywów znacznie zmniejszają możliwość rozróżnienia struktur. Maksymalna rzeczywista rozdzielczość przestrzenna danych HREM, która uwzględnia aperturę numeryczną, wynosi około 1 x 1 x 1 μm3, a zatem pozwala na skuteczną dyskryminację tylko struktur większych niż około 3 x 3 x 3 μm3 3 .

Wspólnym problemem wszystkich technik obrazowania cyfrowego jest kompromis między rozmiarem pola widzenia, które określa część próbki, która może być wyświetlana na tarczy kamery, a rozdzielczością numeryczną obrazu. Im większe pole widzenia, tym mniejsza maksymalna możliwa rozdzielczość numeryczna46. Zastosowana tutaj konfiguracja HREM umożliwia generowanie danych HREM o polu widzenia w zakresie 0,74 x 0,74 mm2 (obiektyw 20X) wyświetlanych w rozdzielczości numerycznej 0,18 x 0,18μm2 i 12,12 x 12,12mm2 (obiektyw 1,25X) wyświetlanych w rozdzielczości numerycznej 2,96 x 2,96μm2. Alternatywne, skomercjalizowane konfiguracje mogą zapewnić większe pola widzenia, ale kosztem prawdziwej rozdzielczości. Niemniej jednak zapewniają doskonałe wyniki, co wynika z danych wyświetlanych na stronie głównej programu DMDD47.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Timowi Mohunowi za jego innowacyjny wkład w rozwój HREM oraz Petrze Heffeter za dostarczenie próbek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do osadzania JB-4 PlusPolysciences Europe GmbH18570-1zawiera nadtlenek benzoilu, plastyfikowane (katalizator) i roztwór Tacki
kubki z polietylenu A + B, sześciokąt 6 x 8 x 5 mm (9 wnęk)Polysciences Europe GmbH17177A-3
Tacki na kubki z polietylenu, 13 x 19 x 5 mm (9 wnęk)Polysciences Europe GmbH17177C-3 JB-4
Plastikowe uchwyty na blokiPolysciences Europe GmbH15899-50
EosinWaldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma1A-196
Microtec CUT 4060EMikrotom obrotowy
Leica DM LM, mikroskop fluorescencyjnyLeica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
11090937180000
Zmotoryzowany stół krzyżowyWalter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KGKT5-LSMA
Cyfrowa kamera wideo SPOT-FLEXVisitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LEDVisitron Systems GmbH.źródło światła
VisiView 2.1.4Visitron Systems GmbH.Oprogramowanie do przechwytywania obrazu
Nóż z twardego metalu (węglik wolframu), profil DLeica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCDŹródło światłaSchott AG
na Zestaw filtrów GFP

Bibliografia

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004(2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1(2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protokół HREMobrazowanie materiału organicznegocięcie mikrotomemzatapianie w żywicy metakrylowejcyfrowe dane wolumetryczneoprogramowanie do wizualizacji 3Dkostka filtru GFPprzetwarzanie tkanek embrionalnychanaliza materiału biopsycznego
Mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) - proste i niezawodne protokoły przetwarzania i wizualizacji materiałów organicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.