Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wśród różnych modeli uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczurów, najczęściej używany jest model kontuzji, ponieważ jest to najczęstszy rodzaj uszkodzenia rdzenia kręgowego u człowieka. Kompletny model transsekcji, choć nie tak istotny klinicznie jak model stłuczenia, jest najbardziej rygorystyczną metodą oceny regeneracji aksonów. W modelu kontuzji trudno jest odróżnić aksony zregenerowane od porośniętych lub oszczędzonych ze względu na obecność pozostałej tkanki po urazie. W kompletnym modelu transsekcji konieczna jest metoda mostkowa, aby wypełnić lukę i stworzyć ciągłość od kikutów rostralnych do ogonowych w celu oceny skuteczności zabiegów. Niezawodna chirurgia pomostowa jest niezbędna do testowania miar wyników poprzez zmniejszenie zmienności wynikającej z metody chirurgicznej. Opisane tutaj protokoły służą do przygotowania komórek Schwanna (SC) i przewodów przed przeszczepem, całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego na poziomie klatki piersiowej 8 (T8), wprowadzenia przewodu i przeszczepienia SC do przewodu. Podejście to wykorzystuje również żelowanie in situ wstrzykiwanej macierzy błony podstawnej z przeszczepem SC, co umożliwia lepszy wzrost aksonów w poprzek interfejsów rostralnych i ogonowych z tkanką gospodarza.
Wprowadzenie
Naprawa urazów rdzenia kręgowego to złożony i wymagający problem, który będzie wymagał kombinatorycznej strategii leczenia, obejmującej, na przykład, użycie komórek i biomateriału w celu zapewnienia korzystnego mikrośrodowiska dla funkcji przeszczepionej komórki i regeneracji aksonów w miejscu urazu. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 i zakończ transsection1....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Samice dorosłych szczurów Fischer (180 - 200 g masy ciała) są trzymane zgodnie z wytycznymi NIH i USDA. Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) Uniwersytetu w Miami zatwierdził wszystkie procedury na zwierzętach.
1. Przygotowanie do przeszczepu
- Przygotowanie przewodu.
- Przyciąć przewód do długości 5 mm za pomocą ostrza #10 pod mikroskopem preparacyjnym.
UWAGA: Średnica wewnętrzna przewodu wynosi od 2,4 do 2,7 mm; Średnica zewnętrzna wynosi od 2,5 do 2,8 mm. - Delikatnie złóż przewód wzdłuż podłużnej strony (Rysunek 1A....
- Przyciąć przewód do długości 5 mm za pomocą ostrza #10 pod mikroskopem preparacyjnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Celem zastosowania tej techniki chirurgicznej jest ocena wykorzystania ustrukturyzowanego przewodu i wstrzykiwalnej macierzy, które maksymalizują funkcję SC po transplantacji do całkowicie przerwanych rdzeni kręgowych. Trzy tygodnie po transplantacji zwierzęta są perfundowane 4% paraformaldehydem, a kolumny kręgowe są makroskopowo preparowane i utrwalane w tym samym utrwalaczu przez kolejne 24 h. Następnie rdzeń kręgowy jest preparowany, a próbki do sagittalnych przekrojów krioskopowych s.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszym krokiem w tworzeniu skutecznego modelu przecięcia jest przecięcie rdzenia kręgowego w jednym lub dwóch cięciach. W miejscu przecięcia powinna być obecna szczelina 2-2,5 mm między kikutami rostralnymi i ogonowymi rdzenia kręgowego. Trzy najbardziej prawdopodobne powody, dla których taka przerwa się nie pojawiła, to: (1) korzenie grzbietowe/brzuszne nie zostały prawidłowo usunięte, (2) opona twarda brzuszna nie została odpowiednio usunięta i/lub (3) zwierzę nie zostało prawidłowo umieszczone na rolce umieszc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Wektorom Wirusowym i Rdzeniom Zwierzęcym z Miami Project to Cure Paralysis za wyprodukowanie wirusa lenti-GFP i zapewnienie opieki nad zwierzętami, odpowiednio, oraz Rdzeniom Histologii i Obrazowania za użycie kriostatu, mikroskopu konfokalnego i mikroskopu fluorescencyjnego z Stereo Investigator. Finansowanie zostało zapewnione przez NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) i NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge jest profesorem neurologii im. Christine E Lynn
.....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fiolki kriogeniczne | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm szalka Petriego | VWR | 25382-428 | |
| Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco: mieszanka składników odżywczych F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" w protokole. |
| Penicylina-streptomycyna | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" w protkol. |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclon | SH300-70-03 | "FBS" w protokole. |
| Ekstrakt z przysadki mózgowej | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R& D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lizyna | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" w protokole. |
| Zmodyfikowane medium Eagle firmy Dulbecco | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" w protokole. |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" w protokole. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Samica szczura Fischer (160-180g) | Nożyczki Envigo | ||
| Vannas, proste | FST | 15018-10 | |
| Ketamina | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycyna | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Może być dowolną marką. |
| Mikroszpatułka | FST | 10089-11 | Może być dowolnej marki. |
| Zakrzywione nożyczki z końcem | FST | 14017-18 | Może być dowolną marką. |
| Kleszcze | FST | 11006-12 | Może być dowolnej marki. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Może być dowolną marką do wyboru. |
| Nożyczki sprężynowe kątowe | FST | 15006-09 | Może być dowolnej marki. |
| Trójkąty absorpcyjne | FST | 18105-03 | Może być dowolną marką. |
| Pianka żelowa | Henry Schein | 9083300 | "Pianka skompresowana" w protokole. |
| #10 ostrzy | Sklar | 06-3010 | Może być dowolną marką. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Matryca iniekcyjna" w protokole. |
| Przeciwciało białkowe przeciw zielonej fluorescencji | Mysz Millipore | AB16901 | |
| RT97 Przeciwciało hybrydoma | DSHB | RT97 | |
| Przeciwciało anty-neurofilamentowe królika | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Poliklonalne królik anty-glejowe fibrylarne kwaśne przeciwciało | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-kurczaka IgG (H + L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 kozia anty-królicza IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 kozia anty-królicza IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 kozia anty-mysia IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Mikroskopia konfokalna | Nikon | clsi |
Bibliografia
- King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
- Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
