Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56077

⸱

3 listopada 2017

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Streszczenie

Wśród różnych modeli uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczurów, najczęściej używany jest model kontuzji, ponieważ jest to najczęstszy rodzaj uszkodzenia rdzenia kręgowego u człowieka. Kompletny model transsekcji, choć nie tak istotny klinicznie jak model stłuczenia, jest najbardziej rygorystyczną metodą oceny regeneracji aksonów. W modelu kontuzji trudno jest odróżnić aksony zregenerowane od porośniętych lub oszczędzonych ze względu na obecność pozostałej tkanki po urazie. W kompletnym modelu transsekcji konieczna jest metoda mostkowa, aby wypełnić lukę i stworzyć ciągłość od kikutów rostralnych do ogonowych w celu oceny skuteczności zabiegów. Niezawodna chirurgia pomostowa jest niezbędna do testowania miar wyników poprzez zmniejszenie zmienności wynikającej z metody chirurgicznej. Opisane tutaj protokoły służą do przygotowania komórek Schwanna (SC) i przewodów przed przeszczepem, całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego na poziomie klatki piersiowej 8 (T8), wprowadzenia przewodu i przeszczepienia SC do przewodu. Podejście to wykorzystuje również żelowanie in situ wstrzykiwanej macierzy błony podstawnej z przeszczepem SC, co umożliwia lepszy wzrost aksonów w poprzek interfejsów rostralnych i ogonowych z tkanką gospodarza.

Wprowadzenie

Naprawa urazów rdzenia kręgowego to złożony i wymagający problem, który będzie wymagał kombinatorycznej strategii leczenia, obejmującej, na przykład, użycie komórek i biomateriału w celu zapewnienia korzystnego mikrośrodowiska dla funkcji przeszczepionej komórki i regeneracji aksonów w miejscu urazu. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 i zakończ transsection10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 Modele są często wykorzystywane do oceny efektów terapii pomostowych opartych na biomateriale. Zaletą stosowania modelu hemisekcji jest to, że zapewnia on większą stabilność konstrukcji mostkowej w porównaniu z pełnym przecięciem. Jednak w modelach hemisekcji trudno jest udowodnić regenerację aksonów jako wynik zastosowanej metody terapeutycznej ze względu na obecność oszczędzonej tkanki. Kompletny model przecięcia jest najbardziej rygorystyczną metodą demonstracji regeneracji aksonów.

Różne naturalne i syntetyczne materiały zostały przebadane pod kątem użycia jako żel do wstrzykiwań, wstępnie uformowany żel umieszczony w modelach stłuczenia lub hemisekcji, lub jako strukturalny kanał do modeli hemisekcji lub kompletnych transsekcji (szczegółowo opisanych w recenzjach23,24,25). Żelowanie in situ mieszaniny matrycy/SC do wstrzykiwań tworzy bardziej permisywny interfejs między przeszczepem a sznurem gospodarza dla krzyżowania aksonów26,27 w porównaniu z wstępnie zżelowanymi implantami matrix/SC5,18,19,28. Żelowanie in situ pozwoliło matrycy na konturowanie wokół nieregularnych interfejsów hosta, podczas gdy bardziej sztywny i ustrukturyzowany przewód lub mniej podatny na formowanie, wstępnie uformowany żel nie mógł. Strukturalny przewód często zapewnia prowadzenie kontaktu i stabilność implantu, w przeciwieństwie do matrycy do wstrzykiwań. Przedstawione tutaj protokoły opisują procedurę chirurgiczną, która wykorzystuje zarówno wstrzykiwalną macierz błony podstawnej (np. Matrigel, patrz Tabela materiałów, określana tutaj jako matryca do wstrzykiwań), jak i ustrukturyzowany przewód do oceny regeneracji aksonów w najbardziej rygorystycznym modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego.

Elektroprzędzone włókniste puste przewody z poli-winylidenodifluorku trifluoroetylenu (PVDF-TrFE) są używane w naszym eksperymentalnym podejściu. PVDF-TrFE jest polimerem piezoelektrycznym, który generuje ładunek przejściowy po mechanicznym odkształceniu i wykazano, że sprzyja wydłużaniu neurytów i regeneracji aksonów zarówno in vitro29,30, jak i in vivo31. Elektroprzędzenie jest powszechną metodą wytwarzania rusztowań, która pozwala szybko wytworzyć niezawodne rusztowania włókniste przy użyciu różnych polimerów o kontrolowanych właściwościach, takich jak wyrównanie włókien, średnica włókien i grubość rusztowania do zastosowań neuronowych i innych32,33,34.

Liczne badania na szczurach SC przeszczepionych do miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego wykazały skuteczność leczenia5,9,18,19,20,21,26. Przeszczepy te działają neuroprotekcyjnie na tkankę otaczającą zmianę, zmniejszają rozmiar jamy zmiany i wspomagają regenerację aksonów do miejsca zmiany / przeszczepu oraz mielinizację zregenerowanych aksonów. Ludzkie SC mogą być przeszczepiane autologicznie, co jest zaletą w porównaniu z większością innych komórek związanych z neuronami24. Po biopsji nerwów obwodowych SC można wyizolować i oczyścić, a następnie rozprzestrzenić się do pożądanej ilości do przeszczepu ludziom. Udowodniono, że autologiczny przeszczep SC u pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego jest bezpieczny w Iranie35,36,37,38, Chiny39,40 oraz Stany Zjednoczone41,42. Wiadomo, że SC wydzielają liczne czynniki neurotroficzne i białka macierzy zewnątrzkomórkowej ważne dla wzrostu aksonów i odgrywają istotną rolę w regeneracji aksonów po uszkodzeniu nerwów obwodowych. Naszym celem jest tutaj opisanie metod, które mogą badać projekty przewodów w celu poprawy wyników przeszczepu SC w kompletnym modelu przecięcia rdzenia kręgowego szczura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Samice dorosłych szczurów Fischer (180 - 200 g masy ciała) są trzymane zgodnie z wytycznymi NIH i USDA. Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) Uniwersytetu w Miami zatwierdził wszystkie procedury na zwierzętach.

1. Przygotowanie do przeszczepu

  1. Przygotowanie przewodu.
    1. Przyciąć przewód do długości 5 mm za pomocą ostrza #10 pod mikroskopem preparacyjnym.
      UWAGA: Średnica wewnętrzna przewodu wynosi od 2,4 do 2,7 mm; Średnica zewnętrzna wynosi od 2,5 do 2,8 mm.
    2. Delikatnie złóż przewód wzdłuż podłużnej strony (Rysunek 1A). Wytnij cztery małe nacięcia o długości około 0,4 mm i co najmniej 1 mm od otworów przewodu i w odległości około 1 mm od siebie za pomocą nożyczek Vannas o prostej krawędzi (Rysunek 1B).
      1. Rozłóż przewód (Rysunek 1C) i przetnij między dwoma nacięciami po tej samej stronie, tworząc dwa okna obok siebie (Rysunek 1D). Upewnij się, że okna można prawidłowo otwierać i zamykać wzdłuż nieobciętej strony.
    3. Sterylizuj przewody w 75% etanolu przez 25 minut na 10-centymetrowej szalce Petriego. Przepłukać przewody raz przez 4 minuty 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przenieść przewody za pomocą sterylnych kleszczy na nową 10-centymetrową szalkę Petriego. Przepłucz przewody dwukrotnie 1x PBS przez 25 minut każdy.
    4. Przechowuj przewody w 1x PBS do czasu operacji.
      UWAGA: Wiele przewodów może być sterylizowanych jednocześnie. Przechowuj przewody w oddzielnych sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, aby zachować ich sterylność.
  2. Preparat z białka zielonej fluorescencji (GFP)-komórek Schwanna (SC)
    1. Przygotuj oczyszczone kultury SC z nerwów piszczelowych dorosłych samic szczurów Fischer, jak opisano wcześniej43. Po zakończeniu tego etapu, pokryj SC na 10-centymetrowych szalkach Petriego pokrytych poli-L-lizyną (PLL) i utrzymuj w pożywce D10/3M; te SC są zdefiniowane jako przejście 0,
      UWAGA: Pożywka D10/3M składa się z następujących składników: 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec), 20 μg/ml ekstraktu z przysadki mózgowej, 2 μM forskoliny, 2,5 nM hereguliny w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco.
    2. Uzupełniaj świeżą pożywką D10/3M (7 ml/10 cm szalka Petriego) co 3 do 4 dni.
    3. Podziel kulturę SC, gdy osiągnie 70-80% konfluencji.
      1. Usuń podłoże i spłucz dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) bez wapnia i magnezu.
      2. Dodaj 5 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej 10-centymetrowej szalki Petriego i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      3. Dodaj 5 ml pożywki D10 (10% FBS i 1% pióra/paciorkowca w DMEM) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby zneutralizować trypsynę.
      4. Delikatnie odpipetować roztwór trypsyny/EDTA do szalki Petriego kilka razy, aby odłączyć SC. Usunąć zawiesinę komórkową z naczynia i umieścić ją w probówce wirówkowej przygotowanej w poprzednim kroku. Opłucz naczynie 5 ml pożywki D10 i umieść ją w probówce wirówkowej, aby zmaksymalizować pobranie komórek.
      5. Odwirować komórki przy ciśnieniu 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce o objętości 4 ml D10/3M dla każdej podziałki na płytkę Petriego.
      6. Dozować 1 ml zawiesiny SC i 6 ml pożywki D10/3M do 10-centymetrowej szalki Petriego; każde rozdrobnienie szalki Petriego da 4 szalki Petriego. Te SC są zdefiniowane jako przejście 1.
      7. Uzupełnij świeżą pożywką D10/3M dzień po poszyciu i co 3-4 dni po poszyciu.
      8. Gdy SC osiągną zbieżność 70-80%, powtórz kroki od 1.2.3.1 do 1.2.3.6. SC znajdują się teraz w przejściu 2.
    4. Transdukuj SC raz osiągając 50% konfluencji, za pomocą wektora lentiwirusowego kodującego GFP w pożywce D10/3M przez noc przy wielokrotności infekcji 30, jak opisano wcześniej 44,45.
    5. Uzupełnij świeżą pożywką D10/3M następnego dnia i co 3-4 dni po posiewaniu.
    6. Gdy GFP-SC osiągną zbieżność 70-80%, powtórz kroki od 1.2.3.1 do 1.2.3.5, ale zamiast tego ponownie zawieś GFP-SC w 6 ml pożywki D10. Dozować 15 μl zawiesiny GFP-SC do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 15 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie przesunąć probówkę wirówkową i wlać 10 μl mieszaniny do komory szkiełka do liczenia komórek.
      1. Umieść szkiełko w automatycznym liczniku komórek i określ gęstość komórek.
    7. Odwirować komórki w temperaturze 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić 1,5 ml pożywki zamrażającej na każde 3x106 GFP-SC. Dozować 1,5 ml zawiesiny GFP-SC do fiolki kriogenicznej i zamrażać w temperaturze -80oC przez co najmniej 24 godziny przed przejściem do ciekłego azotu w celu przechowywania><. UWAGA: Podłoże zamrażające: 25% FBS i 8% dimetylosulfotlenku w DMEM.
    8. Rozmrozić GFP-SC na tydzień przed zabiegiem.
      1. Dodaj 10 ml pożywki D10 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      2. Rozmrażać fiolki z zamrożonymi GFP-SC w łaźni wodnej w temperaturze 37 oC aż do częściowego rozmrożenia.
      3. Usunąć zawiesinę GFP-SC z fiolki kriogenicznej i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przygotowanej w ppkt 1.2.8.1. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół.
      4. Odwirować komórki w temperaturze 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki D10/3M na każdą rozmrożoną fiolkę.
      5. Dozować 2 ml zawiesiny GFP-SC i 5 ml pożywki D10/3M na 10-centymetrową szalkę Petriego; w wyniku każdej fiolki powinny znajdować się 2 szalki Petriego. GFP-SC są zdefiniowane jako przejście 3.
        UWAGA: Z 10-centymetrowej szalki Petriego zwykle po tygodniu powstaje około 8x106 GFP-SC.
    9. W dniu zabiegu powtórz krok 1.2.6. Użyj gęstości komórek obliczonej w kroku 1.2.10.
    10. Dozować podwielokrotności 3x106 GFP-SC do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml w oparciu o gęstość komórek obliczoną z kroku 1.2.9. Odwirować porcje GFP-SC przy 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 otemperaturze C i usunąć supernatant. Dodać 1 ml pożywki DMEM/F12 do każdej podwielokrotności i odwirować przy 370 x g.
      UWAGA: Każde zwierzę otrzymuje 3x106 GFP-SCs. Pożywka z surowicą jest używana z GFP-SC do tego etapu.
    11. Przechowywać GFP-SC na lodzie do czasu przeszczepienia.

2. Ukończ przecięcie na poziomie klatki piersiowej 8 (T8)

  1. Przygotowanie zwierząt do operacji
    1. Znieczulić samicę szczura Fischera (180-200 g) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy (60 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (5 mg/kg masy ciała). Monitoruj głębokość znieczulenia przed przejściem do następnego kroku, sprawdzając reakcje szczypania palców u nóg i mrugania oczami.
    2. Ogol grzbiet szczura elektryczną maszynką do strzyżenia i przetrzyj skórę 70% etanolem. Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy. Przenieś zwierzę na stół operacyjny na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie około 37 oC. Umieść zwierzę na rolce, aby kręgi były łatwo dostępne.
      UWAGA: Rolka może być wykonana z ręcznika papierowego lub gazy 2 cale x2, którą można sterylizować. Większe rolki są zalecane, gdy T7-T9 musi być ułożony płasko na wierzchu rolki.
  2. Laminektomia od T7 do T9
    1. Zlokalizuj punkt orientacyjny dla wyrostków kolczystych T9-T11.
      UWAGA: Luki między T9, T10 i T11 są niewielkie w porównaniu z innymi segmentami w regionie. Po umieszczeniu szczura na rolce, wyrostki kolczyste T9-T11 będą odczuwane jako mały trójkątny guzek przez skórę.
    2. Wykonaj nacięcie skóry o długości od 4 do 5 cm w linii środkowej za pomocą ostrza #10 od T4 do T11. Wykonaj małe nacięcie w powierzchownej warstwie tłuszczu zakrzywionymi nożyczkami z końcami, aby wyciąć tłuszcz.
      UWAGA: Do oddzielania tłuszczu można używać innych rodzajów narzędzi, ale zakrzywione nożyczki z końcami umożliwiają najskuteczniejszą i najmniej inwazyjną metodę separacji tłuszczu.
    3. Zlokalizuj wyrostki kolczyste od T7 do T9 za pomocą tylnej części ostrza #10. Przytrzymaj mięsień na poziomie około T4 za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie w mięśniu wzdłuż każdej strony kręgów od T6-T10. Wykonaj cięcie jak najbliżej kręgów, aby zrobić czysty otwór i spowodować minimalne obrażenia zwierzęcia.
    4. Odizoluj każdy pojedynczy wyrostek kolczysty od T7 do T9, przecinając mięśnie i więzadła między T6 i T7, T7 i T8, T8 i T9 oraz T9 i T10 za pomocą ostrza #10.
    5. Użyj rongeur, aby usunąć wszelkie mięśnie i więzadła na blaszkach od T7 do T9. Usuń mięśnie i więzadła tak bocznie, jak to możliwe, aż będą widoczne przerwy między wyrostkami poprzecznymi od T7 do T9.
    6. Usuń wyrostek kolczysty T9 za pomocą rongeur. Przytrzymaj wyrostek kolczysty T8 kleszczami i delikatnie podnieś, aby podnieść blaszkę T9 w małym otworze między wyrostkami T9 i T10.
    7. Usuń blaszkę, zaczynając od otworu i poruszając się rostralnie za pomocą rongeur w T9. Usuń blaszkę z boku tak bardzo, jak to możliwe; Korzenie grzbietowe powinny być widoczne po laminektomii.
    8. Po usunięciu blaszki powtórz proces dla T8 i T7.
      UWAGA: Podczas laminektomii użyj włóczni absorpcyjnych, aby usunąć krew, kontynuując laminektomię. Jeśli wystąpi nadmierne krwawienie, umieść ściśniętą gąbkę w miejscu krwawienia i dodaj sól fizjologiczną, aby pomóc w krzepnięciu krwi.
  3. Przecięcie w T8
    1. Umieść zwijacz wokół T7 do T9. Po usunięciu wszystkich blaszek upewnij się, że przerwy między wyrostkami poprzecznymi są widoczne, szczególnie w T8. Sprawdź również kości wzdłuż długości po obu stronach między T7 a T9, aby upewnić się, że nie ma żadnych fragmentów kości wystających na zewnątrz.
      UWAGA: Ta przerwa w T8 jest ważna dla wykonania pełnego przecięcia. Kręgi na całej długości powinny zostać usunięte w celu łatwiejszego wprowadzenia przewodu.
    2. Przetnij korzenie grzbietowe i brzuszne powyżej i poniżej T8 za pomocą kątowych nożyczek sprężynowych. Dodaj sól fizjologiczną do rdzenia kręgowego i poczekaj, aż krew zacznie krzepnąć.
      UWAGA: Ten krok jest ważny dla prawidłowego wstawienia przewodu.
    3. Umieść kątowe nożyczki sprężynowe nad rdzeniem kręgowym w szczelinach między wyrostkami poprzecznymi w T8 i wykonaj jedno cięcie, aby całkowicie przeciąć rdzeń kręgowy. Umieść mały kawałek sprasowanej pianki w powstałej szczelinie 2-2,5 mm i natychmiast dodaj sól fizjologiczną do tego obszaru.

3. Wstawianie kanału

  1. Czekając, aż odcięte kikuty pępowinowe osiągną hemostazę, wyjmij przewód z 1x PBS. Pokrój trójkąty absorpcyjne na cienkie, długie kawałki i umieść je w przewodzie, aby usunąć nadmiar PBS. Sprawdź, czy wstępnie wycięte okna są otwarte.
  2. Usuń sól fizjologiczną i krew za pomocą cienkich, długich kawałków trójkątów absorpcyjnych. Podnieś dwa kikuty rdzenia kręgowego za pomocą mikroszpatułki, aby zapewnić dobrą separację. Delikatnie podnieś kikut rostralny za pomocą mikroszpatułki i nasuń przewód na pień tak, aby okna były skierowane do siebie. Upewnij się, że cały kikut jest włożony i nie ma nadmiernego krwawienia do przewodu.
  3. Delikatnie podnieś kikut ogonowy i wsuń drugi koniec przewodu na kikut. Upewnij się, że cały kikut jest włożony, a okna znajdują się na powierzchni grzbietowej (Rysunek 2A).

4. Komórka Schwanna/ Matryca iniekcyjna (patrz Tabela Materiałów) Przygotowanie i wstrzyknięcie

  1. Czekając, aż odcięta pępowina osiągnie hemostazę, usuń pożywkę znajdującą się powyżej osadu GFP-SC (przygotowanego w kroku 1.2). Zawiesić GFP-SC w 10 μl zimnego DMEM/F12. Dodać 10 μl zimnego żelu do wstrzykiwań do zawiesiny komórek i dobrze wymieszać, wielokrotnie pipetując. Mieszaninę GFP-SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań należy przechowywać na lodzie do momentu zakończenia wprowadzania przewodu.
  2. Po upewnieniu się, że okienka na powierzchni grzbietowej są otwarte (Rysunek 2A), wstrzyknij 20 μl mieszaniny GFP-SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań do przewodu przez jedno z wstępnie wyciętych okien46 za pomocą końcówki ładującej western blot i mikropipety. Jeśli mieszanina SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań przepełni przewód, usuń nadmiar za pomocą trójkątów absorpcyjnych. Zamknąć okna po wstrzyknięciu; szycie nie jest potrzebne (Rysunek 2B).

5. Zamykanie ran i opieka pooperacyjna

  1. Zszyj warstwy mięśniowe i powierzchowne warstwy tłuszczu. Oczyść skórę 70% etanolem, a następnie zszyj (np. za pomocą klipsów do ran) zamknij skórę. Trzymaj zwierzęta w inkubatorze regulowanym termicznie do czasu odzyskania przytomności. Przenieś zwierzęta z powrotem do klatek. Zapewnij wodę długą rurką do karmienia i umieść granulki jedzenia na ściółce, aby mieć do niej łatwy dostęp.
  2. Buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała) należy podawać dwa razy dziennie przez 3 dni podskórnie, rozpoczynając bezpośrednio po zabiegu w celu zmniejszenia bólu. Gentamycynę (5 mg/kg masy ciała) należy wstrzykiwać podskórnie raz dziennie przez 7 dni bezpośrednio po zabiegu, aby zapobiec i zmniejszyć zakażenie. Wstrzykuj 10 ml roztworu Ringersa z mleczanami podskórnie dwa razy dziennie przez 7 dni w celu nawodnienia.
  3. Opróżniaj pęcherze ręcznie dwa razy dziennie, aż do powrotu funkcji pęcherza. Jeśli dojdzie do infekcji pęcherza moczowego, podawaj podskórnie 10 ml soli fizjologicznej, aż mocz stanie się czysty. Jeśli nie nastąpi poprawa w ciągu dwóch dni, należy wstrzyknąć gentamycynę (5 mg/kg masy ciała raz na dobę) podskórnie, aż mocz stanie się klarowny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem zastosowania tej techniki chirurgicznej jest ocena wykorzystania ustrukturyzowanego przewodu i wstrzykiwalnej macierzy, które maksymalizują funkcję SC po transplantacji do całkowicie przerwanych rdzeni kręgowych. Trzy tygodnie po transplantacji zwierzęta są perfundowane 4% paraformaldehydem, a kolumny kręgowe są makroskopowo preparowane i utrwalane w tym samym utrwalaczu przez kolejne 24 h. Następnie rdzeń kręgowy jest preparowany, a próbki do sagittalnych przekrojów krioskopowych s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym krokiem w tworzeniu skutecznego modelu przecięcia jest przecięcie rdzenia kręgowego w jednym lub dwóch cięciach. W miejscu przecięcia powinna być obecna szczelina 2-2,5 mm między kikutami rostralnymi i ogonowymi rdzenia kręgowego. Trzy najbardziej prawdopodobne powody, dla których taka przerwa się nie pojawiła, to: (1) korzenie grzbietowe/brzuszne nie zostały prawidłowo usunięte, (2) opona twarda brzuszna nie została odpowiednio usunięta i/lub (3) zwierzę nie zostało prawidłowo umieszczone na rolce umieszc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Wektorom Wirusowym i Rdzeniom Zwierzęcym z Miami Project to Cure Paralysis za wyprodukowanie wirusa lenti-GFP i zapewnienie opieki nad zwierzętami, odpowiednio, oraz Rdzeniom Histologii i Obrazowania za użycie kriostatu, mikroskopu konfokalnego i mikroskopu fluorescencyjnego z Stereo Investigator. Finansowanie zostało zapewnione przez NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) i NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge jest profesorem neurologii im. Christine E Lynn

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki kriogeniczneThermoFisher Scientific5000-0020
10 cm szalka PetriegoVWR25382-428
Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco: mieszanka składników odżywczych F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" w protokole.
Penicylina-streptomycynaThermoFisher Scientific15140-122"Pen/Strep" w protkol.
Płodowa surowica bydlęcaHyclonSH300-70-03"FBS" w protokole.
Ekstrakt z przysadki mózgowejBiomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
HeregulinR& D Systems396-HB/CF
Poly L-lizynaSigma-AldrichP2636"PLL" w protokole.
Zmodyfikowane medium Eagle firmy DulbeccoThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" w protokole.
Zbilansowany roztwór soli HankaThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" w protokole.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
Samica szczura Fischer (160-180g)Nożyczki Envigo
Vannas, prosteFST15018-10
KetaminaVedco Inc5098976106100 mg/ml
XylazineLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamycynaAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02Może być dowolną marką.
MikroszpatułkaFST10089-11Może być dowolnej marki.
Zakrzywione nożyczki z końcemFST14017-18Może być dowolną marką.
KleszczeFST11006-12Może być dowolnej marki.
rongeurFST16121-14Może być dowolną marką do wyboru.
Nożyczki sprężynowe kątoweFST15006-09Może być dowolnej marki.
Trójkąty absorpcyjneFST18105-03Może być dowolną marką.
Pianka żelowaHenry Schein9083300"Pianka skompresowana" w protokole.
#10 ostrzySklar06-3010Może być dowolną marką.
MatrigelCorning354234"Matryca iniekcyjna" w protokole.
Przeciwciało białkowe przeciw zielonej fluorescencjiMysz MilliporeAB16901
RT97 Przeciwciało hybrydomaDSHBRT97
Przeciwciało anty-neurofilamentowe królikaEncor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
Poliklonalne królik anty-glejowe fibrylarne kwaśne przeciwciałoDakoZ033401
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-kurczaka IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 kozia anty-królicza IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 kozia anty-królicza IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 kozia anty-mysia IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
Mikroskopia konfokalnaNikonclsi
kurczaka białkowe

Bibliografia

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517(2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

przecięcie rdzenia kręgowegotransplantacja komórek Schwannaimplantacja konduitumodel całkowitego przecięciaprocedura laminektomiiwstrzykiwalny żel matrycowykomórki Schwanna GFPkonduit PVDF-TrFEkonfokalna obrazowanie fluorescencyjne
Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.