Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

Summary

Systemy videomikroskopii służą do badania funkcjonalnych właściwości izolowanych tętniczek tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne. Technika ta może być stosowana do badania fenotypów mikronaczyniowych w różnych domenach tkanki tłuszczowej u otyłych ludzi.

Abstract

Chociaż otyłość jest ściśle związana z rozwojem chorób metabolicznych i sercowo-naczyniowych, niewiele wiadomo o mechanizmach rządzących tymi procesami. Przypuszcza się, że mediatory proaterogenne uwalniane z tkanki tłuszczowej, szczególnie w związku z otyłością centralną/trzewną, mogą lokalnie i ogólnoustrojowo sprzyjać patogennym zmianom naczyniowym, a pogląd, że choroba sercowo-naczyniowa może być konsekwencją dysfunkcji tkanki tłuszczowej, nadal ewoluuje. W tym miejscu opisujemy unikalną metodę wideomikroskopii, która obejmuje analizę reakcji rozszerzających i zwężających naczynia krwionośne nienaruszonych małych tętniczek ludzkich usuniętych z magazynu tłuszczowego żywych ludzi. Wideomikroskopia służy do badania właściwości funkcjonalnych izolowanych mikronaczyń w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne lub fizjologiczne za pomocą systemu ciśnieniowego, który naśladuje warunki in vivo. Technika ta jest użytecznym podejściem do zrozumienia patofizjologii i mechanizmów molekularnych, które przyczyniają się do dysfunkcji naczyń krwionośnych lokalnie w środowisku tkanki tłuszczowej. Co więcej, nieprawidłowości w mikrokrążeniu tkanki tłuszczowej są również powiązane z chorobami ogólnoustrojowymi. Zastosowaliśmy tę technikę do zbadania specyficznych dla depot odpowiedzi naczyniowych u osób otyłych. Oceniliśmy zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych zarówno na zwiększony przepływ, jak i acetylocholinę w tętniczkach tłuszczowych (50 - 350 μm średnica wewnętrzna, 2 - 3 mm długości) wyizolowanych z dwóch różnych magazynów tłuszczowych podczas operacji bariatrycznej od tej samej osoby. Wykazaliśmy, że tętniczki z tłuszczu trzewnego wykazują upośledzone rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od śródbłonka w porównaniu z naczyniami wyizolowanymi z depot podskórnego. Wyniki sugerują, że mikrośrodowisko trzewne jest związane z dysfunkcją śródbłonka naczyń krwionośnych, co może być istotne dla obserwacji klinicznej łączącej zwiększoną otyłość trzewną z ogólnoustrojowymi mechanizmami chorobowymi. Technika wideomikroskopii może być wykorzystana do badania fenotypów naczyniowych z różnych magazynów tłuszczu, a także do porównywania wyników u osób z różnym stopniem otyłości i dysfunkcją metaboliczną. Metoda może być również stosowana do badania podłużnych odpowiedzi naczyniowych w odpowiedzi na interwencje kliniczne.

Introduction

Wideomikroskopia jest użyteczną techniką wykorzystywaną do badania funkcji naczyniomotorycznych małych tętniczek pobranych od żywych ludzi ex vivo. Nasze laboratorium skupiło się na wypreparowaniu maleńkich mikronaczyń z różnych przedziałów tkanki tłuszczowej, aby scharakteryzować wpływ różnych mikrośrodowisk tłuszczowych na mikrokrążenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że naczynia krwionośne usunięte z ludzkiego ciała pozostają funkcjonalne i można je łatwo zbadać w ciągu kilku minut do godzin po biopsji. Warunki fizjologiczne są naśladowane, a stałe ciśnienie przezścienne utrzymywane w przestrzeni śródświetlnej za pomocą kaniul mikroszklanych, które po....

Protocol

Protokół i przykłady opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Boston University School of Medicine Institutional Review Board (IRB, protokół #H-25644) i zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed uczestnictwem.

1. Przygotowanie roztworów i kaniul mikroszklanych

1. Przygotować roztwór kwaśnej soli fizjologicznej 4-2-hydrosyetylo-1-piperazynoetanosulfonowej (HEPES). Na 1 l rozpuścić 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g MgSO₄•7H₂O, 0,235 g CaCl₂•2H₂O, 0,16 g KH₂PO₄, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-glukozy i 2,383....

Results

Nasze laboratorium wykorzystało wideomikroskopię do zbadania zależnego i niezależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń krwionośnych, a także funkcji kurczliwości naczyń krwionośnych tętniczek tkanki tłuszczowej wyizolowanych z podskórnej i trzewnej tkanki tłuszczowej otyłych ludzi. Charakterystyczny układ eksperymentalny jest wyświetlany w Rysunek 1A. Tętniczki tkanki tłuszczowej są zawieszone między dwiema szklanymi pipetami kapilarnymi i zabezpieczone szwami w komor.......

Discussion

Wypreparowanie i odizolowanie tętniczek tłuszczowych od otaczających tkanek może być czasochłonnym i pracochłonnym procesem, wymaganym ze szczególną dbałością o szczegóły i protokołem technicznym. Procedura mikrodysekcji wymaga skrupulatnych umiejętności i specjalistycznych przyborów preparacyjnych, aby zapobiec potencjalnemu uszkodzeniu warstw mięśni gładkich lub komórek śródbłonka mikrokrążenia. Nawet drobne przypadkowe nakłucia w ścianie tętniczki mogą zapobiec wzrostowi ciśnienia w świetle i skutkować nieudanym ekspe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nazwa chemiczna
Acetylcholina	Sigma Aldrich	A6625
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glukoza	Sigma Aldrich	G5767
Endotelina-1	Sigma Aldrich	E7764
Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Nw-nito-L-arginina chlorowodorek estru metylowego	Sigma Aldrich	N5751
Siarczan magnezu (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
Chlorek potasu (KCL)	Sigma Aldrich	P3911
Fosforan potasu (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Papaverine	Sigma Aldrich	P3510
Wodorowęglan sodu (NaHCO 3 )	Sigma Aldrich	S6014
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2Po4)	Sigma Aldrich	S9638
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
Kleszcze	Narzędzia Finescience	15000-08
Mikroskop odwrócony	Zeiss Achromat
Rurki laboratoryjne	Euro-Pharm	250100306F999
Ściągacz do igieł/pipet	David kopf instruments	720
Okulistyczny monofilamentowy szew nylonowy	Specjalizacje chirurgiczne	A7756N
Nożyczki	Narzędzia Finescience	150000-08
Komora naczyń	DMT	VAS v.2.1