Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56086

⸱

7 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Streszczenie

Przekształcanie błony komórkowej jest integralną częścią wielu zjawisk komórkowych, takich jak endocytoza, transport, powstawanie filopodiów, itp. Wiele różnych białek kojarzy się z zakrzywionymi błonami ze względu na ich zdolność do wyczuwania lub wywoływania krzywizny błony. Zazwyczaj procesy te obejmują wiele białek, co czyni je zbyt złożonymi, aby można je było badać ilościowo w komórce. Opisujemy protokół rekonstytucji zakrzywionej błony in vitro, naśladując zakrzywioną strukturę komórkową, taką jak szyjka endocytarna. Gigantyczny pęcherzyk jednopłytkowy (GUV) jest używany jako model błony komórkowej, której ciśnienie wewnętrzne i napięcie powierzchniowe są kontrolowane za pomocą aspiracji mikropipet. Przyłożenie punktowej siły ciągnącej do GUV za pomocą pęsety optycznej tworzy nanorurkę o dużej krzywiźnie połączoną z płaską membraną. Metoda ta jest tradycyjnie stosowana do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błon lipidowych, takich jak sztywność zginania. W ostatnich latach został rozszerzony o badanie, w jaki sposób białka oddziałują z krzywizną błony oraz w jaki sposób wpływają na kształt i mechanikę błon. System łączący mikromanipulację, mikroiniekcję, pęsetę optyczną i mikroskopię konfokalną umożliwia jednoczesny pomiar krzywizny błony, napięcia błony i gęstości powierzchni białek. Na podstawie tych pomiarów można wywnioskować wiele ważnych właściwości mechanicznych i morfologicznych układu białkowo-błonowego. Ponadto opracowujemy protokół tworzenia GUV w obecności fizjologicznego stężenia soli oraz metodę ilościowego określania gęstości powierzchniowej białek na błonie na podstawie intensywności fluorescencji znakowanych białek i lipidów.

Wprowadzenie

Wiele procesów komórkowych, takich jak endocytoza, transport wewnątrzkomórkowy, tworzenie filopodiów, infekcja itp., wiąże się z gwałtowną zmianą kształtu błon komórkowych1,2. W komórce szereg białek uczestniczy w tych procesach, wiążąc się z błoną i zmieniając jej kształt. Najbardziej znanymi przykładami są białka z rodziny Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR), zawierające charakterystyczną, wewnętrznie zakrzywioną domenę BAR3,4,5,6,7. Zazwyczaj oddziałują one z błoną poprzez przyleganie domeny BAR do jej powierzchni, a w wielu przypadkach również przez płytkie wprowadzanie helis amfipatycznych do dwuwarstwy. Kształt, rozmiar i ładunek domeny BAR wraz z liczbą helis amfipatycznych determinują: (1) kierunek zakrzywienia błony (t.j. czy wywołają one invaginacje, czy wypukłości) oraz (2) stopień zakrzywienia błony5,8. Należy zaznaczyć, że zakrzywienie dodatnie definiuje się tutaj jako wypukłą stronę zakrzywionej błony, t.j. wybrzuszenie w stronę oddziałującej cząsteczki, a w przeciwnym razie jako zakrzywienie ujemne. Ponadto badania ilościowe białek BAR wykazały, że ich wpływ na błonę zależy od zestawu parametrów fizycznych: gęstości powierzchniowej białek, napięcia błony oraz kształtu błony (płaski versus rurkowy versus sferyczny)7. W zależności od tych parametrów białka BAR mogą: (1) działać jako sensory zakrzywienia błony, (2) wyginać błony lub (3) indukować pękanie błony7.

Ze względu na ogromną liczbę komponentów zaangażowanych w przekształcanie błon w komórce, badanie ilościowych aspektów tych zjawisk, takich jak endocytoza, in vivo jest niezwykle trudne. Rekonstytucja in vitro minimalnych komponentów naśladujących zakrzywione błony komórkowe umożliwia mechanistyczne zrozumienie sposobu działania białek zakrzywiających błony. Niniejszy artykuł opisuje protokół rekonstytucji nanorurki błonowej in vitro z wykorzystaniem mikromanipulacji, mikroskopii konfokalnej i pęset optycznych. Podejście to może być stosowane do ilościowego badania interakcji białek, lipidów lub małych cząsteczek z zakrzywionymi błonami. Lipidowe GUV są wykorzystywane jako modele błony komórkowej, których krzywizna jest pomijalna w porównaniu z rozmiarem oddziałujących cząsteczek zakrzywiających błony. Są one przygotowywane metodą elektroformowania9, w której pęcherzyki powstają poprzez hydratację filmu lipidowego i jego pęcznienie do postaci GUV pod wpływem prądu przemiennego (AC)10. Najczęstszymi podłożami, na których hoduje się GUV, są półprzewodnikowe płytki powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO) lub druciki platynowe (Pt-wires)11. W niniejszej pracy GUV są hodowane na drucikach Pt, ponieważ wykazano, że metoda ta działa znacznie lepiej niż alternatywa przy tworzeniu GUV w obecności soli w buforze12. Chociaż protokół elektroformowania został tutaj opisany w stopniu wystarczającym do jego powtórzenia, odsyłamy czytelnika do wcześniejszych artykułów, w których szczegółowo opisano podobne i inne metody otrzymywania GUV13,14. W naszych badaniach elektroformowanie na drucikach Pt pozwoliło na pomyślne otrzymanie GUV z mieszaniny lipidów syntetycznych lub z naturalnych ekstraktów lipidowych w buforze zawierającym ~100 mM NaCl. Ponadto możliwe było enkapsulowanie białek wewnątrz GUV podczas ich wzrostu. Przykładowa komora do elektroformowania przedstawiona jest na Ryc. 1A; składa się ona z dwóch drucików Pt o długości ~10 cm, włożonych w uchwyt wykonany z politetrafluoroetylenu (PTFE), który można uszczelnić po obu stronach szkiełkami nakrywkowymi oddalonymi od siebie o ~1 - 2 cm (Ryc. 1A).

Układ elektroforetyczny z mikropipetą i systemem spektroskopowym do analizy i rozdziału białek.
Rycina 1: Układ eksperymentalny. (A) Komora do elektroformowania GUV z złączami elektrycznymi przymocowanymi do drucików platynowych (Pt). (B) Lewo: system eksperymentalny przedstawiający mikroskop, komorę eksperymentalną nad obiektywem oraz dwie mikropipety (lewą i prawą) przymocowane do mikromanipulatorów i wprowadzone do komory eksperymentalnej w celu wyciągania rurek i wstrzykiwania białka. Prawo: zbliżenie komory eksperymentalnej zamontowanej nad obiektywem, pokazujące wprowadzone końcówki mikropipety do aspiracji i wstrzykiwania. (C) Strzykawka wyposażona w cienki dozownik włożony do tylnego końca mikropipety. Na dole znajduje się zbliżenie dozownika wewnątrz mikropipety, gdzie niebieska przerywana linia obrysowuje mikropipetę. System ten służy do napełniania mikropipety kazeiną w celu pasywacji powierzchni szkła, a także do wypełniania od tyłu olejem mineralnym w razie potrzeby. (D) System służący do aspiracji ilości roztworu białka rzędu µL. Igła jest połączona ze strzykawką oraz z przewodami podłączonymi do mikropipety wtryskowej. Końcówka mikropipety zostaje ostrożnie zanurzona w roztworze białka i zasana w taki sposób, aby wypełnić końcówkę mikropipety. Następnie mikropipeta jest wypełniana od tyłu olejem mineralnym przy użyciu systemu pokazanego na panelu C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Nanorurka błonowa, o promieniu od 7 nm do kilkuset nm, może zostać wyciągnięta z GUV przez siłę zewnętrzną. Metoda ta została pierwotnie opracowana w celu pomiaru właściwości elastycznych błon komórkowych i pęcherzyków, takich jak sztywność zginania15,16. W najnowszych pracach metodę tę rozszerzono na badanie oddziaływań białek z zakrzywionymi błonami poprzez mikroiniekcję białek w pobliżu wyciągniętej nanorurki7,17. Opracowano inne metody badania białek zakrzywiających błony. W jednej z nich białka inkubuje się z liposomami o różnych rozmiarach, przytwierdzonymi do pasywowanej powierzchni. Mikroskopia konfokalna jest wykorzystywana do pomiaru wiązania białek w funkcji średnicy liposomów, co może wskazywać na sortowanie indukowane zakrzywieniem18,19. W innej metodzie białka wstrzykuje się w pobliżu mikroaspiracji GUV, aby zmierzyć ich zdolność do spontanicznego indukowania tworzenia cewek20,21. Metoda opisana w niniejszym protokole jest wyjątkowo odpowiednia do badania białek zakrzywiających błony uczestniczących w endocytozie, gdzie większość białek zazwyczaj napotyka wcześniej powstałe nanorurki błonowe łączące zawierającą ładunek wgłębienie błony z leżącą poniżej płaską błoną plazmatyczną. Ponadto w tej metodzie, w przeciwieństwie do testu z przytwierdzonymi małymi liposomami, nanorurka błonowa jest stale połączona z błoną; w związku z tym znajduje się ona w równowadze mechanicznej z GUV, co jest sytuacją spodziewaną in vivo. Zatem zastosowanie ma fundamentalna fizyka błon, co pozwala nam wywnioskować szereg właściwości mechanicznych z naszych pomiarów22,23,24.

Do pełnej implementacji tej metody niezbędny sprzęt obejmuje mikroskop konfokalny, pęsetę optyczną oraz jedną lub dwie mikropipety połączone ze zbiornikiem wody (Rycina 1B). Dzięki połączeniu tych trzech elementów możliwe jest jednoczesne pomiar napięcia błony, krzywizny błony, gęstości powierzchniowej białek oraz siły rurki25. Aspiracja mikropipetą jest kluczowa i można ją łatwo zrealizować poprzez włożenie szklanej mikropipety do uchwytu połączonego ze zbiornikiem wody, który za pomocą ciśnienia hydrostatycznego kontroluje ciśnienie aspiracji26. Mikropipeta i uchwyt są sterowane przez mikromanipulator, a idealnie w jednym kierunku przez siłownik piezoelektryczny w celu zapewnienia precyzyjnego ruchu. Aby wyciągnąć nanorurkę, poddana aspiracji GUV jest krótko przytwierdzona do koralika o wielkości mikrona, a następnie odciągana, co prowadzi do powstania nanorurki. W tej implementacji koralik jest utrzymywany przez pęsetę optyczną, którą można zbudować zgodnie z opublikowanym protokołem27. Możliwe jest zrezygnowanie z pęsety optycznej i wyciąganie nanorurek w inny sposób, choć odbywa się to kosztem dokładności pomiarów siły. Jeśli zbudowanie pułapki optycznej jest zbyt trudne lub jeśli pomiary siły nie są niezbędne, na przykład gdy chcemy jedynie sprawdzić preferencje białek względem zakrzywionych błon, rurkę można wyciągnąć za pomocą koralika aspirowanego na końcówce drugiej mikropipety28. Możliwe jest również wyciąganie rurek przy użyciu siły grawitacji29 lub przepływu30,31. Ponadto mikroskopia konfokalna również nie jest niezbędna; jest jednak preferowana w celu pomiaru gęstości powierzchniowej białek. Pozwala ona również na pomiar promienia nanorurki na podstawie intensywności fluorescencji lipidów w rurce, zatem niezależnie od siły i napięcia błony. Wyznaczanie promienia rurki z fluorescencji jest szczególnie istotne, jeśli zależność między tymi wielkościami odbiega od uznanych równań ze względu na obecność białek przylegających do błony25. Co ważne, nie można zrezygnować jednocześnie z pułapki optycznej i mikroskopii konfokalnej, ponieważ uniemożliwi to pomiar krzywizny rurki.

Metoda opisana w niniejszym protokole była wykorzystywana do badania segregacji indukowanej krzywizną różnych peryferyjnych białek błonowych na nanorurkach, głównie tych z rodziny BAR25,32,33,34. Wykazano również, że stożkowaty transbłonowy kanał potasowy KvAP ulega wzbogaceniu na zakrzywionych nanorurkach w ten sam sposób, co białka BAR35. Dzięki optymalizacji metody w celu enkapsulacji białek wewnątrz GUVs, niedawno zbadano również oddziaływania białek z ujemną krzywizną36. Co więcej, metoda ta była stosowana do wyjaśnienia procesu tworzenia rusztowań białkowych25,37 oraz do badania mechanizmu przecinania błony poprzez napięcie liniowe38, białko dynaminę39 lub białka BAR40,41. Oprócz białek, krzywiznę mogą indukować również małe cząsteczki lub jony. Przy użyciu tej metody wykazano, że jony wapnia indukują dodatnią krzywiznę w warunkach bezsolnych42. Co ciekawe, wykazano również, że lipidy mogą ulegać segregacji zależnej od krzywizny, choć tylko dla składów bliskich punktowi rozdzielania faz43,44. Podsumowując, metoda ta może być wykorzystywana przez badaczy zainteresowanych analizą tego, jak integralne komponenty błony (np. lipidy lub białka transbłonowe) lub cząsteczki wiążące się peryferyjnie (zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz GUVs) oddziałują z błonami o zakrzywieniu cylindrycznym, z punktu widzenia mechanicznego i ilościowego. Jest ona również przeznaczona dla osób zainteresowanych pomiarem właściwości mechanicznych samej błony22,23,45.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie GUV przez elektroformowanie na drutach platynowych

  1. Oczyścić komorę do elektroformowania (patrz Wstęp oraz Rysunek 1A) i druciki platynowe (Pt) rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak etanol lub aceton, aby usunąć lipidy, a następnie wodą, aby wypłukać sole.
    UWAGA: Sugerujemy dokładne wytarcie pozostałości chusteczką nasączoną etanolem, a następnie sonikację w acetonie, etanolu i wodzie, po 5 min w każdym z tych roztworów.
  2. Przygotować mieszaninę lipidów o pożądanym składzie w stężeniu 1 mg/mL w chloroformie. Mieszanina powinna zawierać ~ 0,05% udziału molowego lipidu sprzężonego z biotyną (np. 1,2-distearoylo-sn-glycero-3-fosfoetanolaminy-N-[biotynyl(polietylenoglikol)-2000]) oraz ~ 0,5% udziału molowego lipidu sprzężonego z fluorophorem (np. BODIPY-TR-C5-ceramid).
    UWAGA: W naszym doświadczeniu trudno było uzyskać wysoką wydajność GUV zawierających więcej niż 30% lipidów naładowanych.
    OSTRZEŻENIE: Chloroformem należy operować wewnątrz dygestorium, używając odpowiednich rękawic.
  3. Włożyć parę drucików Pt do komory do elektroformowania. Nanieść mieszaninę lipidów na druciki Pt w formie kropel oddalonych od siebie o ~ 2-3 mm (łącznie ~ 4 µL mieszaniny).
  4. Suszyć druciki w próżni przez 30–60 min w temperaturze pokojowej.
  5. Uszczelnić dno komory, przyklejając szkiełko nakrywowe do komory za pomocą smaru silikonowego. Napełnić komorę roztworem buforowym zawierającym NaCl, sacharozę i czynnik buforujący (np. 70 mM NaCl, 100 mM sacharozy i 10 mM Tris, przy pH 7,4). Medium to będzie znajdować się wewnątrz GUV podczas eksperymentu. Niezbędne jest, aby osmolarność tego medium odpowiadała osmolarności medium eksperymentalnego z dokładnością do ~ 10%. Do regulacji osmolarności należy użyć sacharozy. Jeśli celem jest enkapsulacja białek w GUV, dodać białka do roztworu w pożądanym stężeniu.
    OSTRZEŻENIE: Różne sole i cukry w buforze mogą wpływać na sztywność zginania i spontaniczną krzywiznę błon24,42,46,47.
  6. Uszczelnić górę komory, przyklejając szkiełko nakrywowe smarem silikonowym, upewniając się, że wewnątrz komory znajduje się minimalna ilość powietrza. Przyłożyć prąd przemienny sinusoidalny przez druciki Pt o częstotliwości 500 Hz i napięciu 280 mV.
    UWAGA: Czas wzrostu i temperatura muszą być zoptymalizowane w zależności od składu lipidów i wrażliwości białka. Przy zastosowaniu naturalnych ekstraktów lipidowych, a także podczas enkapsulacji białek w GUV, najlepszą wydajność osiągnięto, hodując GUV w temperaturze 4 °C przez noc. W przypadku braku białek oraz dla syntetycznych składów lipidowych wystarczający był wzrost w temperaturze pokojowej przez ~ 2 h.

2. Przygotowanie komory eksperymentalnej i mikropipet

  1. Aby przygotować mikropipety, wyciągnij kapilarę szklaną za pomocą wyciągacza do pipet. Zaleca się użycie kapilary szklanej o promieniu wewnętrznym i zewnętrznym odpowiednio 0,7 mm i 1 mm. Następnie, za pomocą mikrokuźni, dopracuj końcówkę mikropipety tak, aby jej średnica wewnętrzna wynosiła 5–7 µm. Jeśli w eksperymencie będą wstrzykiwane białka lub inne cząsteczki, wyciągnij kolejną mikropipetę i dopracuj jej końcówkę do średnicy wewnętrznej 8–15 µm.
  2. Zbuduj komorę eksperymentalną, umieszczając dwa prostokątne szkiełka nakrywkowe do mikroskopii na metalowej podstawie, jak pokazano na Rysunku 1. Szkiełka powinny być oddalone od siebie o ~ 1 mm. Komora powinna posiadać otwory wzdłuż długich krawędzi (patrz Rysunek 1). Otwarte boki powinny umożliwiać wprowadzenie końcówki mikropipety tak, aby końcówka dotarła co najmniej do centrum komory.
  3. Przygotuj bufor eksperymentalny, którego osmolarność nie powinna różnić się o więcej niż 10% od buforu użytego do hodowli GUV. Dostosuj osmolarność za pomocą glukozy. Przykładem buforu eksperymentalnego użytego podczas badania oddziaływania endofiliny z nanorurkami jest 100 mM NaCl, 40 mM glukozy, buforowany Trisem do pH 7,4. Połączenie sacharozy wewnątrz i glukozy na zewnątrz zapewnia: (a) wystarczający kontrast fazowy do obserwacji GUV za pomocą mikroskopii w jasnym polu oraz (b) wyższą gęstość wewnątrz GUV, co powoduje ich osiadanie na dnie komory. Dostosuj stężenie soli zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
    UWAGA: Według naszego doświadczenia wysokie stężenie glukozy (> 300 mM), oprócz wpływu na właściwości mechaniczne błony, negatywnie wpływa na tworzenie wiązań streptawidyna-biotyna, które są niezbędne do wyciągnięcia nanorurki. Co więcej, zbyt mała ilość soli hamuje tworzenie wiązań streptawidyna-biotyna, podczas gdy zbyt wysokie stężenie ekranuje oddziaływania białko-błona. W przypadku enkapsulacji białek można zastosować trik polegający na użyciu bardzo wysokiego stężenia soli w buforze zewnętrznym (np. >200 mM NaCl), aby odłączyć białka od zewnętrznej warstwy lipidowej36. Niezbędne jest przeprowadzenie doświadczeń z różnym zakresem stężeń soli, aby znaleźć optymalne warunki wiązania interesującej cząsteczki.
  4. Na 30–60 min przed pobraniem GUV do eksperymentu, spasywnuj powierzchnie szklane, wypełniając zarówno komorę eksperymentalną, jak i mikropipetę aspiracyjną roztworem wysoko oczyszczonej β-kazeiny o stężeniu 5 mg/mL (np. rozpuszczonej w buforze eksperymentalnym). β-kazeina tworzy warstwę ochronną na powierzchniach szklanych, zapobiegając zbyt silnemu przyleganiu GUV, co mogłoby doprowadzić do ich pęknięcia. Inkubuj z β-kazeiną przez 30–60 min.
    UWAGA: Wewnątrz mikropipety nie powinno znajdować się żadnych pęcherzyków powietrza, które mogłyby zakłócać kontrolę napięcia błony.
    1. Aby zbudować dozownik do napełniania mikropipet, złam igłę strzykawki blisko plastikowego łącznika i wklej w nią cienką kapilarę krzemionkową (taką, jakich używa się w chromatografii cieczowej) (Rysunek 1C).
  5. Podczas inkubacji z β-kazeiną zamontuj komorę na mikroskopie i wycentruj ją nad obiektywem. Wprowadź końcówkę mikropipety aspiracyjnej przez otwór wzdłuż długiej krawędzi i umieść końcówkę nad obiektywem mikroskopu. Dostosuj poziom zbiornika z wodą tak, aby ciśnienie aspiracyjne było bliskie zeru (nie powinno być widocznego pod mikroskopem silnego przepływu do wnętrza lub na zewnątrz pipety).
  6. W przypadku, gdy podczas eksperymentu wstrzykiwane będą białka lub inne cząsteczki, napełnij mikropipetę wtryskową pożądaną cząsteczką rozpuszczoną w buforze eksperymentalnym w wybranym stężeniu, zamontuj mikropipetę w mikromanipulatorze i wprowadź ją przez przeciwległą stronę komory eksperymentalnej.
    1. Aby zużyć minimalną ilość białek, napełnij za pomocą aspiracji tylko końcówkę mikropipety białkiem. W tym celu owiń koniec igły przymocowanej do strzykawki plastikowym przewodem. Wsuń przewód do tylnej części mikropipety wtryskowej.
    2. Bardzo ostrożnie zanurz końcówkę mikropipety w roztworze białka i zaspruj go, aby napełnić końcówkę mikropipety.
      UWAGA: Ten prosty układ pokazano na Rysunku 1D; według naszego doświadczenia pozwala on na aspirację z ilości roztworu białka wynoszącej zaledwie kilka µL.
    3. Dopełnij resztę mikropipety wtryskowej olejem mineralnym, aby zapobiec mieszaniu się roztworu białka z wodą ze zbiornika (używając układu z Rysunku 1C).
    4. Zadbaj o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do pipety wtryskowej, ponieważ spowoduje to niestabilne ciśnienie wtrysku. Alternatywnie, jeśli ilość białka jest wystarczająca, napełnij mikropipetę białkami w ten sam sposób, co w przypadku napełniania β-kazeiną opisanym w kroku 2.4. Dostosuj poziom zbiornika z wodą, aby zminimalizować ciśnienie aspiracyjne w pipecie wtryskowej.
      UWAGA: Stężenie wstrzykiwanej cząsteczki lub jonu w pobliżu nanorurki będzie niższe ze względu na rozcieńczenie; można je oszacować, mierząc spadek intensywności fluorescencji w funkcji odległości od wylotu pipety42. Ważniejsze jest jednak znanie gęstości wstrzykniętej cząsteczki związanej z dwuwarstwą, którą można precyzyjnie zmierzyć (patrz Sekcja 4).
  7. Po inkubacji z β-kazeiną usuń roztwór z komory i kilkakrotnie wypłucz ją buforem eksperymentalnym. Napełnij buforem eksperymentalnym.
  8. Zatrzymaj elektroformowanie GUV i pobierz je bezpośrednio z drucików platynowych (Pt). Dodaj kilka µL roztworu GUV do komory eksperymentalnej. Używaj wyłącznie świeżo przygotowanych GUV.
  9. Dodaj do komory eksperymentalnej kilka µL kulek pokrytych streptawidyną, aby końcowe stężenie kulek w komorze wynosiło około 0,1 x 10−3 % (w/v) lub mniej. Zaleca się użycie kulek polistyrenowych o średnicy ~3 µm (kulki polistyrenowe w wodzie mają prawie optymalny kontrast współczynnika załamania światła w celu maksymalizacji siły gradientu względem siły rozpraszania w pułapce optycznej). Stężenie kulek można dostosować do eksperymentu: bardzo niskie stężenie utrudnia ich znalezienie w komorze, a zbyt wysokie stężenie niesie ryzyko wpadnięcia wielu kulek do pęsety optycznej.

3. Wyciąganie nanotubul membranowych z GUV

  1. Pozostaw GUV i kuleczki do czasu, aż osiądą na dnie komory. Doprowadź do odkształcenia (deflacji) GUV, pozwalając na odparowanie niewielkiej ilości buforu eksperymentalnego przez około 15 min. Deflacja GUV jest niezbędna do wytworzenia nadmiaru powierzchni, którą można będzie wciągnąć mikropipetą. GUV powinny widocznie falować (t.j.wyglądają na wiotkie) pod mikroskopem świetlnym. Jeśli wydają się napięte, należy wydłużyć czas odparowywania.
    UWAGA: Szybkość zmiany osmolarności zależy od powierzchni parowania, temperatury, itp.i powinna być ściśle monitorowana. W zasadzie różnicę osmolarności można ustalić na początku poprzez dostosowanie stężenia sacharozy/glukozy, jednak należy zachować ostrożność, aby nie wywołać wstrząsu osmotycznego.
  2. Znajdź wiotki GUV i zassij go do pipety. Długość języka aspiracyjnego (części membrany znajdującej się wewnątrz pipety) powinna być równa lub większa od promienia pipety, aby analiza teoretyczna była możliwa do zastosowania.15,16,22,23 (Rysunek 2). Wypróbować kilka GUV. Jeśli żadnego z GUV nie można zaaspirować w celu utworzenia wystarczająco długiego języczka, należy odczekać kilka minut. Jeśli GUV są wystarczająco wiotkie, można przejść do następnego kroku.
  3. Uszczelnij komorę olejkiem mineralnym, aby zapobiec dalszemu odparowywaniu buforu. W tym celu ostrożnie nanieś olej pipetą wzdłuż otwartych krawędzi komory eksperymentalnej.
  4. Aby ustawić pozycję zerową ciśnienia aspiracyjnego, należy najpierw zlokalizować koralik w komorze i umieścić wylot pipety aspiracyjnej w pobliżu koralika. Należy dostosować wysokość zbiornika z wodą tak, aby koralik nie był ani zaciągany, ani odpychany przez pipetę aspiracyjną. Mimo że olej mineralny zapobiega parowaniu, a tym samym dalszym zmianom ciśnienia wewnątrz komory, należy zerować ciśnienie aspiracyjne przed pomiarem każdego GUV.
  5. Znajdź GUV i przeprowadź aspirację. Przesuń mikropipetę w górę, poza obszar ostrości (aby oddalić GUV od powierzchni, gdzie mogłoby ono zostać wyciągnięte z pipety przez naprężenia ścinające podczas przemieszczania komory).
  6. Należy odnaleźć kuleczkę, uważnie poruszając się w obrębie komory. Gwałtowne ruchy mogą doprowadzić do wyrzucenia GUV. Należy uchwycić ją za pomocą pęsety optycznej w odległości ~ 20 µm oddalona od dna komory. Należy upewnić się, że obszar zainteresowania jest czysty i nie ma w nim innych widocznych kulek ani membran. Wpadnięcie czegokolwiek innego niż kulka w obszar pęsety optycznej zakłóci pomiar.
  7. Ponownie ustaw ostrość na GUV, przesuwając je z dala od kuleczki za pomocą mikropipety wyrównanej z pułapką optyczną (Rycina 2).
  8. Rejestruj ruch kuleczki przez 1–2 min w celu wyznaczenia pozycji równowagi (wymaganej do pomiarów siły).
  9. Należy maksymalnie obniżyć ciśnienie wewnątrz mikropipety, tak aby nie doprowadzić do utraty GUV, w celu zmniejszenia napięcia błony. Ostrożnie doprowadzić GUV do kontaktu z koralikiem na około jedną sekundę, aby utworzyły się wiązania streptawidyna-biotyna, a następnie delikatnie odsunąć pęcherzyk, tworząc nanorurkę. Ruch GUV w stronę koralika lub od niego powinien być idealnie realizowany za pomocą aktuatora piezoelektrycznego, aby zminimalizować zaburzenia położenia koralika w pęsetach optycznych.
    UWAGA: Jeśli nanorurka nie utworzy się, może to wynikać ze słabej powłoki streptawidyny na koraliku, niewystarczającej ilości lipidów biotynylowanych w GUV, zbyt niskiego stężenia soli lub zbyt wysokiego stężenia glukozy w buforze eksperymentalnym, bądź z powodu zbyt wysokiego napięcia błony w GUV48.
  10. Zwiększ ciśnienie aspiracji w celu odtworzenia języka aspiracyjnego. Ustaw rurkę tak, aby znajdowała się w osi pipety aspiracyjnej, i maksymalnie ustaw ostrość na rurkę (Rysunek 2).
  11. Upewnij się, że równik GUV oraz probówka znajdują się w płaszczyźnie ostrości. Rejestruj ruch kulek za pomocą mikroskopii w polu jasnym przez kilka minut (w tym przypadku prędkość akwizycji kamery wynosi 30 Hz). Zapisz wysokość, hzbiornika z wodą względem pozycji zerowej. Wykonaj kilka obrazów konfokalnych układu (Rycina 2).
  12. Powtórz poprzedni krok przy różnych ciśnieniach aspiracji, co w sposób pośredni zmienia napięcie błony. Typowy zakres napięcia wynosi 0,015–0,2 mN/m, przy kroku wynoszącym około 0,02 mN/m.
  13. W przypadku wstrzykiwania białek lub cząsteczek w pobliżu układu, należy zbliżyć mikropipetę do nanorurki, upewniając się, że kuleczka w pułapce optycznej nie została poruszona. Należy delikatnie wstrzyknąć substancję pod ciśnieniem około 1–2 Pa.
  14. Po osiągnięciu stanu równowagi wiązania białka (intensywność fluorescencji wstrzykniętego białka na membranie GUV pozostaje stała), powtórz pomiary stopniowe w taki sam sposób, jak w przypadku gołej membrany (kroki 3.11 i 3.12).
    UWAGA: Ponieważ pomiary są wykonywane podczas wstrzykiwania białek w pobliżu GUV pod stałym ciśnieniem, stężenie białka w roztworze w pobliżu GUV pozostaje w przybliżeniu niezmienione; w związku z tym desorpcja białka podczas pomiaru powinna być pomijalna.
    1. Alternatywnie możliwe jest inkubowanie GUV-ów wraz z białkami przed przeprowadzeniem eksperymentów z wyciąganiem rurek (tube-pulling), aby zapewnić stałe stężenie objętościowe białek. Biorąc pod uwagę, że pomiarowi podlega względna frakcja białek w membranie rurki oraz GUV-a, sposób dostarczenia białek nie wpływa na obliczenia sortowania indukowanego krzywizną (patrz Sekcja 4).

Schemat i wynik pułapkowania optycznego; ilustracja siły F działającej na pęcherzyk lipidowy w układzie spektroskopowym.
Rycina 2: Eksperyment wyciągania rurki. (A) Schematy eksperymentu. (B) Obraz konfokalny wyciągniętej rurki opisanej w niniejszym protokole. Pasek skali = 2 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Pomiary i analiza danych

  1. Pomiar napięcia błony
    1. Oblicz ciśnienie hydrostatyczne dla każdego kroku przy stałym ciśnieniu aspiracji:
      ΔP = pgh
      gdzie p jest gęstość wody, g przyspieszenie grawitacyjne i h wysokość zbiornika z wodą z kroku 3.11.
    2. Na podstawie obrazów konfokalnych zmierz promień GUV, rGUV (gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki)oraz promień pipety aspiracyjnej, rpip (Rycina 2).
    3. Obliczyć napięcie błony, σ, korzystając z równania Laplace'a49:
      Wzór na napięcie powierzchniowe: σ = ΔP (rpip/2(1-rpip/rGUV)), równanie określające różnicę ciśnień.
  2. Pomiar siły błony
    1. Wyznacz sztywność pęsety optycznej, kprzy użyciu jednej z kilku metod kalibracji27W tej konfiguracji zmierz k przy użyciu metody oporu lepkośnienego27.
    2. Oblicz pozycję równowagi kuleczki, a0obliczoną jako średnia z pomiaru wykonanego przed wyjęciem rurki (krok 3.8).
    3. Dla każdego pomiaru stałego napięcia oblicz równowagową siłę błony, F, zgodnie z prawem Hooke'a:
      F = k(a - a0)
      gdzie a jest średnią pozycją kuleczki podczas tego pomiaru.
  3. Pomiar promienia rurki
    1. W przypadku gołej błony (bez dodanych cząsteczek zakrzywiających błonę), oblicz promień rurki, Rz siły jako:
      R = F/(4πσ)
      (literatura)22,23).
    2. Aby zmierzyć promień tubuli w obecności cząsteczek zakrzywiających membranę i niezależnie od kroku 4.3.1, należy najpierw zarejestrować intensywność fluorescencji lipidów wzdłuż długości tubuli, Ikuwetaoraz wzdłuż konturu GUV, IGUVPomiar średniej intensywności fluorescencji fluoroforu w błonie lub związanego z błoną przeprowadza się jako średnią intensywność wzdłuż najjaśniejszej linii konturu rurki lub GUV. Wybierz prostokątny obszar zawierający poziomy odcinek konturu GUV lub rurki, a następnie oblicz sumę intensywności fluorescencji każdej poziomej linii w tym obszarze.
      1. Każdą sumę podziel przez liczbę pikseli linii poziomej (t.j., szerokość pola). Należy upewnić się, że w wybranym polu nie znajdują się żadne inne błony. Następnie wyznaczany jest profil intensywności fluorescencji wzdłuż długości wybranego pola.
      2. Po odjęciu intensywności tła należy wyznaczyć średnią intensywność fluorescencji pikseli z najjaśniejszej linii. Promień rurki jest powiązany liniowo z stosunkiem fluorescencji wzdłuż konturu rurki i GUV zgodnie z następującym wzorem:
        R = KkuwetaIkuweta/IGUV (gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki)
        gdzie Kkuweta jest czynnikiem kalibracyjnym25.
        UWAGA: Metodę tę można wykorzystać do pomiaru promienia rurki w zakresie 10–80 nm (gdy rurka jest wystarczająco wąska, aby mieścić się w szerokości jednego woksela konfokalnego) oraz z nieco większą niepewnością w zakresie 80 nm i powyżej. Czułość pomiaru zależy od konfiguracji układu.
    3. Wyznaczyć Kkuweta poprzez wykonanie niezależnych pomiarów promienia w krokach 4.3.1 i 4.3.2 na prostym składzie błony z wykorzystaniem lipidów nieładunkowych. Taki prosty skład błony zapewnia prostą zależność między promieniem a siłą, określoną w kroku 4.3.1. Powtórzyć eksperyment kilka razy i wykreślić R, wyznaczone na podstawie siły (krok 4.3.1) w funkcji Ikuweta/IGUV (gigantyczne jednobłonowe pęcherzyki) (krok 4.3.2). Oblicz Kkuweta z dopasowania. W tej konfiguracji, Kkuweta = 200 ± 50 nm, wykorzystując błonę z L-α-fosfatydylocholiny jajecznej (egg-PC) oraz lipid fluorescencyjny, którego fluorescencja w minimalnym stopniu zależy od polaryzacji25.
      UWAGA: Kkuweta należy zmierzyć dla różnych celów, ze względu na ich różne objętości wokseli konfokalnych. Fluorofor lipidowy nie powinien oddziaływać z wstrzykniętymi białkami/cząsteczkami. Przewiduje się, że rekomendowany w niniejszym protokole fluorescencyjny lipid, BODIPY TR ceramide, nie będzie wchodził w żadne interakcje z białkami. Założenie to zostało potwierdzone w poprzednich badaniach domen BAR i I-BAR25,36,37, z których wynika, że przy wysokim stopniu pokrycia powierzchni białkami promień tubuli jest wyznaczany przez białka, niezależnie od napięcia w GUV. Jeśli białka oddziałują z fluoroforem lipidowym, przy różnych wysokich ułamkach powierzchniowych białek w tubuli zaobserwowano będzie ubytek lub wzbogacenie fluoroforu.
  4. Pomiar gęstości powierzchniowej białek
    1. Przygotować mieszaniny lipidowe, wykorzystując prosty lipid nieładowany (np., PC z żółtek jaj (egg-PC) uzupełniony około pięcioma różnymi ułamkami molowymi lipidu fluorescencyjnego (o tej samej długości fali co barwnik użyty do znakowania białka, np., BODIPY-FLC5-heksadekanoilofosfatydylocholina (HPC*) dla np., białka znakowanego Alexa488) w zakresie: XHPC* = 0,01–1%. Przygotować GUV w 100 mM sacharozy metodą elektroformowania na płytkach ITO (zgodnie z krokiem 1 poprzedniej publikacji13).
    2. Zebrać GUV i przenieść je do komory eksperymentalnej pasywowanej β-kazeiną. Użyć np., 100 mM glukozy do roztworu eksperymentalnego. Odczekać kilka minut, aż GUV opadną na dno.
    3. Wykonaj konfokalne obrazy fluorescencyjne GUV i zarejestruj średnią intensywność fluorescencji wzdłuż konturów GUV jako funkcję ułamka molowego fluorescencyjnego lipidu (patrz Krok 4.3.2). Dla każdego składu oblicz gęstość powierzchniową fluorescencyjnego lipidu, φHPC (obliczenia wysokiej wydajności)*Na przykład, przyjmując, że powierzchnia przypadająca na jedną cząsteczkę lipidu wynosi 0,7 nm²2, φHPC (obliczenia wysokiej wydajności)* = 1,43 x 106 XHPC* zgodnie z ulotką. Wykreśl natężenie fluorescencji HPC* w GUV, IHPC*,GUV, kontra φHPC (obliczenia o wysokiej wydajności)*Dopasowanie pozwala wyznaczyć stałą kalibracji, A, określone przez φHPC (obliczenia wysokiej wydajności)* = Sztuczna inteligencjaHPC*, GUV. A zależy od ustawień mikroskopu, takich jak moc lasera i czułość detektora (t.j., wzmocnienie), zatem zarejestruj A dla różnych powszechnie stosowanych ustawień mikroskopowych (patrz przykład w Rycina 3).
    4. Przygotować kilka roztworów HPC rozpuszczonego w detergencie, np., dodecylosiarczan sodu (SDS), w różnych stężeniach w zakresie od ~ 1 do 10-50 µMZarejestrowano intensywność fluorescencji każdego roztworu w całej objętości i obliczono nachylenie linii intensywności. w zestawieniu z stężenie (Rysunek 3). Powtórz pomiar z fluorophorem, który zostanie sprzężony z białkiem, w podobnym zakresie stężeń (patrz przykład z Alexa488 w Rycina 3). Pomiar ten jest niezbędny do odniesienia intensywności fluorescencji znacznika białka i znacznika lipidów, IA488, masowy / IHPC*,masowyponieważ nie muszą one emitować w ten sam sposób przy tym samym stężeniu całkowitym.
    5. Zmierz liczbę fluoroforów przypadających na jedną cząsteczkę białka za pomocą fluorospektrometru. Na przykład, w przypadku Alexa488, liczba cząsteczek Alexa488 na białko, nA488, można obliczyć za pomocą następującego związku:
      nA488 = (A494/εA488)/((A280 - 0.11A494) / εprot)
      gdzie A494 i A280 są wartościami absorbancji na jednostkę długości odpowiednio przy 494 nm i 280 nm, a εA488 oraz εprot odpowiednio współczynnikami absorpcji molekularnej Alexa488 i białka.
    6. Oblicz gęstość powierzchniową białka na GUV, φbiałko,GUVzgodnie z następującym wzorem:
      Równanie równowagi dla Φprot,GUV; analiza intensywności fluorescencji.
      Należy wziąć pod uwagę stan polimeryzacji białka. Na przykład białka BAR tworzą dimery, w związku z czym obliczona gęstość będzie gęstością monomeru BAR na jednostkę powierzchni, jeżeli zostanie zastosowany współczynnik ekstynkcji formy monomerycznej.

Wykres korelacji liniowej; intensywność fluorescencji w funkcji stężenia; analiza danych w teście białkowym.
Rycina 3: Przykład kalibracji gęstości powierzchniowej białka. Zmierzono intensywność fluorescencji lipidów HPC* w roztworze (lewo) oraz w GUVs (środek). Zmierzono również intensywność fluorescencji Alexa488 (związanego z domeną BAR) w roztworze (prawo). Intensywność fluorescencji skaluje się liniowo wraz ze stężeniem. Przedstawione pomiary dotyczą określonego wzmocnienia detekcji i mocy wyjściowej lasera. Wykresy zostały wygenerowane na podstawie danych z literatury37. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperyment wyciągania rurek może dostarczyć kluczowych informacji mechanicznych na temat błony. W przypadku braku białek lub innych cząsteczek sprzęgających się z krzywizną błony, siłę błony oraz promień rurki można powiązać z napięciem błony, stosując równanie hamiltoniana Canhama-Helfricha do rurki wyciągniętej z GUV50,51

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda wyciągania rurek z GUV dostarcza bogatych informacji na temat układu błona-białko, ponieważ jest nie tylko środkiem do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błony, ale także pomaga rzucić światło na sprzężenie między białkami a krzywizną błony. Jak omówiono we wprowadzeniu, istnieją inne techniki pomiaru wpływu białek zakrzywiających błonę, albo poprzez inkubację białek z submikronowymi liposomami przywiązanymi do pasywowanej powierzchni 18,19, al...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Benoit Sorre, Damienowi Cuvelierowi, Pierre'owi Nassoyowi, François Quemeneurowi i Gilowi Toombesowi za ich istotny wkład w wprowadzenie metody nanorurkowej w grupie. Grupa P.B. należy do konsorcjum CNRS CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) oraz Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai została sfinansowana ze stypendium EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1527-2014) i działań Marie Curie (H2020-MSCA-IF-2014, projekt membrane-ezrin-actin). M.S. jest młodszym członkiem Simons Society of Fellows.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-Dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina (DOPC)Avanti850375Przykład lipidu użytego w danych do rysunku 3
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-[biotynyl(glikol polietylenowy)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotyna]Avanti880129biotynylowany lipid
BODIPY-TR-C5-ceramidSondy molekularne (ThermoFisher)D7540fluorescencyjny lipid
BODIPY- FLC5-heksadekanoylocholina fosfatydylocholina (HPC*)Sondy molekularne (ThermoFisher)fluorescencyjny lipid do kalibracji gęstości białka
jajko L-&alfa;-fosfatydylocholina (eggPC)Avanti840051służy do kalibracji stałej promienia probówki
β-kazeiny z mleka krowiego (>99%)Sigma AldrichC6905służy do pasywacji mikropipety i komora doświadczalna
SacharozaSigma AldrichS7903
D(+) glukozaSigma AldrichG7021
NaClSigma AldrichS7653
TrisSigma Aldrich10708976001
osmometrLosern/a
Pt-wires, średnica 0,5 mm, czystość 99,99%Goodfellow, USAPT005139używany do
nie dotyczysłuży do wytwarzania prądu dla
szpachlówkiVitrex (z CML Francja)CRIT 140013używany do uszczelniania kąpieli w komorze elektroformacji
sonikatornie jest przydatnydo czyszczenia komory elektroformacji, ale nie jest kluczowy
Mikroskop odwrócony TE2000 firmy Nikon, system konfokalny eC1 (Nikon), z dwiema liniami laserowymi (λ = 488 nm i 543 nm); pęseta optyczna indukowana laserem o długości fali ciągłej z włókna iterbowego o mocy 5 W (λ > 1070 nm; IPG GmBH Niemcy)przykład systemu mikroskopii konfokalnej wyposażonego w pęsetę optyczną
mikromanipulatoryn/a
kapilary borokrzemianowe (o promieniach wewnętrznych i zewnętrznych odpowiednio 0,78 mm i 1 mm)Ściągacz30-0036
Sutter InstrumentP-2100
microforgeNarishigeMF-800
Physik Instrumentebrak
koralików pokrytych streptawidyną z polistyrenu (średnica 3,2 i mikro; m)SpherotechSVP-30-5
generatora funkcji elektroformacji GUV galwanicznej GUV , do mikropipet Harvard Siłownik piezoelektryczny

Bibliografia

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
  3. Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16 (10), 493-498 (2006).
  4. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37 (12), 526-533 (2012).
  5. Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30 (17), 3501-3515 (2011).
  6. Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68 (24), 3983-3993 (2011).
  7. Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25 (12), 780-792 (2015).
  8. Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2 (1), 91-117 (2012).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
  10. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  11. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  12. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  13. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  14. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281(2015).
  15. Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39 (1), 71-81 (1982).
  16. Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39 (1), 83-89 (1982).
  17. Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
  18. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  19. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  20. Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974(2015).
  21. Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109 (2), 298-307 (2015).
  22. Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88 (4), 2714-2726 (2005).
  23. Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88 (23), 238101(2002).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 173-178 (2012).
  26. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  27. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  28. Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132 (4), 1200-1201 (2010).
  29. Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55 (3), 509-517 (1989).
  30. Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19 (3), 575-584 (2003).
  31. Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64 (6), 837(2003).
  32. Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102 (8), 1837-1845 (2012).
  33. Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565(2013).
  34. Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9 (12), e115357(2014).
  35. Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  36. Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. , (2015).
  37. Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  38. Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93 (15), 158104(2004).
  39. Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151 (3), 619-629 (2012).
  40. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  41. Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170 (1), 172-184 (2017).
  42. Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11 (25), 5030-5036 (2015).
  43. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  44. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  45. Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (28), 282001(2014).
  46. Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
  47. Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. , University of Southern Denmark. (2011).
  48. Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94 (6), 068101(2005).
  49. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35 (3), 637-652 (1981).
  50. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28 (11), 693-703 (1973).
  51. Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26 (1), 61-81 (1970).
  52. Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3 (1), 204-210 (1984).
  53. Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47 (3), 507-516 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

P seta optycznaaspiracja mikropipetmikroskopia konfokalnakrzywizna b onywi zanie bia eksztywno zginaniaintensywno fluorescencjikuleczki streptawidyny
Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.