Artykuł metodologiczny

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

DOI:

10.3791/56086

⸱

7 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przekształcanie błony komórkowej jest integralną częścią wielu zjawisk komórkowych, takich jak endocytoza, transport, powstawanie filopodiów, itp. Wiele różnych białek kojarzy się z zakrzywionymi błonami ze względu na ich zdolność do wyczuwania lub wywoływania krzywizny błony. Zazwyczaj procesy te obejmują wiele białek, co czyni je zbyt złożonymi, aby można je było badać ilościowo w komórce. Opisujemy protokół rekonstytucji zakrzywionej błony in vitro, naśladując zakrzywioną strukturę komórkową, taką jak szyjka endocytarna. Gigantyczny pęcherzyk jednopłytkowy (GUV) jest używany jako model błony komórkowej, której ciśnienie wewnętrzne i napięcie powierzchniowe są kontrolowane za pomocą aspiracji mikropipet. Przyłożenie punktowej siły ciągnącej do GUV za pomocą pęsety optycznej tworzy nanorurkę o dużej krzywiźnie połączoną z płaską membraną. Metoda ta jest tradycyjnie stosowana do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błon lipidowych, takich jak sztywność zginania. W ostatnich latach został rozszerzony o badanie, w jaki sposób białka oddziałują z krzywizną błony oraz w jaki sposób wpływają na kształt i mechanikę błon. System łączący mikromanipulację, mikroiniekcję, pęsetę optyczną i mikroskopię konfokalną umożliwia jednoczesny pomiar krzywizny błony, napięcia błony i gęstości powierzchni białek. Na podstawie tych pomiarów można wywnioskować wiele ważnych właściwości mechanicznych i morfologicznych układu białkowo-błonowego. Ponadto opracowujemy protokół tworzenia GUV w obecności fizjologicznego stężenia soli oraz metodę ilościowego określania gęstości powierzchniowej białek na błonie na podstawie intensywności fluorescencji znakowanych białek i lipidów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielu procesom komórkowym, takim jak endocytoza, transport, tworzenie filopodiów, infekcje, itp., towarzyszy dramatyczna zmiana kształtu błon komórkowych1,2. W komórce wiele białek uczestniczy w tych procesach, wiążąc się z błoną i zmieniając swój kształt. Najbardziej godnymi uwagi przykładami są członkowie rodziny białek Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR), zawierający charakterystyczną wewnętrznie zakrzywioną domenę BAR3,4,5,6,7. Zazwyczaj oddziałują one z błoną, przylegając domenę BAR do powierzchni, a w wielu przypadkach również płytko wprowadzając amfipatyczne helisy do dwuwarstwy. Kształt, rozmiar i ładunek domeny BAR wraz z liczbą amfipatycznych helis określają: (1) kierunek krzywizny błony (tj. czy będą one indukować wgłębienia lub wypukłości) oraz (2) wielkość krzywizny błony5,8. Warto zauważyć, że tutaj dodatnia krzywizna jest definiowana jako wypukła strona zakrzywionej membrany, tj. wybrzuszenie w kierunku oddziałującej cząstki, a ujemna w przeciwnym razie. Co więcej, badania ilościowe białek BAR wykazały, że ich wpływ na błonę zależy od zestawu parametrów fizycznych: gęstości powierzchniowej białek, napięcia błony i kształtu błony (kształt płaski kontra rurowy kontra kulisty)7. W zależności od tych parametrów białka BAR mogą: (1) działać jako czujniki krzywizny błony, (2) zginać błony, lub (3) indukować rozcięcie błony7.

Ze względu na ogromną liczbę składników biorących udział w przekształcaniu błony w komórce, badanie ilościowych aspektów zjawisk, takich jak endocytoza, in vivo jest niezwykle trudne. Rekonstytucja in vitro minimalnych składników naśladujących zakrzywione błony w komórce pozwala na mechanistyczne zrozumienie, jak działają białka zakrzywiające błonę. W artykule opisano protokół odtwarzania nanorurki membranowej in vitro przy użyciu mikromanipulacji, mikroskopii konfokalnej i pęsety optycznej. Podejście to można wykorzystać do ilościowego zbadania, w jaki sposób białka, lipidy lub małe cząsteczki oddziałują z zakrzywionymi błonami. Lipidowe GUV są używane jako modele błony komórkowej, której krzywizna jest znikoma w porównaniu z wielkością oddziałujących cząsteczek zakrzywiających błonę. Są one przygotowywane przy użyciu metody elektroformacji9, w której pęcherzyki są formowane przez uwodnienie filmu lipidowego i pęcznienie go w GUV pod prądem przemiennym (AC)10. Najczęstszymi podłożami, na których rosną GUV, są płyty półprzewodzące pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) lub druty platynowe (druty Pt)11. W tej pracy GUV są hodowane na drutach Pt, ponieważ wykazano, że ta metoda działa znacznie lepiej niż alternatywa w tworzeniu GUV w obecności soli w buffer12. Chociaż protokół elektroformacji jest tutaj opisany na tyle szczegółowo, aby go odtworzyć, odsyłamy czytelnika do poprzednich artykułów, w których szczegółowo opisano podobne i inne metody wytwarzania GUVów13,14. W naszych rękach elektroformacja na drutach Pt z powodzeniem dała GUV z mieszanki syntetycznych lipidów lub z naturalnych ekstraktów lipidowych w buforze zawierającym ~100 mM NaCl. Co więcej, udało się również otoczkować białka wewnątrz GUV podczas wzrostu. Przykładowa komora do elektroformacji jest pokazana w Rysunek 1A; składa się z dwóch drutów Pt o długości ~10 cm umieszczonych w uchwycie wykonanym z politetrafluoroetylenu (PTFE), który można uszczelnić z obu stron szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w odległości ~1 - 2 cm od siebie (Rysunek 1A).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Konfiguracja eksperymentalna. (A) Komora galwaniczna GUV ze złączami elektrycznymi podłączonymi do przewodów Pt. (B) Po lewej: układ doświadczalny przedstawiający mikroskop, komorę doświadczalną nad obiektywem oraz dwie mikropipety (lewą i prawą) przymocowane do mikromanipulatorów i włożone do komory doświadczalnej w celu wyciągania probówki i wstrzykiwania białka. Po prawej: zbliżenie komory doświadczalnej zamontowanej nad obiektywem, pokazujące końcówki aspiracji i włożone mikropipety iniekcyjne. (C) Strzykawka wyposażona w cienki dozownik umieszczony na końcu mikropipety. Na dole znajduje się zbliżenie dozownika wewnątrz mikropipety z niebieską przerywaną linią obrysowującą mikropipetę. System ten służy do napełniania mikropipety kazeiną w celu pasywacji powierzchni szkła, a także do napełniania olejem mineralnym w razie potrzeby. (D) System stosowany do zasysania μl roztworu białkowego. Igła jest podłączona do strzykawki i do rurki, która jest podłączona do mikropipety iniekcyjnej. Końcówkę mikropipety ostrożnie zanurza się w roztworze białkowym i zasysa tak, aby napełniła końcówkę mikropipety. Mikropipeta jest następnie ponownie napełniana olejem mineralnym za pomocą systemu pokazanego w panelu C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Nanorurka membranowa, o promieniu od 7 nm do kilkuset nm, może być wyciągnięta z GUV przez siłę zewnętrzną. Metoda ta została początkowo zaprojektowana do pomiaru właściwości elastycznych błon komórkowych i pęcherzyków, takich jak sztywność zginania15,16. W najnowszych pracach metoda została rozszerzona o badanie interakcji białek z zakrzywionymi błonami poprzez mikroiniekcję białek w pobliżu wyciągniętej nanorurki7,17. Opracowano inne metody badania białek zakrzywiających błonę. W jednej metodzie białka są inkubowane z liposomami o różnej wielkości przywiązanymi do pasywowanej powierzchni. Mikroskopia konfokalna służy do pomiaru wiązania białek w funkcji średnicy liposomu, co może wskazywać na sortowanie wywołane krzywizną18,19. W innej metodzie białka są wstrzykiwane w pobliżu mikroaspirowanego GUV, aby zmierzyć ich zdolność do spontanicznego indukowania kanalików20,21. Metoda opisana w tym protokole jest wyjątkowo odpowiednia do badania białek zakrzywiających błonę biorących udział w endocytozie, gdzie większość białek zwykle napotyka wstępnie uformowane nanorurki błonowe łączące wgłębienie błony zawierającej ładunek z leżącą poniżej płaską błoną plazmatyczną. Ponadto w tej metodzie, w przeciwieństwie do testu z małymi liposomami na uwięzi, nanorurka membranowa jest w sposób ciągły połączona z membraną; w związku z tym znajduje się w równowadze mechanicznej z GUV, co jest sytuacją oczekiwaną in vivo. W związku z tym zastosowanie ma podstawowa fizyka membran i możemy wywnioskować mnóstwo właściwości mechanicznych z naszych pomiarów22,23,24.

Do pełnego wdrożenia tej metody, niezbędny sprzęt obejmuje mikroskop konfokalny, pęsetę optyczną oraz jedną lub dwie mikropipety podłączone do zbiornika na wodę (Rysunek 1B). Łącząc wszystkie trzy, możliwe jest jednoczesne mierzenie napięcia błony, krzywizny błony, gęstości powierzchni białek i siły rurki25. Aspiracja mikropipet jest niezbędna i można ją łatwo zbudować, wkładając szklaną mikropipetę do uchwytu podłączonego do zbiornika na wodę, który za pomocą ciśnienia hydrostatycznego kontroluje ciśnienie zasysania26. Mikropipeta i uchwyt są sterowane za pomocą mikromanipulatora, a najlepiej w jednym kierunku za pomocą siłownika piezo, co zapewnia precyzyjny ruch. Aby wyciągnąć nanorurkę, mikroaspirowany GUV jest na krótko przyklejany do kulki o wielkości mikrona, a następnie odciągany, tworząc nanorurkę. W tej implementacji koralik jest trzymany przez pęsetę optyczną, którą można skonstruować, postępując zgodnie z opublikowanym protokołem27. Możliwe jest dozowanie pęsety optycznej i wyciąganie nanorurek na różne sposoby, choć kosztem dokładnych pomiarów siły. Jeśli zbudowanie pułapki optycznej jest zbyt trudne lub jeśli pomiary siły nie są konieczne, na przykład jeśli ktoś chce po prostu sprawdzić preferencje białek dla zakrzywionych membran, rurkę można wyciągnąć za pomocą kulki zassanej na końcu drugiej mikropipety28. Możliwe jest również ciągnięcie rur za pomocą siły grawitacyjnej29 lub flow30,31. Co więcej, mikroskopia konfokalna również nie jest niezbędna; Jednak preferowane jest mierzenie gęstości powierzchniowej białek. Umożliwia również pomiar promienia nanorurek od intensywności fluorescencji lipidów w probówce, a więc niezależnie od siły i napięcia membrany. Wnioskowanie o promieniu rurki na podstawie fluorescencji jest szczególnie ważne, jeśli zależność między tymi wielkościami odbiega od dobrze ustalonych równań ze względu na obecność białek przylegających do błony25. Co ważne, nie można zrezygnować zarówno z pułapki optycznej, jak i mikroskopii konfokalnej, ponieważ nie będzie możliwe zmierzenie krzywizny tubusu.

Metoda opisana w tym protokole została wykorzystana do zbadania indukowanego krzywizną sortowania różnych białek błony obwodowej na nanorurkach, głównie tych z rodziny BAR25,32,33,34. Wykazano również, że stożkowato ukształtowany transbłonowy kanał potasowy KvAP jest wzbogacony na zakrzywionych nanorurkach w taki sam sposób jak białka BAR35. Optymalizując metodę hermetyzacji białek wewnątrz GUV, niedawno zbadano również oddziaływanie białek o ujemnej krzywiźnie36. Ponadto metoda ta została wykorzystana do wyjaśnienia powstawania rusztowań białkowych25,37 oraz do zbadania mechanizmu rozcinania błony przez naprężenie linii38, protein dynamin39, lub przez BAR proteins40,41. Oprócz białek, małe cząsteczki lub jony mogą również indukować krzywiznę. Stosując tę metodę, wykazano, że jony wapnia indukują dodatnią krzywiznę w warunkach wolnych od soli42. Co ciekawe, wykazano również, że lipidy mogą ulegać sortowaniu według krzywizny, ale tylko w przypadku kompozycji, które znajdują się w pobliżu punktu demieszania43,44. Podsumowując, metoda ta może być stosowana przez badaczy zainteresowanych badaniem, w jaki sposób integralne składniki błony (np. lipidy lub białka transbłonowe) lub cząsteczki wiążące obwodowo (wewnątrz lub na zewnątrz GUV) oddziałują z cylindrycznie zakrzywionymi membranami, z mechanicznego i ilościowego punktu widzenia. Jest również przeznaczony dla osób zainteresowanych pomiarem właściwości mechanicznych samej membrany22,23,45.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie GUV przez elektroformację na drutach Pt

  1. Oczyść komorę galwanizacji (patrz Wprowadzenie i Rysunek 1A) i druty Pt rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak etanol lub aceton, aby zmyć lipidy i wodą, aby zmyć sole.
    UWAGA: Sugerujemy dokładne wytarcie pozostałości chusteczką nasączoną etanolem, a następnie sonikację w acetonie, etanolu, a następnie wodzie, każdy przez 5 minut.
  2. Przygotować mieszaninę lipidów o pożądanym składzie lipidowym w sile 1 mg/ml w chloroformie. Mieszanina powinna zawierać ~ 0,05% frakcji molowej lipidu sprzężonego z biotyną (np. 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[biotynyl(glikol polietylenowy)-2000]) oraz ~ 0,5% frakcji molowej lipidu sprzężonego z fluoroforem (np. BODIPY-TR-C5-ceramid).
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że trudno było wyprodukować GUV z wysoką wydajnością zawierającą więcej niż 30% naładowanych lipidów.
    UWAGA: Z chloroformem należy obchodzić się w kapturze chemicznym w odpowiednich rękawicach.
  3. Włóż parę przewodów Pt do komory galwanoformacji. Umieść mieszaninę lipidów na drutach Pt w kroplach oddalonych od siebie o ~ 2-3 mm (łącznie ~ 4 μL mieszanki).
  4. Suszyć druty w próżni przez 30–60 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Uszczelnij dno komory, przyklejając szkiełko nakrywkowe do komory za pomocą smaru silikonowego. Napełnić komorę buforowanym roztworem zawierającym NaCl, sacharozę i środek buforujący (np. 70 mM NaCl, 100 mM sacharozy i 10 mM Tris, o pH 7,4). To podłoże będzie znajdować się wewnątrz GUV w eksperymencie. Istotne jest, aby osmolarność tego podłoża odpowiadała osmolarności pożywki doświadczalnej w zakresie ~ 10%. Użyj sacharozy, aby dostosować osmolarność. Dodaj białka do roztworu w żądanym stężeniu, jeśli celem jest zamknięcie ich w GUVs.
    UWAGA: Różne sole i cukry w buforze mogą wpływać na sztywność zginania i spontaniczną krzywiznę membran24,42,46,47.
  6. Uszczelnij górną część komory, przyklejając szkiełko nakrywkowe smarem silikonowym, zapewniając minimalną ilość powietrza wewnątrz komory. Doprowadź sinusoidalny prąd przemienny przez przewody Pt o częstotliwości 500 Hz i 280 mV.
    UWAGA: Czas wzrostu i temperatura muszą być zoptymalizowane w zależności od składu lipidowego i wrażliwości białka. W przypadku stosowania naturalnych ekstraktów lipidowych, a także podczas kapsułkowania białek w GUV, najlepsze plony osiągnięto przy uprawie GUV w temperaturze 4 °C przez noc. Przy braku białek i syntetycznych kompozycjach lipidowych wzrost w temperaturze pokojowej przez ~ 2 godziny był wystarczający
    7. .

2. Przygotowanie komory doświadczalnej i mikropipet

  1. Aby przygotować mikropipety, należy pociągnąć szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do pipet. Sugeruje się stosowanie kapilary szklanej o promieniach wewnętrznych i zewnętrznych wynoszących odpowiednio 0,7 mm i 1 mm. Następnie należy udoskonalić końcówkę mikropipety tak, aby jej średnica wewnętrzna wynosiła 5–7 μm, za pomocą mikrokuźni. Jeśli w eksperymencie zostaną wstrzyknięte białka lub inne cząsteczki, należy wyciągnąć kolejną mikropipetę i udoskonalić jej końcówkę do wewnętrznej średnicy 8–15 μm.
  2. Zbuduj komorę doświadczalną, umieszczając dwa prostokątne szkiełka nakrywkowe do mikroskopii na metalowej podstawie, jak pokazano na Rysunek 1. Szkiełka nakrywkowe powinny być oddalone od siebie o ~ 1 mm. Komora powinna mieć otwory wzdłuż długich krawędzi (patrz Rysunek 1). Otwarte boki powinny pasować do końcówki mikropipety, gdzie końcówka powinna sięgać co najmniej do środka komory.
  3. Przygotować bufor doświadczalny, którego osmolarność nie powinna różnić się o więcej niż 10% od buforu używanego do hodowli GUV. Dostosuj osmolarność za pomocą glukozy. Przykładem eksperymentalnego buforu, który został wykorzystany w badaniu oddziaływania endofiliny z nanorurkami, jest 100 mM NaCl, 40 mM glukozy, buforowany Tris do pH 7,4. Połączenie sacharozy wewnątrz i glukozy na zewnątrz zapewnia: (a) wystarczający kontrast fazowy do obserwacji GUV za pomocą mikroskopii jasnego pola oraz (b) większą gęstość wewnątrz GUV, co powoduje, że osiadają one na dnie komory. Dostosuj stężenie soli w oparciu o wymagania eksperymentalne.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że oprócz wpływu na właściwości mechaniczne membrany, wysokie stężenie glukozy (> 300 mM) negatywnie wpływa na tworzenie wiązań streptawidyna-biotyna, wymaganych do wyciągnięcia nanorurki. Ponadto zbyt mała ilość soli hamuje wiązania streptawidyna-biotyna, a zbyt wysokie stężenie zaburza interakcje białko-błona. W przypadku kapsułkowania białek, użycie bardzo wysokiego stężenia soli w buforze zewnętrznym (np. >200 mM NaCl) może być użyte jako sztuczka w celu odłączenia białek od zewnętrznej ulotki36. Konieczne jest eksperymentowanie z zakresem stężeń soli, aby znaleźć optymalne warunki wiązania interesującej cząsteczki.
  4. Na 30–60 minut przed pobraniem GUV do eksperymentu należy pasywować szklane powierzchnie, wypełniając zarówno komorę doświadczalną, jak i mikropipetę aspiracyjną roztworem 5 mg/ml wysoce czystej β-kazeiny (np. rozpuszczonej w buforze doświadczalnym). β-kazeina tworzy warstwę ochronną na powierzchniach szkła, zapobiegając zbyt silnemu przyleganiu GUV, co spowodowałoby ich pęknięcie. Inkubować z β-kazeiną przez 30–60 minut.
    UWAGA: Wewnątrz mikropipety nie powinno być pęcherzyków powietrza, które zakłócałyby kontrolowanie naprężenia membrany.
    1. Aby zbudować dozownik do napełniania mikropipet, należy przełamać igłę strzykawki blisko plastikowego łącznika i wkleić w nią cienką kapilarnę krzemionkową (taką jak te używane do chromatografii cieczowej) (Rysunek 1C).
  5. Podczas inkubacji z β-kazeiną zamontuj komorę na mikroskopie i wyśrodkuj ją nad obiektywem. Włóż końcówkę mikropipety aspiracyjnej przez otwór wzdłuż dłuższej krawędzi i umieść końcówkę nad obiektywem mikroskopu. Wyreguluj poziom wody w zbiorniku tak, aby ciśnienie zasysania było bliskie zeru (nie powinno być dużego przepływu do lub z pipety, który można zobaczyć pod mikroskopem).
  6. W przypadku, gdy białka lub inne cząsteczki zostaną wstrzyknięte podczas eksperymentu, należy napełnić mikropipetę iniekcyjną pożądaną cząsteczką rozpuszczoną w buforze doświadczalnym o wybranym stężeniu, zamontować mikropipetę w mikromanipulatorze i wprowadzić przez przeciwną stronę komory doświadczalnej.
    1. Aby użyć minimalnej ilości białka, należy napełnić białko białkiem tylko końcówkę mikropipety przez aspirację. Aby to zrobić, owiń koniec igły przymocowanej do strzykawki plastikową rurką. Włożyć rurkę do tylnej części mikropipety iniekcyjnej.
    2. Bardzo ostrożnie zanurzyć końcówkę mikropipety w roztworze białkowym i zassać ją, aby napełnić końcówkę mikropipety.
      UWAGA: Ta prosta konfiguracja jest pokazana w Rysunek 1D i, z naszego doświadczenia, pozwala na zasysanie już od kilku μl roztworu białkowego.
    3. Resztę mikropipety iniekcyjnej należy napełnić olejem mineralnym, aby zapobiec mieszaniu się roztworu białkowego z wodą ze zbiornika na wodę (korzystając z zestawu w Rysunek 1C).
    4. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do pipety iniekcyjnej, ponieważ spowoduje to niestabilne ciśnienie wtrysku. Alternatywnie, jeśli ilość białka jest wystarczająca, napełnij mikropipetę białkami w taki sam sposób, jak napełniasz ją β-kazeiną, jak opisano w kroku 2.4. Wyreguluj poziom wody w zbiorniku, aby zminimalizować ciśnienie zasysania w pipecie iniekcyjnej.
      UWAGA: Stężenie wstrzykniętej cząsteczki lub jonu w pobliżu nanorurki będzie niższe ze względu na rozcieńczenie i można je oszacować, mierząc spadek intensywności fluorescencji w funkcji odległości od wyjścia z pipety42. Ważniejsza jest jednak znajomość dwuwarstwowej gęstości wstrzykniętej cząsteczki, którą można precyzyjnie zmierzyć (patrz sekcja 4).
  7. Po inkubacji z β-kazeiną wyjąć roztwór z komory i kilkakrotnie przepłukać buforem doświadczalnym. Napełnij buforem eksperymentalnym.
  8. Zatrzymaj elektroformację GUV i zbierz je bezpośrednio z przewodów Pt. Dodać kilka μl roztworu GUV do komory doświadczalnej. Używaj tylko świeżo przygotowanych GUV.
  9. Dodać kilka μl kulek pokrytych streptawidyną do komory doświadczalnej, aby uzyskać końcowe stężenie kulek w komorze na poziomie około 0,1 x 10-3 % (w/v) lub mniejszym. Zalecane są kulki polistyrenowe o średnicy ~3 μm (kulki polistyrenowe w wodzie mają prawie optymalny kontrast współczynnika załamania światła w odniesieniu do maksymalizacji siły gradientu w stosunku do siły rozpraszania w pułapce optycznej). Stężenie kulek można dostosować na podstawie eksperymentu: bardzo niskie stężenie utrudnia ich znalezienie w komorze, a zbyt wysokie stężenie grozi wpadnięciem wielu kulek do pęsety optycznej.

3. Wyciąganie nanorurki membranowej z GUV

  1. Niech GUV i koraliki osiądą na dnie komory. Opróżnij GUV, pozwalając odrobinie eksperymentalnego buforu odparować przez około ~ 15 minut. Opróżnienie GUV jest niezbędne, aby wytworzyć nadmiar obszaru, który można zassać za pomocą mikropipety. GUV powinny widocznie falować (tj. wydawać się wiotkie) pod mikroskopem świetlnym. Jeśli wydają się napięte, pozwól na dłuższy czas parowania.
    UWAGA: Szybkość zmiany osmolarności zależy od powierzchni parowania, temperatury itp. i powinna być ściśle monitorowana. Zasadniczo, różnicę osmolarności można ustalić od samego początku, dostosowując stężenie sacharozy/glukozy, jednak należy zachować ostrożność, aby nie wywołać wstrząsu osmotycznego.
  2. Znajdź dyskietkę GUV i zassaj ją do pipety. Długość języka zasysającego (część membrany wewnątrz pipety) powinna być równa lub większa niż promień pipety, aby analiza teoretyczna miała zastosowanie15,16,22,23 (Rysunek 2). Wypróbuj kilka GUV-ów. Jeśli żaden z GUV nie może zostać zaaspirowany, aby wytworzyć wystarczająco długi język, odczekaj jeszcze kilka minut. Jeśli GUV są wystarczająco dyskietki, przejdź do następnego kroku.
  3. Uszczelnić komorę olejem mineralnym, aby zapobiec dalszemu parowaniu bufora. W tym celu należy ostrożnie pipetować olej wzdłuż otwartych krawędzi komory doświadczalnej.
  4. Aby ustawić pozycję zerową ciśnienia zasysania, najpierw poszukaj kulki w komorze i umieść wyjście pipety zasysającej w pobliżu kulki. Wyreguluj wysokość zbiornika na wodę tak, aby kulka nie została zassana ani zdmuchnięta przez pipetę aspiracyjną. Chociaż olej mineralny zapobiega parowaniu, a tym samym dalszym zmianom ciśnienia wewnątrz komory, przed pomiarem każdego GUV należy wyzerować ciśnienie zasysania.
  5. Znajdź GUV i odessaj go. Przesuń mikropipetę do góry i rozstaw ją na pozycji ostrej (aby utrzymać GUV z dala od powierzchni, na której może zostać wyciągnięta z pipety przez naprężenia ścinające, gdy komora jest poruszana).
  6. Poszukaj koralika, ostrożnie poruszając się po komorze. Nagłe ruchy mogą wysunąć GUV. Uwięzić go pęsetą optyczną w odległości ~ 20 μm od dna komory. Upewnij się, że obszar zainteresowania jest czysty, bez widocznych innych kulek lub membran. Wszystko, co wpadnie do pęsety optycznej inne niż koralik, zakłóci pomiar.
  7. Ustaw ostrość GUV z powrotem i odsuń go od kulki, a mikropipeta jest wyrównana z pułapką optyczną (Rysunek 2).
  8. Rejestruj ruch koralika przez 1–2 minuty, aby zmierzyć położenie równowagi (wymagane do pomiarów siły).
  9. Zmniejsz ciśnienie wewnątrz mikropipety tak bardzo, jak to możliwe, nie tracąc GUV, aby zmniejszyć napięcie membrany. Ostrożnie doprowadź GUV do kontaktu z koralikiem przez około sekundę, ustanawiając wiązania streptawidyna-biotyna, a następnie delikatnie pociągnij do tyłu, tworząc nanorurkę. Ruch GUV w kierunku lub od koralika powinien być najlepiej wykonany za pomocą siłownika piezo, aby zminimalizować zakłócenie koralika w pęsetie optycznej.
    UWAGA: Jeśli nanorurka nie powstanie, może to być spowodowane słabą powłoką streptawidyny kulki, niewystarczającą ilością biotynylowanych lipidów w GUV, niewystarczającym stężeniem soli lub nadmiernym stężeniem glukozy w eksperymentalnym buforze lub zbyt 48.
  10. Zwiększ ciśnienie zasysające, aby odtworzyć język zachłystowy. Ustaw probówkę tak, aby leżała w osi pipety zasysającej i maksymalnie skup się na probówce (Rysunek 2).
  11. Upewnij się, że równik GUV i rurka są ostre. Rejestruj ruch koralika za pomocą mikroskopii jasnego pola przez kilka minut (tutaj prędkość akwizycji kamery wynosi 30 Hz). Zapisz wysokość, h, zbiornika na wodę w odniesieniu do pozycji zerowej. Zrób kilka obrazów konfokalnych systemu (Rysunek 2).
  12. Powtórz poprzedni krok przy różnych ciśnieniach aspiracji, domyślnie naprężeniach błony. Typowy zakres naprężenia wynosi 0,015–0,2 mN/m, przy wielkości kroku około 0,02 mN/m.
  13. W przypadku wstrzykiwania białek lub cząsteczek w pobliżu systemu, należy zbliżyć mikropipetę do iniekcji w pobliżu nanorurki, upewniając się, że kulka w pułapce optycznej nie jest zaburzona. Delikatnie wstrzykiwać pod ciśnieniem około 1-2 Pa.
  14. Po zrównoważeniu wiązania białka (intensywność fluorescencji białka wstrzykniętego na błonę pozostaje stała na GUV), powtórz pomiary krok po kroku, tak jak w przypadku gołej błony (kroki 3.11 i 3.12).
    UWAGA: Ponieważ pomiary są wykonywane podczas wstrzykiwania białek w pobliżu GUV pod stałym ciśnieniem, stężenie objętościowe białka pozostaje mniej więcej niezmienione w pobliżu GUV; W związku z tym desorpcja białka powinna być pomijalna podczas pomiaru.
    1. Alternatywnie możliwe jest inkubowanie GUV razem z białkami przed wykonaniem eksperymentów z ciągnięciem rurki, aby zapewnić stałe stężenie objętościowe białka. Biorąc pod uwagę, że mierzy się względną frakcję błonową białek na probówce i na GUV, sposób dostarczania białek nie ma wpływu na obliczenia sortowania krzywizny (patrz punkt 4).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Eksperyment z ciągnięciem rurki. (A) Schematy eksperymentu. (B) konfokalny obraz ciągniętej rurki, zgodnie z opisem w niniejszym Protokole. Podziałka = 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Pomiary i analiza danych

  1. Pomiar naprężenia membrany
    1. Oblicz ciśnienie hydrostatyczne dla każdego kroku przy stałym ciśnieniu zasysania:
      ΔP = pgh
      gdzie p jest gęstością wody, g przyspieszeniem grawitacyjnym, a h wysokością zbiornika na wodę od kroku 3.11.
    2. Na podstawie obrazów konfokalnych zmierz promień GUV, rGUV i promień pipety aspiracyjnej, r (Rysunek 2).
    3. Oblicz naprężenie membrany, σ, korzystając z równania Laplace'a49:
      figure-protocol-2
  2. Pomiar siły membrany
    1. Określ sztywność pęsety optycznej, k, korzystając z jednej z kilku metod kalibracji27. W tej konfiguracji zmierz k za pomocą metody oporu lepkościowego27.
    2. Obliczyć położenie równowagi stopki, a0, jako średnią z pomiaru przed pociągnięciem rurki (krok 3.8).
    3. Dla każdego pomiaru stałego napięcia oblicz równowagę siły membrany, F, z prawa Hooke'a:
      F = k(a - a0)
      gdzie a jest średnim położeniem stopki podczas tego pomiaru.
  3. Promień rury pomiarowej
    1. W przypadku gołej membrany (bez dodanych cząsteczek zakrzywiających błonę) oblicz promień rury, R, od siły jako:
      R = F/(4πσ)
      (referencje22,23).
    2. Aby zmierzyć promień rurki w obecności cząsteczek zakrzywiających błonę i niezależnie od kroku 4.3.1, najpierw zapisz intensywność fluorescencji lipidów wzdłuż długości rurki, Itub, i wzdłuż konturu GUV, IGUV. Zmierz średnią intensywność fluorescencji fluoroforu w membranie lub związanego z membraną jako średnią intensywność wzdłuż najjaśniejszej linii rurki lub konturu GUV. Wybierz prostokątne pole zawierające poziomy przekrój konturu GUV lub rurki i oblicz sumę intensywności fluorescencji każdej poziomej linii w polu.
      1. Podziel każdą sumę przez liczbę pikseli linii poziomej (tj. szerokość pola). Należy pamiętać, że w wybranym polu nie powinno być żadnych innych membran. Uzyskuje się profil intensywności fluorescencji na całej długości wybranego pudełka.
      2. Po odjęciu intensywności tła weź średnią intensywność fluorescencji pikseli od najjaśniejszej linii. Promień rury jest liniowo związany ze stosunkiem fluorescencji wzdłuż konturu rurki i GUV jako:
        R = KtubItub/IGUV
        gdzie Ktub jest współczynnikiem kalibracji25.
        UWAGA: Metoda ta może być stosowana do pomiaru promienia lampy w zakresie 10–80 nm (gdy rurka jest wystarczająco wąska, aby leżeć w obrębie jednej szerokości woksela konfokalnego) oraz z nieco większą niepewnością w zakresie 80 nm i wyższym. Czułość pomiaru zależy od konfiguracji.
    3. Oznaczyć wannę K, wykonując niezależne pomiary promienia w krokach 4.3.1 i 4.3.2 na prostym składzie membrany przy użyciu nienaładowanych lipidów. Tak prosty skład membrany zapewnia, że promień i siła mają prostą zależność podaną w kroku 4.3.1. Powtórz eksperyment kilka razy i wykreśl R, wydestylowane z siły (krok 4.3.1) w funkcji Itub/IGUV (krok 4.3.2). Oblicz wannę K na podstawie pasowania. W tej konfiguracji tuba K = 200 ± 50 nm przy użyciu błony L-α-fosfatydylocholiny jaja (egg-PC) i fluorescencyjnego lipidu, którego fluorescencja w minimalnym stopniu zależy od polaryzacji25.
      UWAGA: Wanna K musi być mierzona dla różnych obiektywów, ze względu na ich różne konfokalne objętości wokseli. Fluorofor lipidowy nie powinien wchodzić w interakcje z wstrzykniętymi białkami/cząsteczkami. Oczekuje się, że zalecany tutaj fluorescencyjny lipid, ceramid BODIPY TR, nie będzie wchodził w żadne interakcje z białkami. To założenie zostało potwierdzone wcześniejszymi badaniami domen BAR i I-BAR25,36,37, które wykazały, że przy wysokim pokryciu powierzchni białka, promień rurki jest ustalany przez białka, niezależnie od napięcia w GUV. Jeśli białka wchodzą w interakcję z fluoroforem lipidowym, w probówce obserwuje się zubożenie lub wzbogacenie fluoroforu przy różnych frakcjach powierzchni białka.
  4. Pomiar gęstości powierzchniowej białek
    1. Przygotować mieszaniny lipidów przy użyciu prostego nienaładowanego lipidu (np. jaja-PC) uzupełnionego o około pięć różnych frakcji molowych fluorescencyjnego lipidu (o tej samej długości fali co barwnik używany do znakowania białka, np. BODIPY-FLC5-heksadekanylo-fosfatydylocholina (HPC*) dla np. białka znakowanego Alexa488) w zakresie: XHPC* = 0,01–1%. Przygotuj GUV w 100 mM sacharozy przez elektroformację na płytkach ITO (postępuj zgodnie z krokiem 1 poprzedniej publikacji13).
    2. Zebrać GUV i przenieść do komory doświadczalnej pasywowanej β-kazeiną. Do roztworu doświadczalnego należy użyć np. 100 mM glukozy. Poczekaj kilka minut, aż GUV się uspokoi.
    3. Wykonaj konfokalne obrazy fluorescencyjne GUV i zarejestruj średnią intensywność fluorescencji wzdłuż konturów GUV jako funkcję frakcji molowej fluorescencyjnego lipidu (patrz krok 4.3.2). Dla każdej kompozycji należy obliczyć gęstość powierzchniową lipidu fluorescencyjnego φHPC*. Na przykład, zakładając, że powierzchnia na lipid wynosi 0,7 nm2, φHPC* = 1,43 x 106 XHPC* na ulotkę. Wykreślić intensywność fluorescencji HPC* w GUV, IHPC*,GUV W PORÓWNANIU Z φHPC*. Dopasowanie daje stałą kalibracji A, podaną przezφ HPC* = AIHPC*,GUV. A zależy od ustawień mikroskopii, takich jak moc lasera i czułość detektora (tj. wzmocnienie), dlatego zapisz A dla różnych powszechnie używanych ustawień mikroskopii (patrz przykład w Rysunek 3).
    4. Przygotować kilka roztworów HPC* rozpuszczonych w detergencie, np. dodecylosiarczanu sodu (SDS), o różnych stężeniach w zakresie od ~ 1 do 10-50 μM. Zapisać intensywność fluorescencji każdego roztworu luzem i obliczyć nachylenie intensywności w stosunku do stężenia (Rysunek 3). Powtórz pomiar z fluoroforem, który będzie sprzężony z białkiem w podobnym zakresie stężeń (patrz przykład z Alexa488 w Rysunek 3). Pomiar ten jest wymagany w celu powiązania intensywności fluorescencji znacznika białka i znacznika lipidowego, IA488, luzem / IHPC*, luzem, ponieważ niekoniecznie muszą one emitować w ten sam sposób przy tym samym stężeniu objętościowym.
    5. Zmierz liczbę fluoroforów na cząsteczkę białka za pomocą fluorospektrometru. Na przykład w przypadku Alexa488 liczbę cząsteczek Alexa488 na białko, nA488, można obliczyć przy użyciu następującej zależności:
      nA488 = (A494/εA488)/((A280 - 0,11A494) / εprot)
      gdzie A494 i A280 są wartościami absorbancji na jednostkę długości odpowiednio przy 494 nm i 280 nm, a εA488 i εprot są współczynnikami absorpcji molekularnej odpowiednio Alexa488 i białka.
    6. Oblicz gęstość powierzchniową białka na GUV, φprot, GUV, zgodnie z następującym wzorem:
      figure-protocol-3
      Należy pamiętać o stanie polimeryzacji białka. Na przykład białka BAR dimeryzują, dlatego obliczona gęstość będzie równa gęstości monomeru BAR na obszar, jeśli stosuje się współczynnik ekstynkcji formy monomerycznej.

figure-protocol-4
Rysunek 3: Przykład kalibracji gęstości powierzchni białka. Mierzona jest intensywność fluorescencji lipidów HPC* luzem (po lewej) i w GUV (w środku). Mierzona jest również intensywność fluorescencji objętościowej Alexa488 (powiązanej z domeną BAR) (po prawej). Intensywność fluorescencji skaluje się liniowo wraz ze stężeniem. Pokazane pomiary dotyczą określonego wzmocnienia detekcji i mocy wyjściowej lasera. Wykresy wygenerowane na podstawie danych z reference37. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperyment z ciągnięciem rurki może dostarczyć istotnych informacji mechanicznych na temat membrany. W przypadku braku białek lub innych cząsteczek, które łączą się z krzywizną błony, siła błony i promień rurki mogą być powiązane z napięciem błony, stosując równanie Hamiltona Canhama-Helfricha do rurki wyciągniętej z GUV50,51

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda wyciągania rurek z GUV dostarcza bogatych informacji na temat układu błona-białko, ponieważ jest nie tylko środkiem do pomiaru podstawowych właściwości mechanicznych błony, ale także pomaga rzucić światło na sprzężenie między białkami a krzywizną błony. Jak omówiono we wprowadzeniu, istnieją inne techniki pomiaru wpływu białek zakrzywiających błonę, albo poprzez inkubację białek z submikronowymi liposomami przywiązanymi do pasywowanej powierzchni 18,19, al...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Benoit Sorre, Damienowi Cuvelierowi, Pierre'owi Nassoyowi, François Quemeneurowi i Gilowi Toombesowi za ich istotny wkład w wprowadzenie metody nanorurkowej w grupie. Grupa P.B. należy do konsorcjum CNRS CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) oraz Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai została sfinansowana ze stypendium EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1527-2014) i działań Marie Curie (H2020-MSCA-IF-2014, projekt membrane-ezrin-actin). M.S. jest młodszym członkiem Simons Society of Fellows.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-Dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina (DOPC)Avanti850375Przykład lipidu użytego w danych do rysunku 3
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-[biotynyl(glikol polietylenowy)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotyna]Avanti880129biotynylowany lipid
BODIPY-TR-C5-ceramidSondy molekularne (ThermoFisher)D7540fluorescencyjny lipid
BODIPY- FLC5-heksadekanoylocholina fosfatydylocholina (HPC*)Sondy molekularne (ThermoFisher)fluorescencyjny lipid do kalibracji gęstości białka
jajko L-&alfa;-fosfatydylocholina (eggPC)Avanti840051służy do kalibracji stałej promienia probówki
β-kazeiny z mleka krowiego (>99%)Sigma AldrichC6905służy do pasywacji mikropipety i komora doświadczalna
SacharozaSigma AldrichS7903
D(+) glukozaSigma AldrichG7021
NaClSigma AldrichS7653
TrisSigma Aldrich10708976001
osmometrLosern/a
Pt-wires, średnica 0,5 mm, czystość 99,99%Goodfellow, USAPT005139używany do
nie dotyczysłuży do wytwarzania prądu dla
szpachlówkiVitrex (z CML Francja)CRIT 140013używany do uszczelniania kąpieli w komorze elektroformacji
sonikatornie jest przydatnydo czyszczenia komory elektroformacji, ale nie jest kluczowy
Mikroskop odwrócony TE2000 firmy Nikon, system konfokalny eC1 (Nikon), z dwiema liniami laserowymi (λ = 488 nm i 543 nm); pęseta optyczna indukowana laserem o długości fali ciągłej z włókna iterbowego o mocy 5 W (λ > 1070 nm; IPG GmBH Niemcy)przykład systemu mikroskopii konfokalnej wyposażonego w pęsetę optyczną
mikromanipulatoryn/a
kapilary borokrzemianowe (o promieniach wewnętrznych i zewnętrznych odpowiednio 0,78 mm i 1 mm)Ściągacz30-0036
Sutter InstrumentP-2100
microforgeNarishigeMF-800
Physik Instrumentebrak
koralików pokrytych streptawidyną z polistyrenu (średnica 3,2 i mikro; m)SpherotechSVP-30-5
generatora funkcji elektroformacji GUV galwanicznej GUV , do mikropipet Harvard Siłownik piezoelektryczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
  3. Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16 (10), 493-498 (2006).
  4. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37 (12), 526-533 (2012).
  5. Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30 (17), 3501-3515 (2011).
  6. Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68 (24), 3983-3993 (2011).
  7. Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25 (12), 780-792 (2015).
  8. Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2 (1), 91-117 (2012).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
  10. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  11. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  12. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  13. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  14. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281(2015).
  15. Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39 (1), 71-81 (1982).
  16. Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39 (1), 83-89 (1982).
  17. Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
  18. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  19. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  20. Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974(2015).
  21. Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109 (2), 298-307 (2015).
  22. Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88 (4), 2714-2726 (2005).
  23. Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88 (23), 238101(2002).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 173-178 (2012).
  26. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  27. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  28. Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132 (4), 1200-1201 (2010).
  29. Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55 (3), 509-517 (1989).
  30. Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19 (3), 575-584 (2003).
  31. Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64 (6), 837(2003).
  32. Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102 (8), 1837-1845 (2012).
  33. Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565(2013).
  34. Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9 (12), e115357(2014).
  35. Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  36. Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. , (2015).
  37. Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  38. Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93 (15), 158104(2004).
  39. Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151 (3), 619-629 (2012).
  40. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  41. Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170 (1), 172-184 (2017).
  42. Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11 (25), 5030-5036 (2015).
  43. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  44. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  45. Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (28), 282001(2014).
  46. Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
  47. Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. , University of Southern Denmark. (2011).
  48. Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94 (6), 068101(2005).
  49. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35 (3), 637-652 (1981).
  50. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28 (11), 693-703 (1973).
  51. Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26 (1), 61-81 (1970).
  52. Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3 (1), 204-210 (1984).
  53. Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47 (3), 507-516 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

P seta optycznaaspiracja mikropipetmikroskopia konfokalnakrzywizna b onywi zanie bia eksztywno zginaniaintensywno fluorescencjikuleczki streptawidyny

Powiązane artykuły