Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56089

⸱

13 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Miami, 2Department of Medicine, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół wizualizacji egzocytozy insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą pHluoryny, wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji. Izolowane wysepki są zakażone adenowirusem kodującym pHluorynę sprzężoną z neuropeptydem Y ładunku pęcherzyka. Pozwala to na wykrycie zdarzeń fuzji granulek insuliny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Wydzielanie insuliny odgrywa kluczową rolę w homeostazie glukozy w normalnych warunkach fizjologicznych, jak również w chorobie. Obecne podejścia do badania egzocytozy granulek insuliny wykorzystują elektrofizjologię lub mikroskopię sprzężoną z ekspresją reporterów fluorescencyjnych. Jednak większość z tych technik została zoptymalizowana pod kątem klonalnych linii komórkowych lub wymaga dysocjacji wysp trzustkowych. Natomiast przedstawiona tutaj metoda pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych wyspach trzustkowych. W tym protokole najpierw opisujemy infekcję wirusową izolowanych wysp trzustkowych adenowirusem, który koduje wrażliwe na pH białko zielonej fluorescencji (GFP), pHluorynę, sprzężone z neuropeptydem Y (NPY). Po drugie, opisujemy obrazowanie konfokalne wysp trzustkowych pięć dni po infekcji wirusowej i sposób monitorowania wydzielania granulek insuliny. Krótko mówiąc, zainfekowane wyspy trzustkowe umieszcza się na szkiełku nakrywkowym w komorze obrazowania i obrazuje pod pionowym laserowym mikroskopem konfokalnym, podczas gdy są one stale perfundowane roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym różne bodźce. Obrazy konfokalne obejmujące wysepkę o wielkości 50 μm są rejestrowane jako nagrania poklatkowe za pomocą szybko rezonansowego skanera. Fuzję granulek insuliny z błoną plazmatyczną można obserwować w miarę upływu czasu. Procedura ta pozwala również na przetestowanie baterii bodźców w jednym eksperymencie, jest kompatybilna zarówno z mysimi, jak i ludzkimi wyspami trzustkowymi i może być łączona z różnymi barwnikami do obrazowania funkcjonalnego (np. potencjałem błonowym lub cytozolowymi barwnikami wapniowymi).

Wprowadzenie

Insulina jest wytwarzana przez komórki beta wyspy trzustkowej i jest kluczowym regulatorem metabolizmu glukozy1. Śmierć lub dysfunkcja komórek beta zaburza homeostazę glukozy i prowadzi do cukrzycy2. Insulina jest upakowana w gęste granulki, które są uwalniane w sposób zależny odCa2+3. Wyjaśnienie, w jaki sposób regulowana jest egzocytoza granulek insuliny, jest niezbędne, aby w pełni zrozumieć, co decyduje o wydzielaniu insuliny i otwiera nowe możliwości identyfikacji nowych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy.

Egzocytoza insuliny była intensywnie badana przy użyciu metod elektrofizjologicznych, takich jak pomiary pojemności błony oraz podejścia mikroskopowe w połączeniu z cząsteczkami fluorescencyjnymi. Pomiary pojemności membrany mają dobrą rozdzielczość czasową i umożliwiają zapisy pojedynczych komórek. Jednak zmiany pojemności odzwierciedlają zmianę powierzchni netto komórki i nie wychwytują poszczególnych zdarzeń fuzji ani nie odróżniają fuzji granulek insuliny od innych pęcherzyków wydzielniczych insuliny3. Podejścia mikroskopowe, takie jak mikroskopia dwufotonowa lub mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) w połączeniu z sondami fluorescencyjnymi i białkami pęcherzykowymi, dostarczają dodatkowych szczegółów. Techniki te rejestrują pojedyncze zdarzenia egzocytotyczne, a także etapy przed- i po-egzocytotyczne i mogą być używane do badania wzorców egzocytotycznych w populacjach komórek3.

Reportery fluorescencyjne mogą być trzech typów: 1) pozakomórkowe, 2) cytoplazmatyczne lub 3) pęcherzykowe. 1) Reportery zewnątrzkomórkowe to znaczniki polarne (np. dektrans, sulforodamina B (SRB), żółcień lucyferowa, piranina), które mogą być wprowadzane przez środowisko zewnątrzkomórkowe4. Zastosowanie znaczników polarnych pozwala na badanie porów fuzyjnych w populacji komórek i wychwytuje różne struktury międzykomórkowe, takie jak naczynia krwionośne. Nie informują jednak o zachowaniu ładunku pęcherzykowego. 2) Reportery cytoplazmatyczne to sondy fluorescencyjne sprzężone z białkami związanymi z błoną, które są skierowane w stronę cytoplazmy i biorą udział w dokowaniu i egzocytozie. Przykłady obejmują członków rodziny rozpuszczalnych receptorów białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE), które zostały z powodzeniem wykorzystane w neurobiologii do badania uwalniania neuroprzekaźników5. Takie białka mają wielu partnerów wiążących i nie są specyficzne dla granulek insuliny. 3) Reportery pęcherzykowe to sondy fluorescencyjne połączone z pęcherzykowymi białkami ładunkowymi, które pozwalają na badanie zachowania pęcherzyków specyficznych dla ładunku. Białka ładunkowe specyficzne dla granulek insuliny obejmują między innymi insulinę, peptyd c, polipeptyd amyloidowy wysp trzustkowych i NPY6,7. NPY występuje tylko w granulkach zawierających insulinę i jest uwalniany jednocześnie z insuliną, co czyni go doskonałym partnerem dla fluorescencyjnego reportera8.

Fuzja różnych białek fluorescencyjnych z NPY została wcześniej wykorzystana do badania różnych aspektów egzocytozy w komórkach neuroendokrynnych, takich jak wymagania specyficznych izoform synaptotagminy9,10 i jak czas uwalniania zależy od cytoszkieletu aktynowego i od miozyny II11,12. W tym badaniu wybraliśmy pHluorin jako fluorescencyjny reporter, który jest zmodyfikowanym GFP, który jest niefluorescencyjny w kwaśnym pH wewnątrz gęstych granulek rdzeniowych, ale staje się jasno fluorescencyjny po wystawieniu na obojętne zewnątrzkomórkowe pH 13. Dojrzałe granulki insuliny mają kwaśne pH poniżej 5,5. Gdy granulka połączy się z błoną plazmatyczną i otworzy się, jej ładunek jest wystawiany na działanie neutralnego zewnątrzkomórkowego pH 7,4, co pozwala na użycie wrażliwych na pH białek pHluorin jako reportera7,14.

Ze względu na wrażliwy na pH charakter pHluorin i selektywną ekspresję NPY w granulkach insuliny, konstrukt fuzji NPY-pHluorin może być używany do badania różnych właściwości egzocytozy granulek insuliny. Wirusowe dostarczanie konstruktu fuzyjnego zapewnia wysoką wydajność transfekcji i działa na pierwotne komórki beta lub linie komórkowe, a także na izolowane wyspy trzustkowe. Metoda ta może być również stosowana jako wskazówka do badania egzocytozy w dowolnym innym typie komórek z pęcherzykami zawierającymi NPY. Można go również połączyć z dowolnym transgenicznym modelem myszy w celu zbadania wpływu niektórych stanów (knockdowns, nadekspresja itp.) na egzocytozę. Technika ta była wcześniej używana do charakteryzowania przestrzennych i czasowych wzorców wydzielania granulek insuliny w populacjach komórek beta w ludzkich wyspach trzustkowych15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komisja etyki zwierząt Uniwersytetu w Miami zatwierdziła wszystkie eksperymenty.

1. Wirusowa infekcja nienaruszonych izolowanych ludzkich lub mysich wysp trzustkowych

  1. Hodowla wysp trzustkowych: przygotuj pożywkę do hodowli wysp trzustkowych: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS i 2 mM L-glutamina.
    1. Ludzkie wyspy trzustkowe uzyskuje się ze Zintegrowanego Programu Dystrybucji Wysp Trzustkowych (NIDDK, NIH). Po przybyciu przenieść wysepki (~ 500 ekwiwalentów wysp) na 35-milimetrowe szalki Petriego poddane działaniu kultur nietkankowych z 2 ml pożywki hodowlanej CMRL w temperaturze 37 °C, 5%/95% CO2/O2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową.
    2. Mysie wyspy trzustkowe można wyizolować zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami16. Po izolacji, hodowla ~ 200 ekwiwalentów wysepek w 35-milimetrowej kulturze nietkankowej traktowana szalki Petriego 2 ml pożywki hodowlanej CMRL w temperaturze 37 °C, 5%/95% CO2/O2 przez 24 godziny przed infekcją wirusową.
      UWAGA: Unikaj używania myszy transgenicznych z reporterami GFP lub YFP ulegającymi ekspresji na wysepkach, aby uniknąć nakładania się fluorescencji z NPY-pHluorin.
  2. Przygotowanie wirusa
    UWAGA: Fuzja NPY-pHluorin została sklonowana do pcDNA3 vector10 i podklonowana do wektora adenowirusowego do produkcji adenowirusa [adenowirus serotyp 5 (DE1/E3)] przez firmę produkującą rekombinowane adenowirusy. Wirus podawano na porcję i przechowywano w temperaturze -80 °C. Zapas wirusa jest dostarczany przez firmę przy mianach 1012 do 1013 cząstek wirusa (~ 3 x 1010 - 3 x 1011 PFU).
    1. W przypadku zakażenia wysp trzustkowych in vitro należy użyć 106 PFU/ml, co daje przybliżoną wielokrotność infekcji (MOI) około 2 (szczegóły w Dyskusji)
  3. Zakażenie wirusowe wysp trzustkowych
    Uwaga: Praca z adenowirusami wymaga procedur i certyfikacji na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Skontaktuj się z Instytucjonalnym Inspektorem ds. Bezpieczeństwa Biologicznego, aby uzyskać wskazówki i szkolenie w zakresie procedur BSL2.
    1. Przygotuj wysepki człowiek/mysz zgodnie z powyższym opisem.
    2. Dodać 5 - 10 μl podstawowego wirusa do każdej 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej wysepki ludzko-mysie w 2 ml pożywki hodowlanej CMRL (z 10% FBS i 2 mM L-glutaminą).
      UWAGA: Dostosuj głośność używanego wirusa zgodnie z mianem wirusa zgodnie z arkuszem danych firmy.
    3. Hodować wysepki w pożywkach zawierających wirusa w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 godziny.
    4. Po 24 godzinach odessać pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją 2 ml pożywki hodowlanej CMRL (z 10% FBS i 2 mM L-Glutaminy).
    5. Hodować wysepki przez 4 - 6 dni w temperaturze 37 °C/5% CO2 , wymieniając pożywkę co 3 dni.
    6. Po 4-6 dniach hodowli spodziewaj się, że około 30% komórek wysp trzustkowych zostanie zainfekowanych. Wysepki mogą być następnie wykorzystywane do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.

2. Obrazowanie konfokalne zakażonych wysp trzustkowych

UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby dowiedzieć się, jakie materiały i sprzęt są wymagane do obrazowania konfokalnego.

  1. Przygotowanie odczynnika i konfiguracja eksperymentalna
    1. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy: dodać 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, sterylne przefiltrowane.
      UWAGA: Ten bufor jest zwykle przygotowywany bez glukozy i może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Glukoza jest dodawana w dniu eksperymentu, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe.
      1. Przygotować podłoże z glukozą podstawową (3 mM): dodać 75 μl 2 M bulionu glukozowego do 50 ml roztworu zewnątrzkomórkowego.
      2. Podłoże hiperglikemiczne (16 mM): dodać 400 μl 2 M bulionu glukozy do 50 ml roztworu zewnątrzkomórkowego
    2. Rozcieńczyć wszelkie dodatkowe bodźce (np. KCl lub adenozynotrifosforan (ATP)) w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy.
    3. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wstępnie potraktować szkiełka nakrywkowe poli-D-lizyną, dodając 30 μl roztworu poli-D-lizyny (1 mg/ml) do szkiełka nakrywkowego przez 1 godzinę i dokładnie spłukując je H2O.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
    4. Co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem, za pomocą pipety o pojemności 1 ml, przenieś wysepki na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór zewnątrzkomórkowy z 3 mM glukozy. Utrzymuj wysepki w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: W razie potrzeby błonę plazmatyczną można oznaczyć na tym etapie. Aby oznaczyć błonę plazmatyczną, dodaj 2 μM barwnika di-8-ANEPP do roztworu zewnątrzkomórkowego z 3 mM glukozy. Inkubować wysepki w roztworze barwnika przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Barwnik błony plazmatycznej może być wzbudzony przy 488 nm i wykryty przy 620 nm.
    5. Minimum przed rozpoczęciem eksperymentu przymocuj szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania, uszczelniając je próżniowym smarem silikonowym. Przymocuj komorę obrazowania do platformy obrazowania. Za pomocą pipety umieść 20 - 30 wysepek na obszarze szkiełka nakrywkowego poddanym działaniu poli-D-lizyny i pozwól wysepkom przylegać do powierzchni przez 20 min.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć uszkodzenia wysepek.
    6. Gdy wysepki przylegają do szkiełka nakrywkowego, przygotuj system perfuzyjny, dokładnie spłukując go wodą. Dodaj każdy roztwór do innego kanału: 3 mM glukozy (kanał 1), 16 mM glukozy (kanał 2), 16 mM glukozy ze 100 μM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 10 μM forskoliny (kanał 3), 25 mM KCl w 3 mM glukozy (kanał 4), 10 μM ATP w 3 mM glukozy (kanał 5). Usuń wszystkie pęcherzyki z systemu, otwierając każdy kanał osobno i pozwalając roztworowi płynąć przez kilka minut, a następnie upewnij się, że przepływ jest stały (0,5 ml/min), a rurka nie przecieka.
    7. Podłączyć pojedynczą grzałkę roztworu liniowego do rurki wylotowej perfuzji i dostosować temperaturę wypływającego buforu do 37 °C.
    8. Przygotuj pompę ssącą. Usuń wszystkie pęcherzyki z systemu i upewnij się, że przepływ jest stały, a rurka nie przecieka.
    9. Gdy wysepki przylegają do powierzchni szkiełka nakrywkowego, delikatnie napełnij komorę obrazowania roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy. Unikać zmywania wysepek z powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    10. Umieść platformę obrazowania z wyspami trzustkowymi na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu perfuzyjnego i pompy ssącej.
    11. Włącz przepływ i stale wykonuj wysepki za pomocą roztworu zewnątrzkomórkowego 3G. System jest teraz gotowy do obrazowania konfokalnego.
  2. Obrazowanie konfokalne
    1. Zlokalizuj wysepki w polu mikroskopu przy mniejszym powiększeniu. Po ustawieniu ostrości na wysepkach przełącz się na obiektywy o większym powiększeniu (np. obiektyw 63X zanurzony w wodzie (63X/0,9 NA)).
    2. Otwórz akwizycję za pomocą oprogramowania (Tabela materiałów) i aktywuj tryb skanera rezonansowego.
    3. Wybierz tryb obrazowania XYZT i skonfiguruj ustawienia akwizycji w następujący sposób:
      1. Włącz laser argonowy i linię laserową 488 nm i dostosuj moc lasera do 50% w celu wzbudzenia pHluorin.
      2. Zbierać emisję przy 505 - 555 nm.
      3. Wybierz rozdzielczość 512 x 512 pikseli. Naciśnij przycisk "Live", aby rozpocząć obrazowanie i dostosować poziomy wzmocnienia (typowe wzmocnienie wynosi około 600 V).
      4. Ustaw początek i koniec stosu z: skup się na szczycie wysepki i wybierz "początek" i przejdź do ostatniej płaszczyzny, na której można ustawić ostrość i wybierz "koniec". Użyj kroku Z o rozmiarze 5 μm. Oprogramowanie automatycznie obliczy liczbę płaszczyzn konfokalnych.
      5. Ustaw przedział czasowy akwizycji każdego stosu z blisko 1,5 - 2 s i wybierz opcję "Pobieraj do zatrzymania" dla ciągłego obrazowania.
      6. Naciśnij przycisk "start", aby zainicjować.
    4. Stosuj różne protokoły stymulacji, aby wywołać egzocytozę ziarnistości poprzez perfuzję wysp trzustkowych z pożądanymi bodźcami. Protokoły stymulacji można dostosować do pożądanego celu naukowego (patrz poniżej).
  3. Protokoły stymulacji
    UWAGA: W każdym protokole stymulacji zacznij od zarejestrowania co najmniej 2 minut aktywności tła wysp trzustkowych podczas ciągłej perfuzji roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy. Perfuzja ze stymulantem przez żądany okres czasu. Kolejność stymulantów, czas trwania stymulacji, a także czas trwania nagrań można dostosować do pożądanych celów naukowych. Pamiętaj, aby dokładnie umyć wyspy trzustkowe roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mM glukozy przed rozpoczęciem nowej stymulacji. Poniżej znajdują się przykładowe protokoły stymulacji, które zostały wykorzystane do zademonstrowania możliwości metody.
    1. Stymulacja chlorkiem amonu (NH4Cl) jako pozytywna kontrola wrażliwości pH pHluorin i skuteczności infekcji wirusowych (Rysunek 3): 3 mM glukozy (2 min) → 50 mM NH4Cl (2 min) w 3 mM glukozy → 3 mM glukozy (2 min)
      UWAGA: W roztworze NH4Cl zastąpić NaCl na zasadzie równomolowej.
    2. Stymuluj egzocytozę granulek insuliny poprzez zwiększenie stężenia glukozy (Rysunek 5 i Rysunek 6): 3 mM glukozy (2 min) → 16 mM glukozy (15-30 min) → 3 mM glukozy (2 min
      UWAGA: Aby zobaczyć kilka wybuchów aktywności, wysepki należy wysysać roztworem 16G w sposób ciągły przez co najmniej 15 minut.
      UWAGA: W celu zwiększenia spójności odpowiedzi wydzielniczych17, użytkownicy mogą dodawać środki podnoszące cAMP (100 μM IBMX i 10 μM forskoliny) zarówno do roztworów 3G, jak i 16G. Nie zmienia to czasowych wzorców wydzielania granulek. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz15 i Dyskusja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cały przebieg tej techniki przedstawiono na Rysunku 1. W skrócie, wyspy trzustkowe myszy lub człowieka można zainfekować adenowirusem kodującym NPY-pHluorin, a po kilku dniach hodowli obrazować pod mikroskopem konfokalnym. W momencie fuzji ziarnistości z błoną plazmatyczną i ich otwarcia obserwuje się wzrost fluorescencji, który można poddać kwantyfikacji (Rysunek 1). Aby ustalić, czy NPY-pHluorin jest rzeczywiście odpowiednim na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Manuskrypt ten opisuje technikę, którą można wykorzystać do wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w komórkach beta w nienaruszonych wyspach trzustkowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wykorzystuje NPY-pHluorin jako fluorescencyjny reporter sklonowany do adenowirusa, aby zapewnić wysoką wydajność transfekcji.

Chociaż metoda była bardzo skuteczna w naszych rękach, może wymagać pewnych modyfikacji, które zależą przede wszystkim od dwóch parametrów: 1) jakości przygotowania wysp trzustkowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Marci Boulinie z głównego ośrodka obrazowania DRI za pomoc przy mikroskopach. Prace te były wspierane przez granty NIH 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 i R56 DK084321 (AC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pionowy laserowo-skaningowy mikroskop konfokalnyLeica Microsystems, Wetzlar, NiemcyTCS-SP5zawiera LAS AF, oprogramowanie do akwizycji obrazu
Komora obrazowaniaInstrumenty WarnerRC-26
Platforma komory obrazowaniaInstrumenty Warner Szkiełkaszklane PH-1
22 x 40DaiggerbrandG15972H
Vacuum smar silikonowySigmaZ273554-1EA
Wielokanałowy system perfuzyjnyWarner instrumentsVC-8
Pojedyncza grzałka roztworuinline Warner instrumentsSH-27B
Regulator temperaturyWarner instrumentsTC-324C
Perystaltyczna pompa ssącaPharmaciaP-1
35 mm szalka Petriego, VWR10861-586
CMRL Medium, bez glutaminyThermoFisher11530037
FBS, inaktywowany termicznieThermoFisher16140071
L-Glutamina 200 mMThermoFisher25030081
5 M roztwór NaClSigmaS5150
3 M roztwór KClSigma60135
1 M CaCl2 roztwórSigma21115
1 M MgCl2 roztwórSigmaM1028
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153
1 M roztwór HEPESSigmaH0887
Filtr próżniowyVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917
nakrywkowe

Bibliografia

  1. Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
  2. Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
  3. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  4. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
  5. Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
  6. Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
  7. Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
  8. Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478(2011).
  9. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  10. Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
  11. Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
  12. Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
  13. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  14. Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).
  15. Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
  16. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632(2015).
  17. Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
  20. Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
  21. Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
  22. Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  25. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnareporter NPY pHluorinwysepki trzustkoweinfekcja wirusowastymulacja glukozobrazowanie time lapsewzbudzenie fluorescencjiakwizycja stosu Z Z stackobrazowanie funkcjonalne
Obrazowanie konfokalne neuropeptydu Y-pHluorin: technika wizualizacji egzocytozy granulek insuliny w nienaruszonych mysich i ludzkich wyspach trzustkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.