Artykuł metodologiczny

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

DOI:

10.3791/56090

⸱

27 września 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hongqiao International Institute of Medical Research, Tongren Hospital and Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowa funkcja czuciowa leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit. Przedstawiono protokół elektrofizjologicznego zapisu nerwów doprowadzających okrężnicy w preparacie ex vivo jelita grubego szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja nerwów czuciowych okrężnicy jest wpisana w patofizjologię kilku powszechnych schorzeń, w tym funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit oraz cukrzycy. W tym miejscu opisujemy protokół charakterystyki in vitro właściwości elektrofizjologicznych aferentów okrężnicy u szczurów. Jelito grube, z przyczepionym nienaruszonym ganglionem miednicy (PG), jest usuwane ze szczura; przekrwiony karbogenicznym roztworem Krebsa w komorze zapisu; i kaniulowane na końcach ustnych i odbytowych, aby umożliwić rozdęcie. Identyfikowana jest cienka wiązka nerwowa wychodząca z PG, a wielojednostkowa aktywność nerwu doprowadzającego jest rejestrowana za pomocą elektrody ssącej. Rozdęcie odcinka okrężnicy powoduje stopniowy wzrost wydzieliny wielojednostkowej. Analizę głównych składowych przeprowadza się w celu rozróżnienia włókien aferentnych o niskim progu, wysokim progu i szerokim zakresie dynamiki. Wrażliwość chemiczną aferentów okrężnicy można badać poprzez kąpiel lub doświetlne podawanie badanych związków. Protokół ten można zmodyfikować w celu zastosowania do innych gatunków, takich jak myszy i świnki morskie, oraz do badania różnic we właściwościach elektrofizjologicznych piersiowo-lędźwiowych/podbrzusznych i lędźwiowo-krzyżowych/miednicznych doprowadzaczy okrężnicy zstępującej w warunkach normalnych i patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewód pokarmowy (GIT) jest bogato unerwiony zewnętrznymi nerwami doprowadzającymi, które przekazują sygnały czuciowe z jelit do ośrodkowego układu nerwowego i które przyczyniają się do interakcji jelito-mózg. Zmieniona pobudliwość tych zewnętrznych aferentów, jak również zmienione centralne przetwarzanie wejść aferentnych, leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów chorób przewodu pokarmowego, w tym funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit1. Informacje sensoryczne z jelita grubego są przekazywane głównie przez nerwy piersiowo-lędźwiowe/podbrzuszne i lędźwiowo-krzyżowe/miedniczne (PN)2. Wzrosło zainteresowanie badaniem właściwości elektrofizjologicznych tych pierwotnych włókien doprowadzających w modelach chorób gryzoni. Jednak zapisy elektrofizjologiczne in vivo aferentów okrężnicy u gryzoni stanowią wyzwanie techniczne i wymagają znacznych umiejętności chirurgicznych. Ponadto zmiany hemodynamiczne, ruch tkanek i środki znieczulające mogą również wpływać na aktywność nerwów i wrażliwość na bodźce testowe in vivo. Dlatego w ostatnich latach w coraz większej liczbie badań stosuje się preparaty in vitro (ex vivo) różnych gatunków, w tym myszy, szczurów, świnek morskich i ludzi, w celu zbadania mechanizmów transdukcji czuciowej w okrężnicy aferentnej i zmienionej pobudliwości w stanach chorobowych. 3,4,5,6,7,8

Przede wszystkim zgłoszono dwa rodzaje przygotowania okrężnicy ex vivo: przygotowanie "płaskiego arkusza"5,9,10 oraz przygotowanie "tuby"3,4. Wcześniej opublikowano protokół wideo dotyczący preparatu mysiego jelita grubego z "płaskim arkuszem"11. W tym protokole jelito grube myszy z przyczepionymi PN) lub nerwami lędźwiowymi (LSN) jest zbierane i superfuzjowane w komorze tkankowej. Jelito grube jest rozcinane wzdłużnie, a pęczek nerwowy jest przedłużany do komory zapisu wypełnionej olejem parafinowym. Aktywność nerwów rejestrowana jest za pomocą monopolarnej elektrody platynowo-irydowej. Protokół pozwala na identyfikację pól recepcyjnych poszczególnych włókien doprowadzających za pomocą bezstronnej stymulacji elektrycznej. Lokalizuje zastosowanie bodźców chemicznych, a także zastosowanie różnych paradygmatów stymulacji mechanicznej (np. ogniskowe sondowanie błony śluzowej i rozciąganie obwodowe) do zakończeń nerwowych doprowadzających. Ponieważ nerw musi być przedłużony do oddzielnej komory od komory tkankowej, bardzo ważne jest, aby przyczepiony nerw był stosunkowo długi; Udana sekcja nerwów stanowi wyzwanie dla tych, którzy dopiero zaczynają przygodę z tą metodologią. Niedawno Nullens i wsp. opublikowali protokół wideo do rejestracji in vitro krezkowych aferentów w mysich segmentach jelita czczego i okrężnicy12. W tym preparacie "rurkowym" segment jelita z przyczepioną krezką pozostaje nienaruszony, co pozwala na stopniowe rozdęcie oraz do- i pozaświetlne podawanie różnych substancji chemicznych. Ponieważ nerw krezkowy jest rejestrowany za pomocą elektrody ssącej, którą można umieścić blisko tkanki, aktywność aferentną można rejestrować, nawet jeśli nerw krezki jest stosunkowo krótki. Jednak nerw krezkowy składa się z mieszanych populacji włókien doprowadzających nerwu błędnego i rdzeniowego, które unerwiają jelito czcze lub podbrzusze piersiowo-lędźwiowe. Aferenty miedniczki lędźwiowo-krzyżowej unerwiają jelito grube, którego nie można dyskryminować w tym protokole. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół elektrofizjologicznego zapisu aferentów jelita grubego szczura za pomocą preparatu jelita grubego "rurkowego" z nienaruszonym PG. Metoda ta może pozwolić na scharakteryzowanie właściwości funkcjonalnych odcinka lędźwiowego splanchnicznego (hipożołądkowego) i lędźwiowo-krzyżowego doprowadzającego do miednicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju (# SYXK2013-0050). Sekcja jelita grubego z nienaruszonym ganglionem i pniem nerwowym zajmuje minimum 15 minut dla osoby dość doświadczonej w tej technice. W związku z tym konieczne jest utrzymanie zwierzęcia przy życiu, ale w głębokim znieczuleniu podczas wykonywania sekcji, aby zapewnić żywotność tkanki do późniejszego zapisu elektrofizjologicznego.

1. Przygotowanie roztworu perfuzyjnego i związków testowych

  1. Przygotuj 5 l roztworu Krebsa: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2 i 11,5 mM glukozy. Nasycić roztwór mieszaniną gazów o stężeniu 95%O2 + 5%CO2. Wstępnie schłodzić ~500 ml natlenionego Krebsa w lodówce.
  2. W razie potrzeby przygotować podwielokrotności podstawowych związków badanych (1 mM kapsaicyny w etanolu i 10 mM 5-hydroksytryptaminy (5-HT) w soli fizjologicznej). Rozcieńczyć wywar w roztworze Krebs (do kąpieli) i w soli fizjologicznej (do podawania doświetlnego) do końcowego stężenia tuż przed użyciem.

2. Przygotowanie elektrody rejestrującej

  1. Wyciągnij elektrodę rejestrującą ze standardowych szklanych rurek bez wewnętrznych żarników (średnica zewnętrzna 1,5 mm) za pomocą konwencjonalnego ściągacza elektrod. Dostosuj ustawienia ściągacza do ciepła i pociągnij tak, aby trzpień ciągniętych elektrod znajdował się między 20 a 25 mm.

3. Pobieranie tkanek

  1. Dokładnie znieczulić szczura za pomocą pentobarbitalu sodu (80 mg/kg, i.p.).  
  2. Zapewniając sterylność, należy odsłonić jamę brzuszną, wykonując nacięcie w linii środkowej ściany brzucha za pomocą skalpela. Odciągnij krezkę i inne tkanki na bok, aby odsłonić jelito grube.
  3. Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym. Poprzez staranną sekcję zlokalizuj lewy PG i zidentyfikuj PN i łączący go LSN. Przetnij te nerwy kilka milimetrów od PG.
    UWAGA: PG leży blisko połączenia jelita grubego. Zazwyczaj 3 - 4 PN od rdzenia kręgowego lędźwiowo-krzyżowego i projekt LSN do PG (Rysunek 1).
  4. Przetnij kość spojenia, aby odsłonić odbytnicę. Usuń tkanki (tj. pęcherz moczowy itp.) powyżej jelita grubego; uważaj, aby pozostawić PG nienaruszony.
  5. Złóż szczura w ofierze przez dożylne wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu. Przeciąć okrężnicę około 3 cm powyżej PG i usunąć jelito grube ze zwierzęcia za pomocą kleszczy.
  6. Przenieść jelito grube na szalkę Petriego wypełnioną wstępnie schłodzonym roztworem Krebsa. Usuń kał, delikatnie spłukując okrężnicę. Ostrożnie usuń resztki pęcherza moczowego i inne tkanki, nie naruszając PG.

4. Rozwarstwienie nerwów doprowadzających okrężnicy

  1. Umieścić okrężnicę w komorze rejestracyjnej (20 ml) i w sposób ciągły perfundować tkankę karbonogennym roztworem Krebsa. Ustaw szybkość perfuzji na 15 ml/min.
  2. Kanniulacja jelita grubego zarówno na końcu ustnym, jak i odbytowym. Rozpocząć infuzję doświetlną okrężnicy solą fizjologiczną z szybkością 10 ml/h w kierunku doustnym do odbytu.
  3. Zlokalizuj główny PG pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj szpilek przeciw owadom, aby odsłonić ganglion. Po dokładnym przeprowadzeniu sekcji znajdź delikatną gałąź nerwu wychodzącą ze zwoju i biegnącą w kierunku okrężnicy (Ryc. 1). Przetnij nerw w pobliżu ganglionu.
    UWAGA: Rysunek 1 ilustruje nagranie z gałęzi nerwowej dystalnej do PG. Nerw prawdopodobnie zawiera mieszaninę włókien doprowadzających miednicy i odcinka lędźwiowego splanchnicznego. Alternatywnie można dokonać zapisu z PN i/lub LSN proksymalnie do PG.
  4. Włączyć łaźnię grzewczą i podgrzać roztwór Krebsa, aby utrzymać temperaturę komory na poziomie 34 ± 0,5 °C.

5. Przygotowanie elektrody ssącej

  1. Weź wstępnie wyciągniętą szklaną pipetę (krok 2) i sprawdź ją pod mikroskopem preparacyjnym. Złamać końcówkę elektrody za pomocą kleszczy tak, aby miała rozmiar zgodny ze średnicą nerwu, który ma być rejestrowany.
  2. Skoś końcówkę, umieszczając ją w pobliżu jaśniejszego rozbłysku.

6. Zapis elektrofizjologiczny

  1. Podłącz skośną elektrodę do uchwytu elektrody. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do bocznego portu na uchwycie, aby wywrzeć podciśnienie lub nadciśnienie na elektrodzie.
  2. Podłącz uchwyt do stopnia głównego bioamplifier i zamontuj stopień główny na manipulatorze.
  3. Przenieś elektrodę do kąpieli tkankowej i napełnij elektrodę roztworem Krebsa, delikatnie odsysając, aż zetknie się ze srebrnym drutem uchwytu. Umieść końcówkę elektrody blisko przeciętego końca nerwu i zastosuj podciśnienie, aby zassać nerw do elektrody. Zastosuj większe podciśnienie, aby ~1 mm nerwu został wciągnięty do elektrody i utworzył szczelne uszczelnienie.
  4. Włącz biowzmacniacz i ustaw filtr na 300 - 3,000 Hz. Monitoruj sygnał na oscyloskopie i rejestruj sygnał nerwowy (częstotliwość próbkowania 20 kHz) oraz sygnał ciśnienia śródświetlnego (częstotliwość próbkowania 100 Hz) za pomocą komputera z oprogramowaniem do przetwarzania danych skokowych.

7. Testowanie wrażliwości jelita grubego na aferentne

  1. Zastosuj rampowe rozdęcie okrężnicy, zamykając trójkierunkowy kran na kaniuli wylotowej, jednocześnie stale wlewając się śródświetlnie. Monitoruj ciśnienie śródświetlne, aż osiągnie 60 mmHg, po czym otwórz trójdrożny kran na kaniuli drenującej.
  2. Powtarzaj tę procedurę w regularnych odstępach czasu 15 minut. Stosuj leki docelowo lub śródświetlnie, aby sprawdzić wrażliwość chemiczną nerwów doprowadzających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 to schematyczna ilustracja eksperymentalnej konfiguracji dla preparatu jelita grubego ex vivo "rurkowego", z reprezentatywnym zapisem od dystalnego nerwu do PG. Nerw prawdopodobnie zawierał mieszaninę aferentów splanchnicznych miednicy i odcinka lędźwiowego. W preparatach od normalnych szczurów nerwy doprowadzające okrężnicy mają zazwyczaj niski poziom nieregularnej spontanicznej aktywności. Rozdęcie rampy jelita grubego indukuje stopniowy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół jest stosunkowo prostą metodą eksperymentalną służącą do oceny właściwości elektrofizjologicznych okrężnicy aferentnej szczurów. Wykonanie protokołu (od wypreparowania tkanek do ustawienia zapisu nerwu) trwa zwykle około 2 godzin. Pobranie tkanki (krok 3) i przygotowanie elektrody ssącej (krok 5) są krytycznymi etapami. Bardzo ważne jest, aby móc zlokalizować PG, LSN i PN oraz uważać, aby nie uszkodzić zwoju i nerwów podczas rozwarstwiania tkanek. Końcówka szklanej pipety musi być złamana i ś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół był wspierany przez granty badawcze z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (#31171066, #81270464) oraz Chińsko-Niemieckiego Centrum Nauki (GZ919).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pentobarbital soduShanghai Westang Bio-TechB558
KapsaicynaSigmaM2028
Ściągacz elektrodMicroData Instrument IncPMP107
System neurologiczny (biowzmacniacz)Digitimer, LtdNeurolog System
Cambridge Electronic DesignMicro1401
Oprogramowanie do przetwarzania danychCambridge Electronic DesignSpike2 wersja 6
Srebrny drutWorld Precision InstrumentsEP12
Szklane rurkiWorld Precision Instruments1B150-4
Uchwyt elektrodyWorld Precision InstrumentsMEH3SBW
Łaźnia grzewczaGrantGR150
Mikroskop preparacyjnyLeica Zoom2000
Mikroskop preparacyjnyWorld Precision InstrumentsPZMIII-BS
ZapalniczkadowolnaNA
Narzędzia chirurgiczneWorld Precision InstrumentsNA
Szpilki do owadówdomowej roboty z drutu ze stali nierdzewnej 0,1 mmNA
ManipulatortrójdrożnyWorld Precision InstrumentsKITF-R
RatsAnyNAMożna użyć dowolnego szczepu/płci.
Konwerter analogowo-cyfrowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
  2. Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
  3. Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
  4. Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
  5. Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
  6. Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
  7. Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
  8. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  9. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
  10. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
  11. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  12. Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
  13. Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
  14. Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
  15. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  16. La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
  17. Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja zwoj w miednicznychelektroda ss ca do nerw wrozci ganie jelita grubegoanaliza g wnych sk adowychaktywno mechanosensorycznatesty wra liwo ci chemicznejrejestracja bioamplifikatorem

Powiązane artykuły