Artykuł metodologiczny

Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

DOI:

10.3791/56091

⸱

2 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinaza IκB 1/α (IKK1/α CHUK) to kinaza białkowa Ser/Thr, która bierze udział w niezliczonych aktywnościach komórkowych, głównie poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NF-κB. W tym miejscu opisujemy główne etapy niezbędne do produkcji i określenia struktury krystalicznej tego białka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klasa bodźców zewnątrzkomórkowych wymaga aktywacji IKK1/α w celu wywołania generacji podjednostki NF-κB, p52, poprzez przetwarzanie jej prekursora p100. p52 funkcjonuje jako homodimer lub heterodimer z inną podjednostką NF-κB, RelB. Te dimery z kolei regulują ekspresję setek genów zaangażowanych w stan zapalny, przeżycie komórek i cykl komórkowy. IKK1/α pozostaje przede wszystkim związany z IKK2/β i NEMO jako kompleks trójskładnikowy. Jednak niewielka jego pula jest również obserwowana jako kompleks (kompleksy) o niskiej masie cząsteczkowej. Nie wiadomo, czy aktywność przetwarzania p100 jest wyzwalana przez aktywację IKK1/α w większej czy mniejszej złożonej puli. Konstytutywną aktywność IKK1/α wykryto w wielu nowotworach i chorobach zapalnych. Aby zrozumieć mechanizm aktywacji IKK1 / α i umożliwić jego wykorzystanie jako celu leku, poddaliśmy ekspresji rekombinowanego IKK1 / α w różnych systemach gospodarza, takich jak E. coli, komórki owadów i ssaków. Udało nam się uzyskać ekspresję rozpuszczalnego IKK1 / α w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem, otrzymując mg ilości białka o wysokiej czystości, krystalizując je w obecności inhibitorów i określając jego strukturę krystaliczną promieniowania rentgenowskiego. Tutaj opisujemy szczegółowe etapy produkcji rekombinowanego białka, jego krystalizacji i określania struktury krystalicznej promieniowania rentgenowskiego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność transkrypcyjna rodziny dimerycznych czynników transkrypcyjnych NF-κB jest niezbędna do różnych funkcji komórkowych, począwszy od stanu zapalnego i odporności, a skończywszy na przetrwaniu i śmierci. Czynności te są ściśle kontrolowane w komórkach, a utrata regulacji prowadzi do różnych stanów patologicznych, w tym zaburzeń autoimmunologicznych i raka1,2,3. W przypadku braku bodźca, aktywność NF-κB jest hamowana przez białka IκB (Inhibitor -κB)4. Fosforylacja specyficznych reszt Ser na białkach IκB oznacza je pod kątem ubikwitynacji, a następnie degradacji proteasomalnej lub selektywnego przetwarzania5. Dwie wysoce homologiczne kinazy Ser/Thr, IKK2/β i IKK1/α, działają jako centralne regulatory aktywności NF-κB, przeprowadzając te zdarzenia fosforylacji6,7.

Interakcje między ligandem a receptorem przekazują sygnał przez szereg mediatorów, prowadząc do aktywacji czynników NF-κB. Proces sygnalizacji NF-κB można ogólnie podzielić na dwie odrębne ścieżki – kanoniczną i niekanoniczną (alternatywną)8. Aktywność IKK2/β przede wszystkim reguluje sygnalizację NF-κB szlaku kanonicznego, który jest niezbędny dla zapalnych i wrodzonych odpowiedzi immunologicznych9. Charakterystyczną cechą tego szlaku jest szybka i krótkotrwała aktywacja IKK2/β10 w obrębie dotychczas niescharakteryzowanego biochemicznie kompleksu IKK — przypuszczalnie składającego się z IKK1 i IKK2, a także składnika regulatorowego, NEMO (NF-κB Essential Modulator)11,12,13. Pomiędzy dwiema katalitycznymi podjednostkami IKK kompleksu IKK, IKK2 jest przede wszystkim odpowiedzialny14 za fosforylację specyficznych reszt prototypowych IκB (α, -β i -γ) związanych z NF-κB, a także nietypowego białka IκB, NF-κB1/p105, które jest prekursorem podjednostki NF-κB p505. Ubikwitynacja i proteasomalna degradacja IκB (lub przetwarzanie p105) wywołane fosforylacją prowadzą do uwolnienia i aktywacji określonego zestawu dimerów NF-κB15. Nieprawidłowa aktywność NF-κB spowodowana nieprawidłową funkcją IKK2 została zaobserwowana w wielu nowotworach, a także w zaburzeniach autoimmunologicznych2,3,16.

W przeciwieństwie do IKK2/β, aktywność IKK1/α reguluje sygnalizację NF-κB szlaku niekanonicznego, co jest niezbędne dla rozwoju i odporności. IKK1 fosforyluje specyficzne reszty NF-κB2/p100 na swoim C-końcowym segmencie IκBδ, co prowadzi do jego przetwarzania i wytwarzania p52. Tworzenie aktywnego transkrypcyjnie heterodimeru p52:RelB inicjuje powolną i trwałą odpowiedź na sygnały rozwojowe7,17,18,19,20. Co ciekawe, wytwarzanie centralnego czynnika NF-κB p52 tego szlaku jest krytycznie zależne od innego czynnika, kinazy indukującej NF-κB (NIK)21,22, ale nie od IKK2 lub NEMO. W komórkach w stanie spoczynku poziom NIK pozostaje niski ze względu na ciągłą degradację zależną od proteasomu23,24,25. Po stymulacji komórek przez "niekanoniczne" ligandy i w niektórych komórkach złośliwych NIK stabilizuje się w celu rekrutacji i aktywacji IKK1/α. Aktywność kinazy zarówno NIK, jak i IKK1 jest niezbędna do efektywnego przetwarzania p100 na p527. IKK1 i NIK fosforylują trzy seryny (Ser866, 870 i 872) NF-κB2/p100 na jego C-końcowym segmencie IκBδ, prowadząc do jego przetworzenia i wytworzenia p52. Nieprawidłowa aktywacja szlaku niekanonicznego jest związana z wieloma nowotworami złośliwymi, w tym ze szpiczakiem mnogim, 26,27,28.

Znanych jest kilka wysoce skutecznych i specyficznych inhibitorów IKK2/β, chociaż jak dotąd żaden z nich nie okazał się skutecznym lekiem. Natomiast inhibitory specyficzne dla IKK1/α są nieliczne. Może to częściowo wynikać z braku informacji strukturalnych i biochemicznych na temat IKK1/α, co ogranicza nasze zrozumienie mechanistycznych podstaw aktywacji NF-κB przez IKK1 w komórkach i racjonalnego projektowania leków. Struktury rentgenowskie IKK2/β dostarczyły nam wglądu w mechanizm aktywacji IKK2/β29; jednak struktury te nie mogły ujawnić, w jaki sposób różne bodźce poprzedzające wyzwalają aktywację IKK1/α lub IKK2/β w celu regulowania odrębnych zestawów aktywności NF-κB 30,31. Aby zrozumieć mechanistyczne podstawy leżące u podstaw odrębnej funkcji sygnalizacyjnej IKK1/α i stworzyć platformę do racjonalnego projektowania leków, skupiliśmy się na określeniu struktury IKK1/α.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie rekombinowanego wirusa odpowiedniego do ekspresji IKK1/α na dużą skalę

  1. Przygotowanie wirusa P132
    1. Dzień 1: Płytkie komórki Sf9 (~6 X 105) (numer pasażu mniejszy niż 10) w 2 ml pożywki z komórek owadów Sf900 III w każdym dołku płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 27 °C. Komórki pasażowe, gdy osiągną gęstość 2 do 3 X 106 komórek na ml w zawiesinie, rozcieńczając do świeżej pożywki o gęstości ~6 X 105.
    2. Dzień 2: Rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji Sf9 w 100 μl Sf900 III lub pożywki dla owadów Grace's bez antybiotyku i surowicy. Wiruj krótko.
    3. Rozcieńczyć 1 μg rekombinowanego bakmidu oczyszczonego z zestawu (szczegóły znajdują się w 'Reprezentatywnych wynikach')32 w kolejne 100 μl tego samego podłoża w oddzielnej probówce.
    4. Połączyć rozcieńczone DNA i odczynnik do transfekcji (całkowita objętość ~210-220 μL) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut.
    5. Usuń pożywkę ze studzienki. Dodaj 1 ml świeżej pożywki bez antybiotyku i surowicy.
    6. Dodawać rozcieńczoną mieszaninę odczynników do transfekcji DNA kroplami na komórki. Dostosuj wielkość kropli tak, aby nie usuwała przylegających komórek.
    7. Po ~6 godzinach dodaj 1,5 ml świeżej pożywki na wierzch lub usuń pożywkę i dodaj 2,5 ml świeżej pożywki. Podgrzej świeżą pożywkę do 25-27 °C przed dodaniem.
    8. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C. Sprawdzać studzienki okresowo co ~12 godzin pod kątem oznak infekcji wirusowej. Przeprowadzić całą konserwację i odciąg Sf9 w temperaturze 27 °C.
    9. Dzień 5: Wyjmij pożywkę zawierającą komórki 60-72 godziny po zakażeniu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Zachować supernatant; to jest zapas wirusa P1. Małe porcje zamrozić w temperaturze -80 °C.
  2. Wybór najlepiej eksprymującego się klonu wirusa P1.
    1. Płytki komórkowe podobnie jak opisano w kroku 1.1.
    2. Następnego dnia lub ~ 6 godzin po posiewie dodaj 20 μl i 50 μl różnych zapasów klonów wirusa P1 do komórek w różnych studzienkach.
      3. Usunąć
    3. przylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania i zebrać zainfekowane komórki 60-72 godziny po zakażeniu, wirując przez 5 minut w temperaturze 500 x g i 4 °C. Zachować supernatant. To jest zapas wirusa P2. Małe porcje wywaru przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Dodać 100 μl 2x buforu SDS Laemmli do zebranych komórek osadu. Podgrzewać w temperaturze >95 °C przez 10 min. Wirować (zwykle > 10 000 x g) przez 5 minut.
    5. Uruchom 10-15 μl każdej próbki na 8-10% SDS-PAGE przy 120-160 V, aż przód barwnika dotrze do dna żelu.
    6. Elektrotransferuj rozwiązane białka za pomocą standardowego protokołu transferu półsuchego (20 V, 30-45 min) na membranie nitrocelulozy/PVDF.
    7. Osusz przeciwciałem anty-IKK1 (rozcieńczenie ~1:2,000, musi być zoptymalizowane) lub przeciwciałem anty-PentaHis (rozcieńczenie ~1:3,000, musi być zoptymalizowane) w celu ekspresji.
    8. Wybierz najlepszy klon wirusa P1, porównując ekspresję rekombinowanego IKK1.
  3. Przygotowanie dużych zapasów wirusa P3.
    1. Płytki umieszcza się podobnie jak opisano w kroku 1.1 na 15-centymetrowej płytce zawierającej 25-30 ml pożywki Sf900 III.
    2. ~6 godzin po posiewie dodać do komórek 150-300 μl zapasu wirusa P1 o najlepszej ekspresji.
    3. Po upływie 72 godzin od zakażenia ostrożnie odessać pożywkę z płytki do odpowiedniej probówki (sterylnej) i odwirować probówkę o stężeniu 500-1000 X g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad komórek (jeśli taki powstaje) i zachować supernatant. To jest zapas wirusa P3.
  4. Określenie optymalnego miana wirusa dla ekspresji białek na dużą skalę
    1. Komórki płytki w 2 ml pożywki Sf900 III, jak opisano w 1.1, na płytce 6-dołkowej.
    2. Dodać 20, 30, 40 i 50 μl zapasu wirusa P3 do oddzielnych studzienek ~ 6 godzin po posiewie. Dołącz niezainfekowaną kontrolkę.
    3. Zbierz komórki z każdej studzienki 48-60 godzin po zakażeniu.
    4. Dodać 100 μl 2X buforu SDS Laemmli. Podgrzewać w temperaturze >95 °C przez 10 min. Wirować (zwykle przy 14 000 x g) przez 5 min.
    5. Rozpuść 10-15 μl każdej próbki w 8-10% żelu SDS-PAGE.
    6. Przenieść rozdzielone białko do błony nitrocelulozy/PVDF, jak wspomniano w 1.2.6.
    7. Osuszyć przeciwciałem anty-IKK1 (rozcieńczenie ~1:2000, musi być zoptymalizowane) lub przeciwciałem anty-PentaHis (rozcieńczenie ~1:3000, musi być zoptymalizowane).
    8. Używaj wirusa z najlepszym mianem ekspresji dla ekspresji na dużą skalę.

2. Ekspresja na dużą skalę 6x-His Oznaczonego człowieka IKK129,33

  1. Przeprowadź ekspresję na dużą skalę w kulturze zawiesiny. Podzielić komórki na 1 l pożywki Sf900 III w 2 litrowej kolbie Erlenmeyera z wentylowaną nakrętką. Gęstość komórek powinna wynosić ~5x105 komórek/ml.
  2. Hoduj te komórki w zawiesinie z prędkością ~100 obr./min w temperaturze 27 °C w wytrząsarce przez ~ 2 dni, aż osiągnie gęstość 1-2x106/ml. Gęstość komórek nie może przekraczać 2x106/ml.
  3. Dodać żądaną ilość wirusa P3, zgodnie z oceną w ppkt 1.4.
  4. Hoduj zainfekowaną kulturę przez 48-60 godzin przy ~100 obr./min w temperaturze 27 °C w shakerze.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze <1 500 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Zachowaj osad komórkowy i wyrzuć podłoże.
  7. Przystąp bezpośrednio do oczyszczania białka. Błyskawicznie zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Oczyszczanie His-IKK133

  1. W dniu 1 ponownie zawieś osad komórkowy w 40 ml buforu do lizy (25 mM Tris pH 8,0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM imidazolu, 10% glicerolu, 5 mM β-merkaptoenolu i koktajlu inhibitorów proteazy).
    UWAGA: Masa osadu z mokrymi komórkami nie została określona. Zazwyczaj do tego etapu używa się ~2 L kultury.
  2. Lizować komórki przez sonikację przy 60-70% cyklach pracy, 5-10 impulsów trwających 30 s w odstępie >1 min, utrzymując zawiesinę komórek schłodzoną na lodzie.
    UWAGA: Ten krok wymaga optymalizacji dla każdego modelu sonikatora. Nie dopuścić do rozgrzania próbki powyżej 10 °C.
  3. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze ≥ 28 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zrównoważyć 4 ml żywicy agarozowej Ni-NTA z buforem do lizy i wymieszać oczyszczony lizat (supernatant) zgodnie z protokołem producenta.
  5. Pozostawić białko do związania żywicy przez inkubację przez 2 godziny w mieszalniku obrotowym w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C.
  6. Dokładnie przemyć żywicę buforem do lizy zawierającym 30 mM imidazolu. Okresowo sprawdzaj stężenie białka we frakcji płuczącej za pomocą testu Bradforda. Myć do momentu, aż stężenie białka we frakcji płuczącej osiągnie 0,1 mg/ml. Zazwyczaj do osiągnięcia tego punktu wymagana jest objętość bufora myjącego > 20 złożami.
  7. Elute znakowane Hisem białko IKK1/α pod przepływem grawitacyjnym, używając 20 ml buforu elucyjnego (bufor do lizy zawierający 250 mM imidazolu). Zbierz frakcje 1-1,5 ml.
  8. Sprawdź czystość eluowanego białka na 8 lub 10% żelu SDS PAGE, ładując 5-10 μL próbki ze wszystkich frakcji zmieszanych z buforem Laemmli.
  9. Zpuluj frakcje szczytowe (stężenie ≥ 2 mg / ml) i zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
  10. Trawienie z proteazą TEV (1:30-50 (proteaza TEV:IKK1)) przez noc (≥12 h) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zoptymalizuj ilość proteazy TEV wymaganą do całkowitego (≥ 95%) trawienia znacznika 6X-His a priori. Proteaza TEV została oczyszczona we własnym zakresie.
  11. Rankiem w dniu 2 inkubować białko z 1 mM ATP w obecności 20 mM MgCl2, 20 mM β-glicerofosforanu, 10 mM NaF i 1 mM orthovanadanu sodu przez 1 godzinę w temperaturze 27 °C.
  12. Przefiltrować roztwór białka przez filtr 0,45 lub 0,22 μm.
  13. Załadować 6 ml próbki do kolumny z wykluczaniem wielkości preparatywnej o pojemności ~120 ml podłączonej do zautomatyzowanego systemu chromatografii cieczowej. Zrównoważyć kolumnę buforem A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerolu) przed nałożeniem próbki białka.
    UWAGA: W zależności od wydajności białka po etapie oczyszczania powinowactwa Ni-NTA można użyć mniejszej kolumny. Dostosuj/oblicz objętość ładunku tak, aby wynosiła 5% objętości kolumny).
  14. Uruchomić chromatografię wykluczania wielkości przy natężeniu przepływu 1 ml/min i monitorować elucję przy 280 i 254 nm. Zbierz frakcje o wielkości 2 ml.
  15. Sprawdź czystość frakcji pikowych (zwykle około ~60-70 ml) na 8-10% żelu SDS-PAGE.
  16. Zebrać czyste frakcje (czystość ≥95% o stężeniu ≥0,5 mg/ml) i skoncentrować w odśrodkowym koncentratorze białek o masie cząsteczkowej 10 kDa lub 30 kDa zgodnie z instrukcjami producenta.
  17. Okresowo sprawdzaj stężenie białka w koncentracie metodą Bradforda i zagęszczaj próbkę do 8-12 mg/ml.
  18. Dozować 25 μl porcji i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Próbki zamrożone błyskawicznie należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

4. Ekran warunków krystalizacji IKK1

  1. Obliczyć całkowitą ilość (objętościową) białka potrzebną do przeprowadzenia badań przesiewowych na obecność kryształów zgodnie z metodami opisanymi poniżej.
  2. Wypróbuj różne inhibitory (generyczne inhibitory kinaz: AMPPNP i staurosporyna; Inhibitory specyficzne dla IKK: MLN120B, związek A i inhibitor IKK XII) do przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku krystalizacji. Sporządzać roztwory podstawowe tych związków zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że maksymalne stężenie związku w jego roztworze podstawowym nie przekracza 20 μM.
  3. Przygotować kompleks IKK:inhibitor do badania krystalizacji, mieszając 100 μM IKK1 z 200 μM inhibitorem i inkubować w temperaturze 18-20 °C przez 30-40 minut. Odwirować tę mieszaninę w temperaturze >15 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zachowaj supernatant do ekranu krystalizacji.
  4. Skorzystaj z dostępnych na rynku ekranów krystalizacji (patrz Tabela materiałów).
  5. Odpipetować 80-100 μl każdego odczynnika krystalizacyjnego (roztwory zbiornikowe), za pomocą pipety wielokanałowej lub robota, do zbiornika 96-dołkowej płytki. Płyta jest teraz gotowa do ustawienia kropli. Upewnij się, że na płytce znajdują się od 2 do 3 kropli krystalizacji, tak aby można było przesiać od 2 do 3 inhibitorów na jednej płytce.
  6. Za pomocą robota do krystalizacji dozować i mieszać 0,2–0,25 μl kompleksu IKK1:inhibitor z tą samą objętością roztworu zbiornikowego.
    UWAGA: Przesiewanie można przeprowadzić ręcznie przy użyciu większych objętości kropli (0,5-1,0 μl kompleksu IKK1:inhibitor przy tej samej objętości roztworu rezerwuarowego). Jednak użycie robota pomogłoby zaoszczędzić cenne odczynniki.
  7. Natychmiast po ustawieniu kropli należy uszczelnić optycznie przezroczystymi foliami, aby uniknąć parowania. Dokładnie uszczelnij za pomocą odpowiedniego aplikatora. Wykonaj repliki płytek dla każdego zestawu inhibitorów. Inkubować jedną płytkę w temperaturze 18 °C, a drugą w chłodni (zakres temperatur ~4–6 °C). Upewnij się, że inkubatory nie są narażone na wibracje.
  8. Użyj mikroskopu stereoskopowego z polaryzatorem, aby sprawdzić pojawienie się kryształów w każdej kropli codziennie przez pierwsze siedem dni, a następnie w dłuższych odstępach czasu. Systematycznie notuj i oceniaj te obserwacje.
    UWAGA: Użyj mikroskopu stereoskopowego z polaryzatorem, aby można było wizualnie ocenić defekty wzrostu kryształów. W tym przypadku kryształy pojawiły się w stanie, w którym roztwór zbiornika zawierał 3% w/v siarczanu dekstranu, sól sodową Mr 5 000, 0,1 M BICINE pH 8,5, 15 % w/v glikolu polietylenowego 20 000. Kryształy IKK1 rosły tylko w obecności inhibitora IKK XII.

5. Optymalizacja wzrostu kryształów29,33

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych.
    1. Przygotować 30% w/v roztwory siarczanu dekstranu o różnej masie cząsteczkowej (śr. MW 5 000, 8 000, 15 000, 40 000 Da) w dejonizowanymH2O. Roztwór filtracyjny za pomocą filtrów 0,22 μm.
    2. Przygotować 1 M lub 0,5 M zapasy różnych w zakresie pH od 6,5 do 9. Roztwory filtracyjne przy użyciu filtrów 0,22 μm.
    3. Przygotować 25% lub 50% (w/v) roztwory PEG o różnej masie cząsteczkowej (średnio MW: 1000, 1,500, 3,350, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000, 12,000, 20,000 Da). Roztwory filtracyjne przy użyciu filtrów 0,22 μm.
    4. Wykonaj przesiewanie siatki, systematycznie zmieniając pH, rodzaj bufora, stężenie i rodzaj zarówno PEG, jak i siarczanu dekstranu.
  2. Zoptymalizuj przesiewanie zarówno w temperaturze 18 °C, jak i w chłodni (zakres temperatur ~4-6 °C).
  3. Zmieszać równą ilość kompleksu IKK1:Inhibitor z roztworem studzienki i inkubować nad roztworem studzienki w szczelnie zamkniętym środowisku. Ten krok można wykonać ręcznie lub za pomocą robota dozującego.
    UWAGA: W tym przypadku największe i dobrze zdefiniowane kryształy (oceniane na podstawie jednolitego koloru pod polaryzatorem, który wskazywał na równomierny wzrost) uzyskano w następujących warunkach: 100 mM BisTris pH 7,0, 2,8-3,5% siarczanu dekstranu (średnio MW 15 kDa), 8,5-10% PEG 20 kDa w chłodni.

6. Rosnąca liczba kryształów

  1. Przygotować następujące roztwory podstawowe i przefiltrować je przez filtr 0,22 μm.
    1. Przygotuj 0,5 M BisTris pH 7,0 i BisTris propan pH 7,0 i 7,5.
    2. Przygotuj 30% (w/v) siarczanu dekstranu (średnia MW ~15 kDa). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj 50% PEG (średnia MW ~12 kDa).
  2. Użyj 24 dobrze wiszących płytek kroplowych.
  3. Nałóż smar uszczelniający na podniesione pierścienie każdej studzienki.
  4. Przygotuj roztwór studzienki w następujący sposób (stężenie końcowe): 100 mM BisTris pH 7,0–7,5, 2,8–3,5% siarczan dekstranu ~15 kDa, 8,5–10% PEG ~12 kDa. Przygotować 1 ml roztworu studzienkowego w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Zaobserwowano niewielką różnicę w warunkach krystalizacji w zależności od partii białka i/lub siarczanu dekstranu, dlatego zaleca się próbę w wąskim zakresie. Zarówno propanu BisTris, jak i BisTris o tym samym zakresie pH dają monokryształy.
  5. Roztwory studzienek i natłuszczone płytki należy przechowywać w chłodni przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Przygotować kompleks inhibitora IKK1 zgodnie z opisem w 4.3. Przenieść roztwory studzienek z probówek o pojemności 1,5 ml do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej.
  7. Wyczyść silikonowane (komercyjne lub wewnętrzne (silikonowanie/silanizacja)) szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą niestrzępiących się chusteczek i nałóż precyzyjne strumienie powietrza pod wysokim ciśnieniem za pomocą dostępnego w handlu odkurzacza w aerozolu.
  8. Umieścić 1–1,5 μl roztworu studzienki na czystym szkiełku nakrywkowym. Odpipetować równą objętość kompleksu inhibitora IKK1, delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół 3-4 razy. Obróć szklane szkiełko nakrywkowe i umieść na odpowiedniej studzience za pomocą kleszczy i uszczelnij studnię, naciskając smar.
  9. Po ustawieniu wszystkich kropli z płytki 24-dołkowej inkubuj płytkę w chłodni w ciemności. Od czasu do czasu sprawdzaj krople pod mikroskopem pod kątem wyglądu i wzrostu kryształów.
    UWAGA: Nie przetestowano, czy inkubacja płytek kryształowych w świetle zmieni wynik. Bardzo ważne jest jednak, aby płytki były inkubowane w środowisku o minimalnych lub zerowych wibracjach.

7. Krioochrona kryształów

  1. Przygotowanie roztworów kriogenicznych.
    1. Przygotuj Cryo A (~2% siarczan dekstranu, ~10% PEG 12000, 60 mM propan BisTris (o tym samym pH co przeznaczony roztwór studzienny), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 2,5% glicerolu).
    2. Przygotuj Cryo B (~0,3% siarczanu dekstranu, ~10% PEG 12000, 60 mM propanu BisTris (o tym samym pH co zamierzony roztwór studzienny), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 20 lub 25% glicerolu lub 20 lub 25% glikolu etylenowego).
      UWAGA: Przetestuj różne krio-protekcje oprócz glicerolu i glikolu etylenowego (np. PEG 200, PEG 400, PEG MME 550, PEG 1000).
  2. Delikatnie zdejmij szklane szkiełko nakrywkowe zawierające kryształ i umieść go na twardej powierzchni kroplą kryształu skierowaną do góry. Delikatnie dodaj 10 μl roztworu Cryo A na wierzch kropli i delikatnie wymieszaj, pipetując, aby kryształ nie został dotknięty.
    UWAGA: To oczyszcza powierzchnię kryształu z zanieczyszczeń i pomaga zrównoważyć kryształ z początkowym buforem kriogenicznym. Unikaj naprężeń mechanicznych i termicznych kryształu. Wykonaj wszystkie kolejne kroki pod mikroskopem, aby uniknąć uszkodzenia kryształu.
  3. Powoli usuń trochę płynu z kryształu i zachowaj około 5-8 μl roztworu. Unikaj odwodnienia kryształu. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć naprężeń mechanicznych i odwodnienia kryształu we wszystkich kolejnych krokach.
  4. Delikatnie dodać 2,5–4 μl roztworu Cryo B do kropli, bardzo delikatnie wymieszać pipetując. Przykryj małą szalką Petriego, aby uniknąć bezpośredniego przepływu powietrza nad kryształem. Poczekaj 5 minut. Zawsze należy uważać, aby kryształ nie uległ gwałtownym zmianom ciśnienia osmotycznego lub odwodnieniu.
  5. Powtórz krok 7.4 cztery razy, aby powoli zaaklimatyzować kryształ w roztworze krio.
  6. Na tym etapie należy zachować 10–20 μl roztworu kriogenicznego (tj. pozwolić kryształowi zanurzyć się w około 20–25% roztworze zawierającym krioprotekcję). Moczyć przez różne okresy czasu (od 5 minut do 1 godziny) w końcowym roztworze krio.
  7. Zamroź wiele kryształów w różnych punktach czasowych.
  8. Ostrożnie wybierz pojedynczy kryształ z kropli w odpowiedniej kriopętli zamontowanej na odpowiedniej podstawie i zanurz w cieczy N2. Wykonaj ten krok płynnie i szybko, aby uniknąć tworzenia się lodu na krysztale.
    UWAGA: Wybierz kryształ za pomocą pętli o średnicy nieco większej niż najdłuższa oś kryształu, aby można go było zamontować w zrobotyzowanym goniometrze używanym w Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory.
  9. Przechowywać kryształ zawierający kriopętle w krążkach zanurzonych w cieczyN2. Przechowuj te krążki w ciekłej kolbie DewaraN2, dopóki nie będą gotowe do wysyłki do dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w synchrotronie. Przejdź do zbierania i przetwarzania danych dyfrakcji rentgenowskiej (sekcje 8 i 9).
    UWAGA: Dane dyfrakcyjne kryształów IKK1 z domowych źródeł promieniowania rentgenowskiego nie były wystarczająco wysokiej rozdzielczości do prób określenia struktury, chociaż wskazywały na jakość kryształów do przesiewania w synchrotronie. Wszystkie dane dyfrakcyjne zostały zebrane na różnych liniach badawczych (głównie 19ID) Advance Photon Source, Argonne National Laboratory, USA.

8. Gromadzenie danych rentgenowskich

  1. Zbieraj dane dyfrakcji rentgenowskiej na linii badawczej ID19 źródła synchrotronowego APS, korzystając z oprogramowania do zdalnego zbierania danych34.
    UWAGA: Ponad 100 kryształów zostało przetestowanych pod kątem ich właściwości dyfrakcyjnych. Kryształy rutynowo ulegały dyfrakcji z rozdzielczością 7-11 A, tylko rzadko obserwowano kryształy, które ulegały dyfrakcji powyżej 5 A i tylko jeden duży kryształ ulegał dyfrakcji powyżej 4,5 A. Ponieważ kryształy uległy szybkiemu rozpadowi podczas zbierania danych, zebrano zestawy danych w różnych częściach tego samego kryształu. Było to możliwe, ponieważ kryształy były duże (większe niż 400 μm), a średnica użytej wiązki wynosiła 100 μm.

9. Przetwarzanie danych rentgenowskich

  1. Scal wszystkie zestawy danych zebrane w różnych częściach tego samego kryształu34.
    UWAGA: siedem zestawów danych zostało połączonych z najlepszego kryształu, a uzyskane dane były kompletne w 93%. Ogólny I/σ wynosił ~6,8), a Rmerge wynosił 89% w najwyższym przedziale rozdzielczości (5,4-4,5 A).
  2. Przetwarzaj zestawy danych za pomocą HKL200034, aby uzyskać grupę przestrzenną, wymiary komórki elementarnej, zawartość rozpuszczalnika i prawdopodobny skład jednostki asymetrycznej.

10. Rozwiązanie struktury

  1. Przygotowanie modeli wyszukiwania
    1. Na podstawie dostępnych modeli strukturalnych hIKK2 (pdb id 4E3C i 4KIK35), wygeneruj serię dimerów o różnych orientacjach N-końcowego KD (co renderuje otwór 30 i 62 A, między P578 dwóch KD w dimerze). Żaden z tych modeli nie uzyskał rozwiązania do poszukiwania substytucji molekularnej po szeroko zakrojonych próbach.
    2. Wygeneruj mapę IKK1 z danych krio-EM pojedynczej cząstki33.
    3. Wygeneruj model ludzkiego IKK1 ze struktury IKK2 o najwyższej rozdzielczości (pdb id 4KIK).
    4. Zadokuj poszczególne domeny ludzkiego modelu IKK1 do mapy gęstości kriogenicznego EM ludzkiego IKK1 za pomocą COOT36. To obróciło orientację KD o około 24 stopnie i zmodyfikowało otwór N-końcowy do ~58 A.
    5. Zastosuj orientację KD modelu dopasowanego do cryo-EM (monomeru) do wszystkich dimerów wygenerowanych w 10.1.1.
  2. Wymiana molekularna
    1. Użyj dimerów z 10.1.1 i 10.1.5 jako modeli wyszukiwania w programach PHASER37, MOLREP38 i CNS39,40.
      UWAGA: Tutaj, używając jednego z dimerów z 10.1.5 (otwarcie 52 A) jako modelu wyszukiwania, sześć dimerów (dwa heksamery) zlokalizowano w jednostce asymetrycznej za pomocą MOLREP. Otwór 52 A w modelu wyszukiwania jest podobny do otwarcia 49-50 A dimerów (wszystkich sześciu dimerów) w wyrafinowanej strukturze.

11. Udoskonalenie struktury

  1. Procedura udoskonalania struktury
    1. Napraw orientację i położenie tego początkowego modelu poprzez udoskonalenie bryły sztywnej w CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Dalsze udoskonalanie struktury za pomocą minimalizacji i symulowanego wyżarzania z funkcją docelową maksymalnego prawdopodobieństwa i płaską korektą rozpuszczalnika przy użyciu systemu CNS39,40.
    3. Zbuduj model na podstawie map 2F,O-F, C i Fo-Fc, używając Xtalview41.
      UWAGA: Zastosuj wspomagane przez DEN uściślenie42 i NCS restrain podczas udoskonaleń, aby uzyskać lepszą dokładność modelu. Rzeczywiście, udoskonalenie DEN radykalnie poprawiło geometrię i współczynniki R konstrukcji, a współczynnik R wynosił 22,2%, a współczynnik swobodnego R wynosił 27,8% dla modelu końcowego. Radykalna poprawa R free musi wynikać z modelu o wysokiej dokładności domen IKK1, który został wygenerowany z modelu IKK2 (4KIK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonowanie i wyrażanie różnych konstrukcji IKK1/α
Pełnowymiarowy ludzki IKK1 / α sklonowano do wektora ekspresyjnego bakulowirusa pFastBacHTa w miejscach ograniczeń EcoRI i NotI, aby uzyskać N-końcowy heksa-histydynę znakowaną IKK1. Znacznik można usunąć przez trawienie proteazy TEV. Ponieważ IKK1 / α na całej długości zawiera elastyczne regiony na obu końcach, a elastyczne regiony zwykle utrudniają krystalizację białka, sklonowaliśmy różne skrócone fragmenty IKK1 / α...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wytwarzanie, krystalizacja i struktura roztworu dwóch pokrewnych białek IKK
Postanowiliśmy określić strukturę krystaliczną promieniowania rentgenowskiego IKK1 / α z założeniem, że będzie to stosunkowo proste ćwiczenie, biorąc pod uwagę nasze doświadczenie w produkcji białka IKK2 / β, krystalizacji i określaniu struktury. Byliśmy jednak bardzo zaskoczeni, że te dwa spokrewnione białka zachowywały się zupełnie inaczej pod względem łatwości krystalizacji. Pomimo wysiłków kilku renomowanych laboratoriów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy personelowi linii badawczych 19ID, 24ID i 13ID w Advanced Photon Source, Lemont, IL, za wsparcie podczas zbierania danych o różnych kryształach. Jesteśmy wdzięczni Dmitrijowi Lyumkisowi z Salk Institute za dostarczenie nam mapy krio-EM o niskiej rozdzielczości na wczesnych etapach budowy mapy/modelu EM, która została wykorzystana do zbudowania wstępnego modelu poszukiwania substytucji molekularnej IKK1. Badania, które doprowadziły do tych wyników, otrzymały finansowanie z grantów NIH AI064326, CA141722 i GM071862 dla GG. SP jest obecnie członkiem Wellcome Trust DBT India Intermediate Fellow.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin został wycofany z produkcji i zastąpiony przez Cellfectin II
Sf900 III Pożywka z komórek owadzichThermo Fisher Scientific12658-027
Ogniwa SF9Thermo Fisher Scientific12659017
anty-IKK1Novus BiologicalsNB100-56704Wcześniej sprzedawane przez Imgenex
przeciwciało anty-PentaHisQiagen34460
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Nitroceluloza może być również stosowana
Agaroza Ni-NTAQiagen30210
Odczynnik do oznaczania BradfordaKolumna BioRad500001
Superdex 200
AmiconMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Związek AInhibitor IKK Bayer
Calbiochem XIICalbiochem401491
StaurosporynaSIGMAS4400
MLN120BMilleniumPrzedmiot upominkowy
AMPPNPSIGMAA2647
Siarczan dekstranuSIGMA51227, 42867, 31404,
siarczan dekstranuAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Niektóre z nich to nowe Cat # w katalogu SIGMA. To, co mieliśmy, pochodziło z Fluki, która miała inny Cat #.
Ekrany
Ekran kryształowy I i II (ekran kryształkowy HT)Hampton ResearchHR2-130
Indeks HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion i PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 i PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 i SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Montaże kryształoweHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
SynchrotronZaawansowane źródło fotonów (APS) w Departamencie Energii Stanów Zjednoczonych' s Argonne National LaboratoryBeamline 19 IDZaawansowane źródło fotonów (APS) w Departamencie Energii Stanów Zjednoczonych" s Argonne National Laboratory dostarcza ultrajasne, wysokoenergetyczne, generowane w pierścieniu wiązki promieniowania rentgenowskiego do badań w prawie wszystkich dyscyplinach naukowych.
przeciwciało Koncentrator 28989335 firmy GE Healthcarekrystalizacji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

Powiązane artykuły