Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca^{2 +}, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Streszczenie

Protokół AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) pociąga za sobą szybki, prosty i tani sposób generowania dużych ilości monokultur astrocytów myszy i szczurów podobnych do in vivo: Komórki mózgowe mogą być izolowane z różnych regionów mózgu, a po tygodniu hodowli komórek, komórki nieastrocytowe są otrząsane poprzez umieszczenie szalek hodowlanych na shakerze na 6 godzin w inkubatorze. Pozostałe astrocyty są następnie przenoszone do nowych płytek z pożywką specyficzną dla astrocytów (określaną jako NB+H). NB+H zawiera niskie stężenia wiążącego heparynę czynnika wzrostu podobnego do EGF (HBEGF), który jest stosowany zamiast surowicy w pożywce. Po wzroście w NB+H, astrocyty AWESAM mają gwiaździstą morfologię i charakteryzują się drobnymi wyrostkami. Co więcej, astrocyty te mają większą ekspresję genów podobną do in vivo niż astrocyty generowane wcześniej opublikowanymi metodami. Obrazowanie^Ca2+, dynamikę pęcherzyków i inne zdarzenia w pobliżu błony można zatem badać w drobnych procesach astrocytarnych in vitro, np. przy użyciu mikroskopii konfokalnej żywych komórek lub mikroskopii TIRF. Warto zauważyć, że astrocyty AWESAM wykazują również spontaniczną sygnalizację Ca^{2 +} podobną do astrocytów in vivo.

Wprowadzenie

Astrocyty wpływają na funkcjonowanie mózgu poprzez wsparcie troficzne, przepływ krwi, sygnalizację synaptyczną i plastyczność, oraz komunikację międzykomórkową - wszystkie te mechanizmy koncentrują się wokół cienkich procesów astrocytowych. Opisany tutaj protokół AWESAM pozwala na badanie tych procesów bez zakłóceń ze strony neuronów i innych komórek glejowych, co jest przydatne np. dlatego, że ekspresja wielu białek, a nawet sygnalizacji Ca²⁺ nakłada się na siebie w różnych typach komórek mózgowych. Co więcej, metoda ta pokonuje ograniczenia wcześniej dostępnych technik. W szczególności nasz protokół zapewnia morfologię podobną do in vivo (astrocyty gwiaździste z cienkimi wyrostkami) i ekspresję genów w szybki, łatwy i tani sposób.

Na morfologię komórek, ekspresję genów i wiele innych procesów regulacyjnych bezpośredni wpływ ma środowisko. W naczyniu hodowlanym odnosi się to do czynników uwalnianych przez otaczające komórki, ale także pożywki, w której komórki są hodowane. W przypadku astrocytów wcześniej donoszono, że HBEGF indukuje morfologię gwiaździstą¹, ale stwierdzono również, że deróżnicuje astrocyty². Jednak niższe stężenia HBEGF zostały później wykorzystane do wygenerowania większej liczby astrocytów podobnych do in vivo, zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania RNA w dwóch różnych protokołach^3,4. Co więcej, morfologia astrocytów zmienia się wraz ze składem pożywki, niezależnie od protokołu⁴: Pożywka neurobazalna o niskim stężeniu HBEGF jest optymalna do wzrostu astrocytów gwiaździstych, podczas gdy inne kompozycje pożywki (np. DMEM zawierające surowicę) wytwarzają komórki wielokątne (nawet w astrocytach świeżo wyizolowanych przez immunopanning).

Protokół AWESAM przezwycięża wady poprzednich technik hodowli monocytów astrocytów⁴. Poprzednie techniki hodowli monocytów astrocytów miały następujące wady: morfologia wielokątna, która jest nietypowa dla astrocytów gwiaździstych in vivo (metoda MD)⁵; długość i koszt protokołu (przygotowanie astrocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych trwa trzy miesiące i wymaga wielu odczynników, w tym drogich czynników wzrostu)⁶; mała ilość materiału (metoda immunopanningu)3; oraz dedyferencjacja astrocytów i wymóg matrycy 3D (Puschmann i wsp.)^1,2. Natomiast protokół AWESAM zapewnia: morfologię podobną do in vivo (astrocyty gwiaździste z cienkimi wyrostkami); szybka, łatwa i tania metoda; duże ilości materiału; i największą ekspresję genów podobną do in vivo w porównaniu z astrocytami immunopanowanymi i MD. Dodatkowo hodowla 2D pozwala na badanie sygnalizacji Ca²⁺ i recyklingu pęcherzyków w cienkich procesach oraz w zdarzeniach w pobliżu błony (np. mikroskopia TIRF nie jest możliwa w hodowlach 3D).

Metoda MD jest szeroko stosowana od czasu jej publikacji w 1980 roku⁵, oferując prostą i szybką technikę dla monokultur astrocytów wielokątnych. Krótko mówiąc, metoda MD polega na hodowaniu mieszanych komórek mózgowych w DMEM zawierającym płodową surowicę cielęcą (FCS), a następnie etapach wstrząsania, które wzbogacają astrocyty (gdy wszystkie inne typy komórek mózgowych odłączają się od naczynia) i dalszej hodowli w tym samym podłożu. DMEM uzupełniony FCS jest stosowany do wielu innych typów komórek, począwszy od fibroblastów i adipocytów po różne linie komórek rakowych, z których wszystkie mają wspólną morfologię wielokątną wykazywaną przez astrocyty MD w hodowli. Do początku 2000 roku⁷, niewiele uwagi poświęcono pożywkom dostosowanym do astrocytów, szczególnie w celu faworyzowania ich typowej morfologii gwiaździstej znalezionej in vivo. Jeden z protokołów opublikowany w 2011 roku osiąga taką morfologię gwiaździstą: Nazywany metodą immunopanningu, wykorzystuje pożywkę bez surowicy zoptymalizowaną pod kątem hodowli astrocytów³. Korzystając z tej metody, świeżo wyizolowane komórki mózgowe są wystawiane na działanie szeregu szalek pokrytych przeciwciałami, które celują w białka powierzchniowe komórek specyficzne dla typu komórki, aby wzbogacić je w astrocyty. Pomimo bardziej zbliżonej do in vivo morfologii i profilu ekspresji astrocytów z immunobadaniem, większość badań in vitro nadal opiera się na metodzie astrocytów MD. Metoda MD jest prosta i szybka, podczas gdy metoda immunopanningu obejmuje bardziej złożone i czasochłonne etapy w pierwszym dniu hodowli (takie jak dłuższe okresy trawienia enzymów, staranne nakładanie warstw roztworów o różnej gęstości, samo immunopanning i kilka etapów wirowania - wszystko przed posiewem). Jednak dzięki zastosowaniu bardziej specjalistycznej pożywki, metoda AWESAM oferuje zarówno szybkość metody MD, jak i morfologię protokołu immunopanningu podobną do in vivo.

Ogólnie, protokół AWESAM jest przydatny do badania więcej astrocytów in vivo w monokulturach 2D izolowanych z neuronów i innych komórek glejowych (jak wcześniej scharakteryzowano⁴ za pomocą barwienia immunologicznego, immunoblotów i sekwencjonowania RNA). Pozwala na badanie cienkich procesów astrocytarnych i zapewnia doskonałą dostępność do wizualizacji spontanicznej sygnalizacji Ca^{2 +} i zdarzeń w pobliżu błony (np. zobrazowanych za pomocą mikroskopii TIRF).

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi niemieckiego dobrostanu zwierząt.

UWAGA: Oś czasu i główne kroki protokołu są zilustrowane w Rysunek 1.

1. Przygotowania

1. Przygotuj następujące rozwiązania.
   1. Przygotuj DMEM+ do hodowli wielokątnych astrocytów MD: DMEM z 10% FCS, 100 U penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
   2. Przygotuj NB+H do hodowli astrocytów gwiaździstych: pożywka neuropodstawowa z 5 ng/ml HBEGF, 1x suplement B-27, 1x suplement glutaminy, 100 U penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
      UWAGA: Podwielokrotności o wyższych stężeniach HBEGF mogą być przygotowywane i przechowywane w temperaturze -20 °C w celu dodania do pożywki w razie potrzeby.
   3. Przygotować pożywkę separacyjną (10 mM HEPES w HBSS).
   4. Przygotować porcje 6-7 ml 0,05% trypsyny-EDTA i 6-7 ml 0,25% trypsyny-EDTA w probówkach o pojemności 15 ml. Można je przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Dzień przed rozpoczęciem protokołu pokryj 10 cm naczynia poddane kulturze tkankowej po 5 ml 0,04% polietyleninizny (PEI) każda.
3. Następnego dnia usuń PEI i dwukrotnie umyj naczynia dejonizowaną, destylowaną wodą. Dodać 12 ml DMEM+ do każdej płytki i wstępnie zrównoważyć w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.
4. Przygotuj obszar sekcji: W okapie preparacyjnym z przepływem laminarnym umieść na lodzie dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione pożywką preparacyjną. Dla każdego obszaru mózgu, który ma zostać wyizolowany (np. kora, hipokamp), przygotuj 15-probówkę wypełnioną 14 ml pożywki preparacyjnej i trzymaj na lodzie. Spryskaj narzędzia do preparowania (cienkie nożyczki, kleszcze Dumont #3 i #5) 70% etanolem i umieść obok mikroskopu preparacyjnego w kapturze.

2. Sekcja mózgu szczura lub myszy

UWAGA: Można używać zarówno myszy, jak i szczurów. Zwierzęta starsze niż P8 mogą być również wykorzystywane (testowaliśmy do P12), ale usunięcie opon mózgowych będzie coraz trudniejsze. Co więcej, wydajność i zdrowie komórek będą się zmniejszać, ponieważ komórki mózgowe starszych zwierząt utworzą skomplikowane procesy i połączenia, które mogą zostać przerwane podczas dysocjacji tkanek, prowadząc do zwiększonej śmierci komórek. Opisano tutaj preparaty korowe, ale można również wykorzystać inne obszary mózgu.

1. Umieścić 0,05% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Eutanazja zwierząt (ciężarnych szczurów w przypadku szczeniąt E19 lub zwierząt P0-P8) poprzez powolne zwiększanie stężenia CO₂ i izolowanie mózgów. Poniższe kroki wymagają sterylnej techniki.
3. Jeśli pracujesz z tkanką embrionalną, najpierw usuń zarodki z macicy i otwórz woreczki embrionalne, a następnie natychmiast odetnij głowy nożyczkami. Po odcięciu wszystkich głów przenieś je do wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego.
   1. Gdy głowy zostaną zanurzone w podłożu, otwórz skórę i czaszkę (obie są bardzo miękkie u młodych zwierząt) za pomocą kleszczy i uszczypnij móżdżek. Ostrożnie podnieś resztę mózgu do góry i wyjmij z czaszki.
      UWAGA: Dwa do czterech zarodków E19 wytwarza wystarczającą ilość tkanki na co najmniej osiem 10-centymetrowych szalek astrocytów korowych posianych po 500 000 komórek na szalkę w dniu sekcji.
4. W przypadku nowonarodzonych lub starszych szczeniąt odetnij głowy nożyczkami i odizoluj mózg, przyśrodkowo przecinając skórę w linii prostej od tyłu głowy do czubka nosa. Odciągnij skórę na bok i ostrożnie przetnij czaszkę w lewo i w prawo, a następnie podnieś kość czaszki do góry. Odetnij móżdżek i wyciągnij resztę mózgu do góry i na zewnątrz czaszki.
   UWAGA: Dwa do trzech szczeniąt P0-P8 wytwarza wystarczającą ilość tkanki na co najmniej osiem 10-centymetrowych szalek astrocytów korowych posianych po 500 000 komórek na szalkę w dniu sekcji.
5. Oddziel korę od leżącej poniżej struktury śródmózgowia. Umieść kleszcze w podłużnej szczelinie między półkulami, a następnie przesuń kleszcze między korą a strukturami śródmózgowia jednej półkuli (prostopadle do szczeliny podłużnej), aby uwolnić każdą półkulę.
6. Za pomocą kleszczy usuń wszystkie opony mózgowe z każdej półkuli (i jej hipokampa), a następnie oddziel hipokampy. Jeśli wymagane są astrocyty hipokampa, przenieś każdy hipokamp do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 14 ml pożywki preparacyjnej na lodzie.
7. Usuń kolejne obszary z kory każdej półkuli, jeśli wymagane są określone regiony (np. kora czołowa). Pokrój dowolną tkankę korową, która ma być użyta do wytworzenia astrocytów, na kawałki nie większe niż 1 mm³. Zbierz wszystkie kawałki tkanki korowej w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej podłożem preparacyjnym na lodzie.

3. Trawienie i dysocjacja tkanek

1. Po zebraniu wszystkich kawałków tkanki poczekaj, aż osiądą na dnie probówki, a następnie odessaj jak najwięcej pożywki.
2. Dodać 2-3 ml 0,05% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej i inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 min.
   UWAGA: Szybko uwolnij całą trypsynę-EDTA z pipety, aby wymieszać kawałki tkanki i pozostawić do ponownego ustabilizowania się.
3. Ostrożnie odessać trypsynę-EDTA, pozostawiając kawałki tkanek w jak najmniejszej ilości płynu na dnie probówki.
4. Dodaj 5 ml wstępnie schłodzonej pożywki preparyjnej, aby zmyć pozostałą trypsynę-EDTA. Odpipetować z boku górnej części probówki, aby uzyskać wymieszanie kawałków tkanki.
5. Odessać podłoże preparacyjne i pozostawić kawałki tkanki w jak najmniejszej ilości płynu. Powtórz ten etap mycia z użyciem wstępnie schłodzonego podłoża preparacyjnego jeszcze dwa razy.
6. Po ostatnim etapie mycia dodaj 1 ml DMEM+ (podgrzanego do temperatury pokojowej) za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i rozcieraj tkankę, pipetując w górę iw dół bez wprowadzania pęcherzyków.
   UWAGA: Ważne jest, aby unikać wytwarzania pęcherzyków, ponieważ może to zmienić pH roztworu, na które astrocyty są dość wrażliwe.
7. Umieść sitko o pojemności 100 μm w otworze probówki o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż filtr 4.5 ml wstępnie schłodzonego DMEM+.
8. Odpipetować 1 ml zdysocjowanej zawiesiny tkankowej na sitko komórkowe i dodać kolejne 4,5 ml wstępnie schłodzonego DMEM+, aby przemyć komórki przez sitko komórkowe.

4. Posiewanie komórek w celu wzbogacenia astrocytów przez pasażowanie

1. Policzyć komórki, np. rozcieńczając 10 μl zawiesiny komórek w 10 μl błękitu trypanowego i pipetując mieszaninę do hemocytometru.
2. Umieść 500 000 komórek w 12 ml DMEM+ na 10-centymetrowe naczynie.
   UWAGA: DMEM+ jest pomocny we wzroście astrocytów, bardziej niż w przypadku neuronów czy mikrogleju. Podczas wytrząsania siły fizyczne działające na szklane szkiełka nakrywkowe w studzienkach są znacznie silniejsze niż te działające na 10-centymetrowe szalki (bez szkiełek nakrywkowych). Jeśli komórki zostaną wstrząśnięte na płytkach 24-dołkowych, stają się niezdrowe lub umierają. Astrocyty umieszczać na płytkach 24-dołkowych tylko po wstrząśnięciu.
3. Hodowle komórkowe należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 przez} siedem dni.
4. W dniu 6, dzień przed wytrząsaniem i pasażowaniem komórek, przygotuj płytki hodowlane pokryte PEI zgodnie z opisem w kroku 5.

5. Komórki pasujące

1. Dzień przed pasażowaniem pokryj płytki hodowli komórkowych 0,04% PEI.
   1. Do immunocytochemii, transdukcji wirusa lub transfekcji plazmidowej należy użyć płytek 24-dołkowych lub 6-dołkowych (każda zawierająca odpowiednio wysterylizowane szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm lub 25 mm).
   2. Wysterylizuj szklane szkiełka nakrywkowe przez inkubację w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę, a następnie umyj trzykrotnie w dejonizowanej wodzie destylowanej przed umieszczeniem szkiełek nakrywkowych w studzienkach.
   3. Dodać co najmniej 70 μl 0,04% PEI na 12 mm szkiełka nakrywkowego w płytkach 24-dołkowych i 600 μl 0,04% PEI na 25 mm szkiełka nakrywkowego w płytkach 6-dołkowych.
   4. Do analizy Western blot lub RNA-Seq można nadal używać 10-centymetrowych szalek zawierających komórki po sekcji. Naczynia wystarczy wstrząsnąć, a następnie komórki przemywa się 1x PBS i traktuje NB+H (nie przenosić do nowych naczyń).
2. W dniu in vitro (DIV) 7 po rozbiorze umieścić 10-centymetrowe szalki z komórkami w DMEM+ na wytrząsarce laboratoryjnej w inkubatorze i wstrząsać szalkami z prędkością 110 obr./min przez 6 godzin.
3. Zmyć PEI z powlekanych szkiełek nakrywkowych dwukrotnie dejonizowaną, destylowaną wodą. Dodać pożywkę NB+H do płytek (500 μl na dołek dla płytek 24-dołkowych i 2 ml na dołek dla płytek 6-dołkowych). Wstępnie wyrównać płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ podczas wstrząsania 10-centymetrowych szalek lub przez co najmniej 30 minut.
4. 20-30 minut przed końcem 6-godzinnego wstrząsania podgrzej 1x PBS, DMEM+, NB+H i 0,25% trypsyny-EDTA do 37 °C w łaźni wodnej.
5. Po 6 godzinach wstrząsania zdejmij szalki hodowlane z wytrząsarki i natychmiast zastąp pożywkę (zawierającą strząśnięte neurony, oligodendrocyty i mikroglej) 10 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS na talerz.
   UWAGA: Ważne jest, aby natychmiast zassać starą pożywkę zawierającą oderwane komórki, aby uniknąć ponownego przyłączenia się komórek nieastrocytowych.
6. Usuń PBS i dodaj 3 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA na danie. Inkubować każde naczynie przez 4 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: W przypadku przygotowywania próbek do Western blot lub RNA-Seq nie należy dodawać trypsyny-EDTA. Zamiast tego zastąp PBS 12 ml wstępnie podgrzanym NB+H, po czym kultury można umieścić z powrotem w inkubatorze.
7. Dodaj 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM+ do 3 ml trypsyny-EDTA w każdym naczyniu, odpipetuj komórki z naczynia za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i zbierz zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Pipetę należy odpipetować bezpośrednio od dna naczynia - dno naczynia powinno stać się czystsze w miarę odłączania się komórek. Używaj wyłącznie pożywki zawierającej surowicę (zamiast DMEM+), ponieważ surowica dezaktywuje trypsynę.
8. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 3,220 x g w temperaturze 20 °C przez 4 minuty.
9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanego NB+H.

6. Posiewanie komórek do końcowych hodowli astrocytów

1. Policz komórki.
2. Płytka 20 000 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych (w 2 ml pożywki NB+H na studzienkę) lub 5 000 komórek na studzienkę w 24-dołkowej pożywce (w 500 μl pożywki NB+H na studzienkę).
3. Hodowle komórkowe należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do czasu dalszego traktowania lub analizy.
4. Wymieniaj połowę podłoża raz w tygodniu.
   UWAGA: W środowiskach ubogich w składniki odżywcze astrocyty przestają się namnażać, ale pozostały mikroglej będzie się rozmnażał (chociaż z naszego doświadczenia wynika, że mikroglej nie pojawił się w kulturach AWESAM). Wymiana połowy pożywki raz w tygodniu zapobiega wzbogaceniu ewentualnie pozostałych mikrogleju ⁸, a monokultury pozostają zdrowe przez co najmniej trzy tygodnie.

Wyniki

Astrocyty współhodowane z neuronami i hodowane w medium NB+ wykazują gwieździsty kształt po 2 tygodniach hodowli (Rycina 2). Oprócz medium NB+, współhodowane astrocyty są również narażone na nieznane czynniki pochodzenia neuronalnego, które prawdopodobnie przyczyniają się do ich przeżywalności i morfologii. W przeciwieństwie do nich, astrocyty MD hodowane w DMEM+ jako monokultury (po odstrząśnięciu innych typów komórek przed pasażowaniem) wykazują kształt wie...

Dyskusja

Kluczowe znaczenie mają cztery kroki w protokole: 1) przygotowanie stężenia HBEGF do dokładnie 5 ng/ml, ponieważ niewielki wzrost stężenia może prowadzić do niedojrzałych kultur, np. 10 ng/ml HBEGF spowoduje deróżnicowanie astrocytów⁴; 2) unikanie pęcherzyków w roztworach zawierających tkanki lub komórki, które mogą zmieniać pH i utrudniać zdrowie astrocytów; 3) pożywki wstępnie równoważące w celu osiągnięcia optymalnego pH i temperatury do wzrostu zdrowych astrocytów; 4) wymiana tylko po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna-EDTA	Gibco	25300054	ciepła w 37 º C kąpiel wodna przed użyciem
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco	25200-056	ciepła w 37 º C kąpiel wodna przed użyciem
Suplement B-27	Gibco	17504-044	50X zapas
Glutamax	Gibco	35050-061	100X zapas
Penicylina / streptomycyna	Gibco	15070-063	50 zapas; penicylina: 5000 U/ml; streptomycyna: 5000 &mikro; g/ml
Neurobasew	Gibco	21103049	bez L-glutaminy
	DMEM Gibco	41966029
HBEGF	Sigma	4643
HEPES	Gibco	15630080
HBSS	Gibco	14170112
FCS	Gibco	10437028
PBS	Gibco	10010049	1X
100 μ m nylonowe sitko komórkowe	BD	352360
Trypan Blue	Sigma	T8154
Inkubator do hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific	Inkubator do hodowli komórkowych Hera Cell 240i
			Użyj wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych
Wirówka	Eppendorf	5810 R

Wytrząsarka laboratoryjna Heidolph Rotamax 120