Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Summary

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Abstract

Obecnie, większość modeli gojenia ran in vitro, takich jak dobrze znane testy zadrapań, obejmuje badanie migracji komórek i zamykania ran na dwuwymiarowych powierzchniach. Jednak środowisko fizjologiczne, w którym zachodzi gojenie się ran in vivo, jest raczej trójwymiarowe niż dwuwymiarowe. Staje się coraz bardziej jasne, że zachowanie komórek różni się znacznie w środowiskach dwuwymiarowych i trójwymiarowych; W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na bardziej fizjologicznie istotne modele in vitro do badania zachowań migracyjnych komórek podczas zamykania ran. Opisana w niniejszym dokumencie metoda pozwala na badanie migracji komórek w trójwymiarowym modelu, który lepiej odzwierciedla warunki fizjologiczne niż dotychczas ustalone dwuwymiarowe testy zarysowania. Celem tego modelu jest ocena wzrostu komórek poprzez badanie migracji komórek z dala od ciała sferoidalnego osadzonego w macierzy fibrynowej w obecności czynników pro- lub antymigracyjnych. Za pomocą tej metody można zaobserwować wzrost komórek z ciała sferoidalnego w trójwymiarowej matrycy, który można łatwo określić ilościowo w czasie za pomocą mikroskopii jasnego pola i analizy obszaru ciała sferoidalnego. W tym systemie można również ocenić wpływ czynników promigracyjnych i/lub hamujących na migrację komórek. Metoda ta zapewnia naukowcom prostą metodę analizy migracji komórek w trójwymiarowych matrycach związanych z ranami in vitro, zwiększając w ten sposób znaczenie badań komórkowych in vitro przed zastosowaniem modeli zwierzęcych in vivo.

Introduction

Gojenie ran to złożony proces, który prowadzi do przywrócenia integralności tkanek po urazie. Proces ten jest podzielony na cztery nakładające się na siebie etapy, obejmujące hemostazę, zapalenie, proliferację i przebudowę, z których każdy jest regulowany przez złożoną kombinację rozpuszczalnych wskazówek, interakcji komórka-matryca i komunikacji komórka-komórka. ^1,2 Orkiestracja tych sygnałów kontroluje wiele reakcji komórkowych w procesie gojenia się ran, w tym, co ważne, migrację komórek. ^3,4 Migracja komórek jest bardzo dynamicznym procesem, zależnym zarówno od fenotypów komórkowych, jak i biochemicznych i biofizycznych właściwości środowiska macierzy zewnątrzkomórkowej. ⁵ Komórki nieustannie badają środowisko swojej macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez szlaki pośredniczone przez integryny; Proces ten pozwala komórkom wyczuwać szeroki zakres właściwości matrycy, w tym topografię, sztywność i uwięzienie. Dwuwymiarowa (2D) analiza migracji komórek pokazuje, że migracja jest napędzana przez tworzenie lamellipodiów na krawędzi natarcia poprzez generowanie wiązek włókien aktynowych. Późniejsze tworzenie się zrostów ogniskowych na krawędzi natarcia, w połączeniu ze skurczem i wycofaniem napędzanym aktomiozyną na krawędzi spływu, popycha komórkę do przodu. ⁶ Trójwymiarowa (3D) migracja komórkowa nie jest obecnie dobrze poznana, jednak ostatnie badania pokazują, że migracja 3D jest znacznie inna niż wyżej opisany mechanizm w 2D i prawdopodobnie jest napędzana przez mechanizmy alternatywne. Na przykład ostatnie badania Petrie i wsp. wykazano, że w zależności od właściwości ECM, komórki w matrycach 3D mogą przełączać się między mechanizmami migracji sterowanymi lamellipodium i lobopodium. ⁷ Ponieważ migracja komórek jest kluczowym elementem reakcji na gojenie się ran, modele 3D migracji komórek są kluczowe dla zrozumienia fizjologicznych reakcji na różne bodźce podczas gojenia się ran. Chociaż wykazano, że zachowanie migracyjne komórek na powierzchniach 2D różni się znacznie od migracji w matrycach 3D, większość obecnych modeli migracji komórek in vitro podczas procesu gojenia się ran, w tym dobrze znany test zadrapań, wykorzystuje hodowle jednowarstwowe 2D. ^5,6,7,8,9^{,10,11,12,13,14} Niedawno opracowane testy wykorzystywały matrycę 3D, ale nadal hodowano komórki w monowarstwie na wierzchu matrycy, ograniczając w ten sposób zdolność do prawdziwego odtworzenia trójwymiarowości środowiska komórkowego in vivo.¹⁵

Celem opisanej tutaj metody jest badanie migracji komórek w fizjologicznie istotnym modelu 3D, a nie na powierzchni 2D, w celu uzyskania dokładniejszego zrozumienia reakcji migracyjnych związanych z zastosowanymi bodźcami. Metoda ta pozwala na ocenę migracji komórek w obrębie macierzy skrzepu fibryny 3D w obecności czynników, które aktywują lub hamują szlaki związane z migracją komórek. Do tej metody wybrano matrycę fibrynową ze względu na kluczową rolę, jaką fibryna odgrywa we wczesnych stadiach gojenia się ran; Po urazie w środowisku rany tworzy się skrzep fibryny, który zapobiega utracie krwi i służy jako rusztowanie do początkowej infiltracji komórek podczas naprawy i przebudowy tkanek. ^{2,16,17,18,19,20} Dodatkowo, fibryna jest stosowana klinicznie jako uszczelniacz chirurgiczny, a skład uszczelniaczy został powiązany z migracją komórek i ostatecznymi wynikami gojenia. Poprzednie badanie przeprowadzone przez Coxa i wsp. Badano migrację fibroblastów ze skrzepami fibryny składającymi się z różnych stężeń fibryny i trombiny w celu optymalizacji uszczelniacza fibrynowego. W tych badaniach określono ilościowo migrację komórek z skrzepów fibryny na plastikowe naczynia. ²⁰ Tutaj prezentujemy metodę, która pozwala na ilościowe określenie migracji komórek w środowisku fibryny 3D. Chociaż metoda opisana w tym protokole wykorzystuje fibrynę, model ten można łatwo zmodyfikować w celu wykorzystania alternatywnych materiałów matrycowych zgodnie z potrzebami, takich jak kolagen lub inne matryce 3D. Dodatkowo przedstawiamy zastosowanie sferoid fibroblastów w tym teście, ponieważ migracja fibroblastów do łożyska rany ma ogromne znaczenie dla syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej i naprawy/przebudowy tkanek. Jednak podczas procesu naprawy neutrofile są pierwszym typem komórek, który migruje do łożyska rany, a następnie makrofagi. Fibroblasty następnie zaczynają infiltrować środowisko rany po około 48 godzinach od początkowego urazu, na początku fazy proliferacyjnej procesu gojenia się rany. ¹⁹ Ten test może być łatwo zmodyfikowany tak, aby obejmował neutrofile, makrofagi lub inne typy komórek, aby ocenić, jak zmiany w strukturze skrzepów fibryny wpływają na migrację tych typów komórek. ²¹

Aby wdrożyć ten test, najpierw formuje się sferoidę fibroblastów przy użyciu modyfikacji wcześniej opisanych technik hodowli komórek macierzystych. ²² Sferoida fibroblastów jest następnie przenoszona do matrycy fibryny 3D, a wzrost może być łatwo monitorowany i określany ilościowo przez kilka dni. Protokół ten uwzględnia 3D systemów fizjologicznych poprzez osadzanie sferoid komórek 3D w matrycy fibryny, unikając w ten sposób ograniczeń w znaczeniu spowodowanych użyciem powierzchni wzrostu 2D z monowarstwą komórki do modelowania zachowań migracyjnych, jednocześnie umożliwiając ocenę zachowania komórek w wysoce kontrolowanym środowisku in vitro.

Protocol

1. Dzień 1: Przygotowanie komórek i odczynników

UWAGA: Wszystkie czynności związane z przygotowaniem komórek i odczynników powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.

1. Ciepło przefiltrowane zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM), płodowa surowica bydlęca (FBS), L-glutamina i penicylina/streptomycyna w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Przygotuj pożywkę z ludzkich fibroblastów skórnych (HDFn) dla noworodków, uzupełniając podgrzany DMEM 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy.
3. Rozmrozić fiolkę z zamrożonymi HDFns i odwirować przez 8 minut przy 200 x g w celu usunięcia pożywki do kriokonserwacji. Zawiesić komórki w przygotowanym pożywce HDFn o gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml i zasiać nasiona w kolbie hodowlanej T-75.
4. Umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO_{2 ),} aby umożliwić namnażanie komórek.
5. Przechowuj nośniki HDFn w temperaturze 4 °C.
6. W razie potrzeby przygotuj odczynniki pro- i antymigracyjne.

2. Dzień 3: Przygotowanie sferoidów

1. Wykonaj następujące czynności w okapie hodowlanym, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.
2. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odessaj pożywkę i dodaj 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Przechowywać kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby całkowicie oderwać komórki od powierzchni kolby.
3. Dodaj 5 ml podgrzanej pożywki do kolby, aby zneutralizować trypsynę.
4. W probówce do mikrowirówki wymieszać 10 μl błękitu trypanowego i 10 μl zawiesiny komórek.
5. Odwirować oryginalną zawiesinę komórkową przez 8 minut przy 200 x g.
6. Podczas wirowania zawiesiny komórek dodać 10 μl zawiesiny komórek błękitu trypanowego do hemocytometru i przeprowadzić zliczanie komórek.
7. Po odwirowaniu należy zassać pożywkę bez usuwania osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w stężeniu 1,25 x 10⁵ komórek/ml.
8. Dodać 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na dno 10 cm szalki Petriego, aby utrzymać nawodnione środowisko podczas wzrostu sferoidów.
9. Odwróć pokrywkę szalki Petriego. Dodać kilka 20 μl kropli zawiesiny komórek na wewnętrzną powierzchnię pokrywki szalki Petriego.
10. Szybko ponownie odwróć pokrywkę i umieść ją z powrotem na dnie naczynia, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli. Rysunek 1 ilustruje pomyślnie uformowane wiszące krople.
11. Ostrożnie umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozwolić sferoidom rosnąć w wiszącej kulturze kroplowej przez okres 72 godzin.

3. Dzień 6: Osadzanie sferoid w matrycy 3D

1. Wykonaj następujące czynności w okapie hodowlanym, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.
2. Aby utworzyć pierwszą warstwę fibryny, należy utworzyć roztwór skrzepu o objętości wystarczającej do dodania 100 μl roztworu skrzepu na dowolną liczbę studzienek (1 sferoida na studzienkę). Skrzepy składają się z 10% 10-krotnego buforu HEPES objętościowo (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl₂, pH 7,4), 2 mg/ml ludzkiego fibrynogenu i 0,1 U/ml ludzkiej alfa-trombiny. Pozostała objętość skrzepu składa się z ultraczystej wody.
   1. Na końcu dodaj trombinę i szybko dodaj roztwór do żądanych dołków na 48-dołkowej płytce, aby zapobiec polimeryzacji skrzepów przed dodaniem do studzienek.
3. Delikatnie potrząśnij/postukaj w płytkę, aby upewnić się, że mieszanina skrzepu fibryny pokrywa całą studzienkę, a następnie umieść płytkę studzienkową w inkubatorze na 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację dolnej warstwy skrzepu. Nie potrząsaj dobrze płytką wystarczająco mocno, aby wywołać tworzenie się pęcherzyków; Po prostu kołysz płytę w razie potrzeby, aż cała studnia zostanie pokryta. Jeśli używane są większe objętości skrzepów, ten krok może nie być konieczny.
4. Przenieś sferoidy do warstwy fibryny.
   1. Wyjąć z inkubatora płytkę studzienkową i szalkę Petriego zawierające sferoidy w wiszącej kulturze kropelkowej i zbadać sferoidy pod mikroskopem. Następnie umieść naczynie w okapie hodowlanym.
   2. Ostrożnie odwróć pokrywę szalki Petriego, aby umożliwić dostęp do wiszących kultur kropelkowych.
   3. Za pomocą igły 21 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml ostrożnie przenieś jedną kroplę z odwróconej pokrywki na środek każdej studzienki, uważając, aby nie przebić spolimeryzowanej warstwy fibryny pokrywającej dno studzienki. Aby skutecznie przenieść kroplę, powoli wciągnij kroplę do igły. Przerwać odciąganie tłoka do tyłu, gdy tylko cała kropla znajdzie się wewnątrz igły; Zbyt daleko cofnięte opadanie może spowodować powstawanie pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić efektywny transfer sferoidów lub późniejsze obrazowanie.
   4. Zbadaj płytkę studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy prawidłowo przeniosły się do wszystkich pożądanych studzienek.
5. W celu utworzenia drugiej warstwy fibryny należy utworzyć kolejny roztwór skrzepu, używając tego samego preparatu, co powyżej, w celu utworzenia pierwszej warstwy fibryny (krok 3.2). Ostrożnie odpipetować 100 μl na każdą kroplę zawierającą sferoidy i ponownie zbadać pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy są nadal nienaruszone i nie zostały zepchnięte na krawędzie studzienek.
6. Umieść płytkę studzienkową z powrotem w inkubatorze i pozwól drugiej warstwie polimeryzować przez 1 godzinę.

4. Dzień 6: Dodanie czynników promigracyjnych lub hamujących

1. Podgrzej nośnik HDFn do 37 °C.
2. Wykonaj następujące czynności w okapie, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
3. Przygotować pożywki dla każdej grupy, w tym odpowiednie stężenia czynników pro/antymigracyjnych, które mają być oceniane.
4. Wyjąć płytkę studzienkową z inkubatora i umieścić w kapturze hodowlanym.
5. Dodać 500 μl pożywek wzorcowych do każdej studzienki kontrolnej grupy sferoidalnej, 500 μl pożywki hamującej do każdej studzienki grupy sferoidalnej hamowanej migracją i 500 μl pożywki promigracyjnej do każdej studzienki grupy sferoidalnej wzmocnionej migracją.
6. Włożyć płytkę studzienki z powrotem do inkubatora.
7. Zmieniaj nośniki co 48 godzin.

5. Dni 6-9: Ocena migracji i proliferacji komórek

1. Obrazowanie sferoid za pomocą mikroskopii jasnego pola natychmiast po dodaniu pożywki (0 h), a następnie co 24 godziny przez 72 godziny. Opcjonalnie: w każdym punkcie czasowym wykonaj obraz stosu z osią Z, aby określić, czy migracja zachodzi w płaszczyznach poza głównym obszarem ostrości. Z naszego doświadczenia wynika, że tak nie jest; Warto jednak upewnić się, że tak jest w każdym eksperymencie.
2. Użyj ImageJ, aby określić wzrost komórek w każdej studzience, analizując procentowy wzrost obszaru dla każdej sferoidy, śledząc granicę komórki dla każdej sferoidy w każdym kolejnym punkcie czasowym i używając funkcji "Zmierz", aby uzyskać powierzchnię.

Results

Hodowla sferoidów może być wykorzystana do skutecznej oceny wpływu czynników pro i antymigracyjnych na migrację fibroblastów in vitro
Sferoidy fibroblastów 3D mogą być formowane przez hodowlę wiszących kropli przez okres 72 godzin (Rysunek 1). Po okresie hodowli sferoidy są osadzane w matrycy skrzepu i obrazowane za pomocą mikroskopii jasnego pola (Ryc. 2). Początkowe obszary sferoid (przedstawione na rysunku jako obszary ograni...

Discussion

Protokół ten pozwala na badanie migracji komórek w ECM związanych z gojeniem się ran za pomocą modelu 3D in vitro . Kluczowym krokiem w prawidłowym wykonaniu zabiegu jest prawidłowy rozwój sferoid fibroblastów; Stężenie komórek podczas przygotowania zostało zoptymalizowane, aby uzyskać początkowe stężenie 2500 komórek/kroplę, co pozwoliło na niezawodne tworzenie sferoid w okresie inkubacji wynoszącym 72 godziny. Jeśli użyta zostanie niewystarczająca liczba komórek, sferoidy mogą nie agregować się skutecznie i mo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiały
, 4,5 g/l glukozy, z pirogronianem sodu, bez L-glutaminy	VWR	VWRL0148-0500	DMEM już zawierające L-glutaminę może być również używane
Naczynie do hodowli tkankowych 100 mm, niepoddane obróbce, sterylizowane, niepirogenne	VWR	10861-594	Naczynia o dowolnej wielkości mogą być używane do zawieszania kultur kroplowych
Płodowa surowica bydlęca z krajów zatwierdzonych przez USDA, inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana, testowana na hodowlach komórkowych	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamina	Fisher Scientific	ICN1680149	Nie jest potrzebna w przypadku stosowania DMEM, który zawiera już L-glutaminę
Roztwór penicyliny-streptomycyny stabilizowany, sterylnie filtrowany, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny / ml	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Ludzkie fibroblasty skórne, noworodkowe	Thermo Fisher	C0045C	Można zastąpić innym typem komórek zainteresowania
Igła 21 G x 1 1/2	BD	305167	Będą działać również igły 22 G x 1 1/2
strzykawka 1 ml	VWR	89174-491	Można używać strzykawek o dowolnej objętości
Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, polistyren, Greiner Bio-One (pakowany indywidualnie) (48 dołków)	VWR	82051-004
Ludzki fibrynogen - plazminogen, czynnik von Willebranda i fibronektyna	Laboratoria Badawcze Enzymów	FIB 3	Można zastąpić interesującym białkiem macierzy
Ludzkie Laboratoria Badawcze Enzymów	Alfa Trombiny	HT 1002a	Może nie być konieczne w zależności od interesującego białka matrycy
Equipment
			do hodowli komórkowych BSL2
Inkubator
Mikroskop odwrócony z obiektywem
Kompatybilna z wirówką z probówkami