Artykuł metodologiczny

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

DOI:

10.3791/56100

⸱

3 października 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rurki wielokomórkowe, podstawowe jednostki wszystkich organów wewnętrznych, składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonkowych lub śródbłonka, z błonami wierzchołkowymi wyściełającymi światło i błony podstawno-boczne stykające się ze sobą i/lub macierzą zewnątrzkomórkową. W jaki sposób ta charakterystyczna asymetria błon jest ustalana i utrzymywana podczas morfogenezy narządów, jest nadal nierozwiązaną kwestią biologii komórki. Protokół ten opisuje jelito C. elegans jako model do analizy biogenezy błony spolaryzowanej podczas morfogenezy rurki, z naciskiem na biogenezę błony wierzchołkowej i światła. Dwudziestokomórkowy jednowarstwowy nabłonek jelitowy C. elegans jest ułożony w prostą obustronnie symetryczną rurkę, umożliwiającą analizę na poziomie pojedynczej komórki. Polaryzacja błony zachodzi jednocześnie ze spolaryzowanym podziałem i migracją komórek podczas wczesnej embriogenezy, ale de novo spolaryzowana biogeneza błony trwa przez cały okres wzrostu larw, kiedy komórki już się nie namnażają i nie poruszają. To ostatnie ustawienie pozwala na oddzielenie zmian subkomórkowych, które jednocześnie pośredniczą w tych różnych procesach polaryzacji, trudnych do rozróżnienia w większości modeli polaryzacji. Składniki błony wierzchołkowej, podstawno-bocznej, połączeniowej, cytoszkieletu i endobłony mogą być znakowane i śledzone przez cały okres rozwoju za pomocą białek fuzyjnych GFP lub oceniane przez barwienie przeciwciał in situ. Wraz z genetyczną wszechstronnością organizmu, jelito C. elegans stanowi unikalny model in vivo do wizualnej, rozwojowej i molekularnej analizy genetycznej biogenezy spolaryzowanej błony i rurki. Opisane tutaj konkretne metody (wszystkie standardowe) obejmują: znakowanie subkomórkowych składników jelitowych przez barwienie przeciwciałami; analizować geny zaangażowane w biogenezę błon spolaryzowanych poprzez badania utraty funkcji dostosowane do zazwyczaj niezbędnych genów tubulogenezy; oceniać wady polaryzacji na różnych etapach rozwoju; interpretować fenotypy za pomocą epifluorescencji, różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i mikroskopii konfokalnej; określić ilościowo wady wzroku. Protokół ten można dostosować do analizy dowolnej z często wysoce konserwatywnych cząsteczek zaangażowanych w polaryzację nabłonka, biogenezę błony, morfogenezę rurki i światła.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie asymetrii komórkowych i subkomórkowych, takich jak tworzenie spolaryzowanych domen błonowych, jest kluczowe dla morfogenezy i funkcji komórek, tkanek i organów1. Badania nad biogenezą błon spolaryzowanych w nabłonku pozostają wyzwaniem technicznym, ponieważ zmiany kierunkowe w alokacji składników subkomórkowych zależą od wielu następujących po sobie i pokrywających się sygnałów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, które są trudne do rozdzielenia w większości modeli i silnie zależą od systemu modelowego. Prezentowany tutaj model - jednowarstwowe jelito Caenorhabditis elegans - to tkanka o wyjątkowej prostocie. Wraz z jednokomórkowym kanałem wydalniczym C. elegans (patrz towarzyszący artykuł na temat biogenezy spolaryzowanej błony w kanale wydalniczym C. elegans)2, zapewnia kilka unikalnych korzyści w identyfikacji i charakterystyce cząsteczek wymaganych do biogenezy spolaryzowanej błony. Zachowanie wskazówek polarności molekularnej od drożdży do człowieka sprawia, że ten prosty narząd bezkręgowców jest doskonałą "komorą tkankową in vivo" do odpowiedzi na pytania dotyczące polaryzacji nabłonka, które mają bezpośrednie znaczenie dla systemu ludzkiego, który jest nadal zbyt złożony, aby umożliwić wizualną analizę tych zdarzeń na poziomie pojedynczej komórki in vivo.

Chociaż zidentyfikowano wiele zachowanych wskazówek polaryzacji z (1) macierzy zewnątrzkomórkowej, (2) błony plazmatycznej i jej połączeń oraz (3) wewnątrzkomórkowego transportu pęcherzykowego3, podstawowe zasady ich integracji w procesie biogenezy spolaryzowanej błony nabłonkowej i tkanki są słabo poznane4. Klasyczne modele pojedynczej komórki in vivo (np. S. cerevisiae i zygota C. elegans) odegrały zasadniczą rolę w zdefiniowaniu zasad spolaryzowanego podziału komórek i polaryzacji przednio-tylnej oraz zidentyfikowały krytyczne determinanty polaryzacji związane z błoną (małe GTPazy/CDC-42, PAR z wadliwym podziałem)5,6, ale zależą one od unikalnych sygnałów łamania symetrii (blizna pączka, wnikanie plemnika) i nie mają zabezpieczonych połączeniami domen błony wierzchołkowej i, przypuszczalnie, odpowiadającej im wewnątrzkomórkowej maszynerii sortowania apikopodstawnego. Nasza obecna wiedza na temat organizacji spolaryzowanego transportu w nabłonku opiera się jednak przede wszystkim na monokulturach 2D ssaków7, które nie mają fizjologicznych zewnątrzkomórkowych i rozwojowych wskazówek, które mogłyby zmieniać pozycje domen błonowych i kierunki trajektorii transportu (samo przejście z systemów hodowli in vitro 2D na 3D wystarcza do odwrócenia polaryzacji błony w komórkach MDCK (Madin-Darby canine nerney)8. Badania rozwojowe in vivo nad polaryzacją nabłonka w modelowych organizmach bezkręgowców początkowo przeprowadzono w płaskim nabłonku, na przykład w naskórku Drosophila melanogaster, gdzie zidentyfikowano krytyczny wpływ dynamiki połączeń na spolaryzowaną migrację komórek i ruch arkusza komórkowego9 oraz transportu endocytarnego dla utrzymania polarności10. Analiza 3D in vitro i in vivo morfogenezy światła w nabłonku kanalików w komórkach MDCK i w jelicie C. elegans zidentyfikowała ostatnio wymóg transportu wewnątrzkomórkowego dla biogenezy i pozycjonowania domeny de novo (wierzchołkowej) i światła11,12,13. Grubość rurkowatych (w porównaniu z płaskimi) komórkami nabłonkowymi jest zaletą w analizie 3D asymetrii subkomórkowych, ponieważ pozwala na lepsze wizualne rozróżnienie błony wierzchołkowo-świetlnej, połączeń wierzchołkowo-bocznych, błony bocznej i pozycji organelli wewnątrzkomórkowych. Do tych zalet wizualnych model C. elegans dodaje ustawienie in vivo, oś rozwojową, przezroczystość, prostotę planu ciała, niezmienniczą i zdefiniowaną linię komórkową, zalety analityczne (genetyczne) i dodatkowe opisane poniżej.

C. elegans sam w sobie jest glistą o rurkowatej budowie, której przezroczystość i prosta architektura sprawiają, że podobnie rurkowate organy wewnętrzne są bezpośrednio dostępne do wizualnej analizy morfogenezy rurki i światła. Dwadzieścia komórek jego jelita (czasami 21 lub 22 komórek)14 pochodzą z pojedynczej komórki progenitorowej (E) i rozwijają się z dwuwarstwowego nabłonka przez jeden etap interkalacji do obustronnie symetrycznej rurki z dziewięcioma pierścieniami INT (cztery komórki w pierwszym pierścieniu; Rysunek 1 schemat)14,15,16. Analiza pochodzenia i tkanek jelita, początkowo określona przez optykę Nomarskiego za pomocą tożsamości jądrowych17, a następnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą znakowanych błon, dostarczyła krytycznych informacji na temat jego morfogenezy, w szczególności wymagań autonomicznej i nieautonomicznej komórki dla jej kierunkowych podziałów i ruchów komórek (np. interkalacja, asymetrie prawo-lewo, obrót rurki przedniej i tylnej)14,18. Wczesna specyfikacja komórek endodermalnych i sieć regulacyjna genów kontrolujących rozwój tego klonalnego narządu modelowego są dobrze scharakteryzowane19,20. Nacisk kładziony jest jednak na analizę biogenezy spolaryzowanej błony i światła w pojedynczych komórkach kanalików oraz asymetrii wewnątrzkomórkowych endomembran, struktur cytoszkieletu i organelli, które towarzyszą temu procesowi. Analizę ułatwia prostota tej rurki, w której wszystkie błony wierzchołkowe (na poziomie ultrastrukturalnym wyróżnione mikrokosmkami) są skierowane w stronę światła, a wszystkie błony podstawne są skierowane w stronę zewnętrznej powierzchni rurki, przy czym błony boczne stykają się ze sobą, oddzielone od błony wierzchołkowej połączeniami (Rysunek 1 schemat; patrz referencje (16,21) dla C. elegans-specyficzna organizacja elementów złącza szczelnego i przylegającego). Biogeneza błony wierzchołkowej zbiega się zatem z morfogenezą światła. Co więcej, wielkość dorosłych komórek jelitowych - największych komórek tego małego zwierzęcia (z wyjątkiem komórki wydalniczej) - jest zbliżona do wielkości komórki ssaka, co pozwala na wizualne śledzenie in vivo elementów subkomórkowych, np. trajektorii pęcherzyków, co zwykle próbuje się uzyskać in vitro w szalce hodowlanej.

Dla celów tej analizy komórkowej i subkomórkowej, odpowiednie etykietowanie jest krytyczne. Domeny błony endo- lub plazmatycznej jelit, połączenia, struktury cytoszkieletu, jądra i inne organelle subkomórkowe można uwidocznić poprzez znakowanie ich specyficznych składników molekularnych. Wiele takich komponentów zostało scharakteryzowanych i nadal jest odkrywanych (Tabela 1 zawiera kilka przykładów i odnosi się do zasobów). Na przykład zidentyfikowano różne cząsteczki odróżniające kanalikowe i/lub pęcherzykowe przedziały układu endomembranowego jelita, od ER do Golgiego przez pęcherzyki post-Golgiego do błony plazmatycznej22. Określone białka (a także lipidy i cukry) mogą być znakowane bezpośrednio lub pośrednio poprzez białka wiążące. Protokół ten koncentruje się na barwieniu przeciwciał in situ utrwalonych próbek, jednej z dwóch standardowych technik znakowania (patrz towarzyszący artykuł na temat tubuogenezy kanału wydalniczego w celu zapoznania się z opisem drugiej techniki2 - znakowanie in vivo za pomocą fluorescencyjnych fuzji białek - która ma bezpośrednie zastosowanie w jelicie; Tabela 2 zawiera przykłady promotorów specyficznych dla jelit, które można wykorzystać do kierowania ekspresją takich białek fuzyjnych do jelita). Podwójne lub wielokrotne znakowanie z dowolnym podejściem lub z kombinacją obu plus dodatkowe barwienie chemiczne, pozwala na większą dogłębną rozdzielczość wizualną oraz badanie przestrzennych i czasowych zmian w kolokalizacji i rekrutacji określonych cząsteczek lub składników subkomórkowych (Rysunek 2). Procedury utrwalania i barwienia opisane w tym protokole wspierają zachowanie znakowania białka zielonej fluorescencji (GFP) podczas procedur barwienia immunologicznego. Do obrazowania opisano kluczowe punkty wykrywania i charakterystyki fenotypów tuburogenezy za pomocą standardowych procedur mikroskopowych (preparacja fluorescencyjna i mikroskopia konfokalna) (Rysunek 3, 4). Można je rozszerzyć na metody obrazowania o wyższej rozdzielczości, na przykład mikroskopię superrozdzielczą i transmisyjną mikroskopię elektronową (nieopisane tutaj).

Kluczową zaletą tego systemu jest możliwość analizy polaryzacji w poszczególnych komórkach na różnych etapach rozwoju, od embriogenezy do dorosłości. Na przykład wierzchołkową domenę błonową i biogenezę światła można śledzić przez cały okres rozwoju na poziomie pojedynczej komórki poprzez znakowanie ERM-1, wysoce konserwatywnym łącznikiem błonowo-aktynowym z rodziny Ezrin-Radixin-Moesin23,24. ERM-1 wizualizuje biogenezę błony wierzchołkowej (1) podczas morfogenezy rurki embrionalnej, gdy zachodzi ona jednocześnie ze spolaryzowanym podziałem i migracją komórek (komórki poruszają się wierzchołkowo wokół światła podczas interkalacji)15; (2) podczas późnego wydłużania się rurki zarodkowej i larwalnej, które przebiega przy braku podziału lub migracji komórek; oraz (3) w jelicie dorosłego, gdzie utrzymywane są spolaryzowane domeny błonowe (Ryc. 1). W rozszerzającym się postmitotycznym nabłonku larw biogeneza błony spolaryzowanej de novo może być zatem oddzielona od morfogenezy spolaryzowanej tkanki, co nie jest możliwe w większości modeli polaryzacji nabłonka in vivo i in vitro, w tym tych z rozdzielczością pojedynczej komórki (np. model torbieli 3D MDCK8). Dzięki znakowaniu innych składników, to ustawienie daje możliwość (szczególnie w stadium larwalnym L1, kiedy komórki mają wyższy stosunek cytoplazmy do jądra) odróżnienia tych zmian wewnątrzkomórkowych, które są specyficzne dla biogenezy spolaryzowanej błony (np. Reorientacja trajektorii transportu) od tych, które są jednocześnie wymagane do spolaryzowanego podziału i migracji komórek.

Wszechstronność genetyczna C. elegans jest dobrze znana25i czyni z niej potężny system modelowy do analizy molekularnej każdego zagadnienia biologicznego. Na przykład badania nad morfogenezą można rozpocząć od szczepu typu dzikiego, szczepu transgenicznego, w którym struktura będąca przedmiotem zainteresowania (np. błona) jest znakowana markerem fluorescencyjnym, lub od mutanta powodującego utratę lub zysk funkcji z defektem tej struktury. Typowe odwrotne badanie genetyczne może wygenerować mutanta, w którym gen będący przedmiotem zainteresowania jest usunięty w linii zarodkowej (np. przez celowaną delecję), zmodyfikowany przez mutagenezę (zwykle powodując mutacje punktowe z wynikającą z tego utratą, zmniejszeniem lub wzrostem funkcji genu) lub gdzie jego transkrypt jest zredukowany przez RNAi. Łatwość tworzenia RNAi poprzez żerowanie w C. elegans26 nadaje się również do projektowania ukierunkowanych badań przesiewowych, które badają większą grupę genów będących przedmiotem zainteresowania. Prawdopodobnie największą siłą organizmu modelu genetycznego jest zdolność do przeprowadzania badań przesiewowych in vivo (np. mutagenezy, systematycznych lub obejmujących cały genom badań przesiewowych RNAi), które pozwalają na bezstronne badanie molekularnej przyczyny fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, bezstronne wizualne badanie przesiewowe tubuogenezy RNAi C. elegans, zaczynając od transgenicznego zwierzęcia z błonami wierzchołkowymi znakowanymi ERM-1, odkryło intrygującą odwracalną konwersję polaryzacji jelit i fenotyp światła ektopowego, wykorzystany tutaj jako przykład dla tego typu analizy. To badanie przesiewowe zidentyfikowało wyczerpanie glikosfingolipidów (GSL; obligatoryjne lipidy błonowe, identyfikowane przez ich enzymy biosyntetyczne GLS) oraz składników klatryny płaszcza pęcherzykowego i jej adaptora AP-1 jako specyficzne defekty molekularne powodujące ten fenotyp konwersji polarności, charakteryzując w ten sposób te cząsteczki transportujące jako wskazówki in vivo dla polaryzacji błony wierzchołkowej i pozycjonowania światła12,13. Rozpoczynając od określonego fenotypu mutacji genetycznej/morfogenezy, takie badania przesiewowe (lub pojedyncze eksperymenty interakcji genetycznej/RNAi) mogą również badać funkcjonalne interakcje między dwoma lub wieloma genami będącymi przedmiotem zainteresowania (zobacz towarzyszący artykuł na temat kanału wydalniczego dla przykładu takiej analizy)2. Protokół ten koncentruje się na RNAi, który oprócz zdolności do bezpośredniej identyfikacji genu, którego utrata powoduje fenotyp w badaniach przesiewowych, zapewnia określone korzyści w analizie morfogenezy. Ponieważ produkty genów kierujące morfogenezą często działają w sposób zależny od dawki, RNAi zwykle z powodzeniem generuje spektrum fenotypów. Zdolność do generowania informacyjnych fenotypów częściowej utraty funkcji pomaga również rozwiązać problem polegający na tym, że większość ważnych genów tubuogenezy jest niezbędna, a ich utrata powoduje bezpłodność i wczesną śmiertelność zarodka. Protokół ten obejmuje warunkowe strategie RNAi w celu przezwyciężenia tej trudności i sugeruje sposoby optymalizacji generowania szerszego spektrum fenotypów, takich jak seria alleliczna wytwarzana przez mutagenezę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 . Znakowanie jelita C. elegans

Uwaga: Zobacz załączony artykuł autorów na temat analizy tubuogenezy kanału wydalniczego2 dla budowy specyficznych tkankowo plazmidów markerów fluorescencyjnych i generowania transgenicznych zwierząt, w tym dyskusji na temat transkrypcyjnych i translacyjnych białek fuzyjnych (te ostatnie wymagane do subkomórkowej lokalizacji interesującej nas cząsteczki). Procedury te można dostosować poprzez zastosowanie określonych promotorów do kierowania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do jelita. W Tabeli 1 przedstawiono przykłady cząsteczek, które okazały się przydatne do wizualizacji błon wewnętrznych i plazmatycznych jelit C. elegans oraz ich połączeń, w Tabeli 2 przedstawiono przykłady promotorów napędzających ekspresję w jelicie, a w Tabeli 3 przedstawiono zasoby dotyczące bardziej kompleksowych zbiorów markerów jelitowych i promotorów.

  1. Barwienie przeciwciałami w jelicie C. elegans27,28
    1. Utrwalenie
      1. Weź czyste szkiełko i użyj poli-L-lizyny, aby wytworzyć cienką warstwę, na której mogą przykleić się robaki. Umieść 30 μl 0,1-0,2% poli-L-lizyny na szkiełku podstawowym i umieść drugie szkiełko na kropli poli-L-lizyny, aby zrobić "kanapkę". Następnie delikatnie przetrzyj szkiełka kilka razy, aby zwilżyć całą powierzchnię obu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Oznacz matową stronę szkiełek ołówkiem.
        Uwaga: 0,2% alikwot poli-L-lizyny o objętości 200 μl otrzymano przez rozpuszczenie proszku w dH2O; można go przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyj poli-L-lizyny o wysokiej masie cząsteczkowej, aby poprawić przywieranie robaków. Krytyczne znaczenie ma również stężenie poli-L-lizyny. Zbyt niskie stężenia nie pozwolą robakom się przykleić, ale zbyt wysokie stężenia mogą generować fluorescencyjny sygnał tła. Zbyt gruba folia może poluzować się w całości.
      2. Umieść płaski metalowy klocek mocno na dnie pojemnika (np. pojemnika polistyrenowego) wypełnionego ciekłym azotem.
        UWAGA: Zamiast tego można użyć suchego lodu, ale ciekły azot utrzymuje metalowy blok bardziej stabilnie na dnie pojemnika i dobrze chłodzi.
      3. Zbieraj robaki, zmywając je z talerzy za pomocą M929 lub wybierz różne stadia robaków (jaja, robaki L1, L2, L3 lub L4) na każdym slajdzie. Zazwyczaj wybieraj ~100 larw i zarodków lub ~20 dorosłych na każdy slajd. Umieść 10 μl zmytych robaków na środku szkiełka lub zbierz jaja/robaki do 10 μl M9 lub 10 μL 1x PBS27 (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
        1. Użyj pipety, aby rozprowadzić dużą liczbę robaków, aby uniknąć zbrylania.
          Uwaga: Mieszane populacje wypłukanych robaków, ze względu na stłoczenie i różną grubość etapów, nie przylegają dobrze i są mniej efektywnie pękane przez zamrażanie (patrz poniżej), dlatego wybieranie robaków specyficznych dla danego etapu (lub zsynchronizowanych populacji) daje lepsze wyniki. Larwy trzymają się lepiej niż dorosłe osobniki, a na jednym szkiełku można umieścić więcej zwierząt.
        2. Przed pobraniem robaków na szkiełka przenieś je na płytkę z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)29 bez bakterii OP50. Nadmiar bakterii przylegających do robaków może również przeszkadzać w przywieraniu. Uważaj, aby robaki nie wyschły.
      4. Delikatnie umieścić (upuścić) szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm × 22 mm w poprzek na zebranych robakach tak, aby jego krawędzie zwisały co najmniej z jednej strony szkiełka. Delikatnie ale stanowczo dociśnij jednym lub dwoma palcami do szkiełka nakrywkowego. Unikaj ścinania, które może uszkodzić integralność tkanek.
      5. Natychmiast i delikatnie przenieś szkiełko na metalowy blok w ciekłym azocie i pozostaw na około 5 minut do zamrożenia. Następnie jednym szybkim ruchem "zdjąć" szkiełko nakrywkowe, używając wystającej krawędzi.
        Uwaga: Ten krok należy wykonać zdecydowanie i podczas zamrożenia szkiełka, aby uzyskać "pękanie" naskórka. Ostrzeżenie: Podczas pracy z ciekłym azotem należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi środków ochrony osobistej (PPE).
      6. Zanurzyć szkiełka mrożone w szklanym słoiku z kopliny wypełnionym metanolem na 5 minut w temperaturze -20 °C. Następnie przenieść do wypełnionego acetonem szklanego słoika Coplin na kolejne 5 minut w temperaturze -20 °C.
        Uwaga: Metanol i aceton należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Po utrwaleniu szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C. UWAGA: metanol i aceton są toksyczne.
      7. Wyjmij szkiełka ze słoika i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej (RT) przed użyciem.
    2. Barwienia
      1. Otocz obszar utrwalonych robaków cienką warstwą wazeliny na szkiełku. Narysuj okrąg wokół tego obszaru na spodniej stronie szkiełka, aby zaznaczyć to miejsce.
        Uwaga: Bardzo ważne jest, aby krąg galaretki pozostał nienaruszony przez całą procedurę barwienia, aby zapobiec wyciekaniu roztworów barwiących.
      2. Przygotuj "mokrą komorę" w plastikowym pojemniku z pokrywką, umieszczając w niej mokre ręczniki papierowe. Umieść szkiełko na stojaku w tej "mokrej komorze", aby zapobiec wysychaniu szkiełek podczas barwienia.
        Uwaga: Szkiełka nie powinny stykać się z wodą ani ze sobą.
      3. Delikatnie odpipetować około 50 μl 1x PBS do koła galaretki, wystarczająco dużo, aby pokryć obszar. Zamknij "mokrą komorę" pokrywą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
        Uwaga: Aby uniknąć utraty robaków na tym etapie, nie należy pipetować PBS bezpośrednio na robaki. Delikatnie umieść końcówkę pipety na krawędzi koła i pozwól, aby płyn płynnie rozproszył się po robakach.
      4. Przechyl szkiełko i powoli zasysaj PBS za pomocą pipety. Umieść szkiełko z powrotem płasko na ruszcie i ostrożnie dodaj 50 μl (lub wymaganą ilość, aby pokryć miejsce) roztworu blokującego. Inkubować w mokrej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Czekając, rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym (przykłady przeciwciał pierwszorzędowych i stężeń znajdują się w Tabeli Materiałów).
        nuta: Świeżo przygotuj roztwór blokujący, używając 1x PBS (10 ml), 10% tween (50 μL) i mleka w proszku (0,2 g). Ilość detergentu i stężenie mleka mogą się różnić w zależności od zastosowanych przeciwciał i mogą wymagać empirycznego określenia. Aspiracja płynu ze zjeżdżalni to kolejny krok do łatwej utraty robaków. Sprawdź postępy, badając szkiełko pod lunetą sekcyjną, ale uważaj, aby szkiełko nie wyschło.
      5. Przechylić szkiełko i odessać roztwór blokujący, stosując te same środki ostrożności, jak opisano powyżej. Umieść szkiełko z powrotem płasko na stojaku i powoli dodawaj 50 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego, zachowując te same środki ostrożności. Zamknąć "mokrą komorę" i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc lub przez krótszy czas w temperaturze RT.
        Uwaga: Może być konieczne empiryczne określenie czasu inkubacji dla określonego przeciwciała.
      6. Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, tak jak w przypadku innych roztworów. Następnie myć szkiełka roztworem blokującym przez 10 minut, 3 razy, dodając i usuwając roztwór w taki sam sposób, jak opisano powyżej.
      7. Dodać wtórne (znakowane fluorescencyjnie) przeciwciało rozcieńczone w roztworze blokującym, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z przykładami przeciwciał drugorzędowych i stężeń.
      8. Usunąć przeciwciało wtórne i przemyć, jak wyżej, roztworem blokującym 2 razy i, w celu usunięcia roztworu blokującego, 1x PBS, przez 10 minut każdy.
      9. Odessać jak najwięcej PBS, nie dopuszczając do wyschnięcia próbki i ostrożnie usunąć galaretkę wokół próbki.
      10. Dodaj jedną kroplę podłoża mocującego na próbkę i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Umieść szkiełka w ciemnym pudełku na szkiełka, aby zachować plamy i przechowuj w temperaturze 4 °C.
        Uwaga: Trzymaj slajdy w ciemności ze względu na wrażliwość na światło (fluorescencja może z czasem blaknąć) i zapobiegaj ekspozycji na powietrze, trzymając je szczelnie, z tego samego powodu. Szkiełka mogą być przechowywane przez dłuższy czas w temperaturze 4 °C lub -20 °C.

2. Zakłócenie funkcji niezbędnych genów tubuogenezy w jelicie C. elegans. Przykład: RNAi.

Uwaga: szczepy C. elegans są hodowane na bakteriach OP50 wysiewanych na płytkach NGM zgodnie ze standardowymi protokołami29. W przypadku RNAi, C. elegans żywią się bakteriami HT115 RNAi na płytkach RNAi uzupełnionych 25 μg/ml karbenicyliny i 2 mM IPTG (beta-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu) w celu indukcji promotora bakteryjnego, który generuje dwuniciowy RNA (dsRNA) z wprowadzonego genu C. elegans. Antybiotyki i stężenie IPTG mogą się różnić w zależności od klonu/biblioteki RNAi i pożądanej siły RNAi. Specyficzne klony RNAi można uzyskać z dostępnych na rynku bibliotek odżywiania RNAi dla całego genomu (zobacz (26,30,31) w celu uzyskania informacji na temat karmienia RNAi u C. elegans oraz Tabeli materiałów dla materiałów/odczynników i bibliotek RNAi).

  1. Standardowe RNAi przez karmienie26,31
    1. Wyjmij płytkę z biblioteki RNAi z -80 °C i połóż ją na suchym lodzie. Usuń taśmę uszczelniającą i użyj sterylnej końcówki pipety, aby przenieść przylegające bakterie z klonu będącego przedmiotem zainteresowania na płytki agarowe LB (Luria Broth) 29 uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny i 15 μg/ml tetracykliny. Usuń bakterie na płytkę agarową. Uszczelnij płytkę biblioteki RNAi nową taśmą uszczelniającą. Hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Te płytki agarowe mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Nowe bakterie mogą być hodowane bezpośrednio z nich, aby chronić oryginalną bibliotekę RNAi.
    2. Następnego dnia zaszczepij bakterie RNAi z płytki agarowej LB w 1 ml płynnego podłoża LB < sup class="xref">29 zawierającego 50 μg/ml ampicyliny każdy i wstrząsaj przez 14 (8-18) godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Aby uzyskać optymalne rezultaty, za każdym razem używaj świeżych bakterii. Zobacz odniesienie (30) w celu porównania różnych warunków hodowli (np. czasu hodowli).
    3. Następnego dnia wysiewaj 200 μl na klon hodowanych bakterii RNAi na oddzielnych płytkach RNAi. Pozostaw płytki do wyschnięcia i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej w celu indukcji promotora bakteryjnego.
    4. Przenieś 4 - 6 larw w stadium L4 na każdą płytkę RNAi. Inkubować wysiane płytki RNAi w temperaturze pokojowej lub 22 °C przez 3-5 dni.
      nuta: Najpierw zbierz larwy L4 na płytkę NGM bez bakterii, aby usunąć przylegający OP50, który będzie zakłócał działanie RNAi, lub trzykrotnie przenieś je na nową płytkę NGM bez OP50. Upewnij się, że szczepy nie są zanieczyszczone, ponieważ bakterie zanieczyszczające - takie jak preferowany pokarm OP50 dla robaków - również będą zakłócać działanie RNAi. Dostosuj temperaturę w razie potrzeby: np. rozwój przyspiesza wraz z wyższą temperaturą; Szczepy mogą być wrażliwe na temperaturę.
    5. W przypadku badań rozwojowych należy sprawdzić fenotypy potomstwa F1 od 2 dnia.
      Uwaga: Bardzo ważne jest, aby często badać zwierzęta, aby uniknąć przeoczenia pojawienia się lub progresji fenotypu (np. przemieszczenia markera) podczas oceny biogenezy spolaryzowanej błony podczas rozwoju. Wzbogacenie populacji F2 o silne fenotypy (np. poprzez wybór rodzicielskich hermafrodytów na nową płytkę RNAi w 2 dniu w celu wyselekcjonowania najsilniej dotkniętej środkowej części ich potomstwa) jest rzadko konieczne, ponieważ pożądane jest spektrum od łagodnych do silnych fenotypów.
  2. Warunkowe RNAi
    UWAGA: Warunki RNAi mogą być modyfikowane w celu zmniejszenia nasilenia lub zwiększenia łagodnych efektów lub w celu zakłócenia specyficznego dla etapu; Modyfikacje są pomocne w pełnej ocenie fenotypowych skutków często śmiertelnych genów cewkogenezy.
    1. Larwalne RNAi - ocena wpływu RNAi w tym samym pokoleniu (łagodne, specyficzne dla stadium RNAi)
      Uwaga: Aby przezwyciężyć bezpłodność lub śmiertelność zarodka lub zakłócić funkcję genu na określonym etapie po embriogenezie, RNAi jest indukowane u larw, po embrionalnym. Umieścić niepoddane działaniu substancji jajowej (2.2.1.1), dorosłe osobniki (2.2.1.2) lub zsynchronizowane larwy L1 (lub, w razie potrzeby, w późniejszym stadium) larwy (2.2.1.3) na płytkach RNAi; ocenić wpływ RNAi w tym samym pokoleniu, np. dwa dni później i później, u larw i/lub osobników dorosłych.
      1. Zebrać 30-50 ciężarnych dorosłych osobników do jednej kropli roztworu wybielającego (roztwór 1: 4 10 M NaOH i domowego podchlorynu sodu) umieszczonego na krawędzi płytki RNAi. Pozostaw do wyschnięcia i pozwól L1 wykluć się i przenieść na trawnik bakteryjny.
        Uwaga: Roztwór wybielający, zwykle stosowany do odkażania, zabije wszystko oprócz zarodków w skorupkach jaj. Dlatego nie należy umieszczać roztworu wybielającego na bakteriach RNAi ani w ich pobliżu.
      2. Zbierz lub wysiej ~20 młodych dorosłych dorosłych na płytce RNAi i pozwól im składać jaja przez 2-3 godziny lub do momentu, gdy na talerzu pojawi się około 300 jaj, a następnie oderwij dorosłe osobniki.
        Uwaga: Ta metoda może spowodować zanieczyszczenie bakterii RNAi przez OP50. Aby zmniejszyć to ryzyko, najpierw przenieś dorosłe osobniki na płytkę NGM bez bakterii, aby usunąć OP50 przylegający do robaków. Należy uważać, aby dorośli nie przebywali zbyt długo na płytkach RNAi, aby uniknąć wpływu RNAi na zarodki.
      3. Wybierz lub umieść robaki etapowe L1 bezpośrednio na płytkach RNAi (patrz odniesienie (29)-dla protokołów synchronizacji).
        Uwaga: Można użyć skróconego protokołu synchronizacji (np. dla konfiguracji na umiarkowanie dużą skalę), myjąc robaki z gęsto zaludnionych płytek M9 kilka razy, aż pozostaną tylko jaja. Po 2-3 godzinach wylęgu L1 można następnie zebrać w M9 z tych płytek, oczyścić przez dodatkowe płukanie w celu usunięcia bakterii (3x w M9) i wysiać na płytki RNAi.
    2. Rozcieńczanie bakterii RNAi pustymi bakteriami wektorowymi RNAi (łagodne RNAi)
      Uwaga: Zmniejszenie ilości dsRNA poprzez rozcieńczenie ilości bakterii RNAi może wystarczyć do wywołania łagodniejszych efektów, a także może zmniejszyć śmiertelność zarodka bez zniesienia wszystkich skutków embrionalnych. Rozcieńczanie bakterii RNAi jest również stosowane w eksperymentach z podwójnym RNAi oraz do miareczkowania warunków eksperymentów interakcji genetycznych (np. w celu uzyskania łagodnych efektów w celu oceny wzmocnienia i silnych efektów w celu oceny supresji).
      1. Hoduj RNAi i puste wektory RNAi HT115 w 1 ml pożywki LB z 50 μg / ml ampicyliny, tak jak to ma miejsce w standardowych warunkach RNAi.
      2. Rozcieńczyć bakterie RNAi pustymi bakteriami wektorowymi RNAi, aby uzyskać szereg różnych stężeń, na przykład 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Dobrze wymieszaj bakterie, pipetując w górę iw dół. Odpipetować 200 μl zmieszanych bakterii na płytkę RNAi.
      3. Wybierz 4-6 larw L4 na każdej płytce RNAi. Sprawdź fenotyp od 2 dnia.
    3. Szczepy wrażliwe na RNAi (silne RNAi)
      1. Użyj dostępnych szczepów wrażliwych na RNAi, na przykład eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) lub eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (ten ostatni nadwrażliwy) i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami RNAi opisanymi w 2.131,32,33.
        Uwaga: Szczepy wrażliwe na RNAi (np. rrf-3i eri-1) mogą mieć mniejsze rozmiary lęgu niż zwierzęta typu dzikiego i być sterylne w temperaturze 25 °C. Mogą również mieć niskie tło własnych fenotypów, np. śmiertelność zarodkową o niskiej penetracji, którą należy wziąć pod uwagę przy ocenie określonych efektów RNAi.

3. Obrazowanie in vivo jelita C. elegans za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Przed wizualizacją zwierząt w świetle fluorescencyjnym sprawdź płytki RNAi w jasnym świetle pod dowolnym mikroskopem preparacyjnym. Oceń (i potencjalnie zapisz) fenotypy widoczne w jasnym świetle, które mogą mieć wpływ na analizę, takie jak śmiertelność, bezpłodność (mniejsza liczba potomstwa), rozwojowe (np. zatrzymanie larw) i inne widoczne fenotypy, które mogą pomóc scharakteryzować funkcję genu zaangażowanego w biogenezę spolaryzowanej błony i morfogenezę światła.
    Uwaga: Tylko płytki punktowe, które mają wystarczającą ilość potomstwa do oceny (co najmniej 50), w przeciwnym razie wypróbuj alternatywne warunki RNAi. W celu oceny ilościowej upewnij się, że płytki nie są zanieczyszczone ani nie rosną na nich OP50 (które zakłócają działanie RNAi).
  2. Aby uwidocznić zwierzęta w świetle fluorescencyjnym, zdejmij pokrywę i umieść płytkę RNAi bezpośrednio pod preparacyjnym mikroskopem fluorescencyjnym.
    Uwaga: Aby wykryć subtelne fenotypy jelitowe, potrzebny będzie mikroskop preparacyjny z nasadką do fluorescencji stereo o większej mocy, która pozwala na wystarczający zakres powiększenia. Protokół ten opisuje użycie lunety z obiektywem 1,5 i 10x oraz zakresem zoomu od 3,5 do 45.
  3. Najpierw znajdź zwierzęta w jasnym świetle, aby się skupić. Następnie należy zbadać zwierzęta w świetle fluorescencyjnym przy małym powiększeniu (np. pod obiektywem 1,5x), używając odpowiedniego filtra. Systematycznie badaj płytkę od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu, aby zeskanować całą płytkę w poszukiwaniu fenotypów.
  4. Wybierz interesujące Cię zwierzę i zmień cel na 10x. Skoncentruj się na jelicie i użyj zoomu, aby ocenić fenotyp morfogenezy cewki/światła. Patrz sekcja 5 w celu uzyskania informacji na temat oceny fenotypów. Najpierw rób zdjęcia w małym powiększeniu. Następnie przełącz się na duże powiększenie.
    Uwaga: Ponieważ zdrowe zwierzęta poruszają się szybko, pracuj szybko, jedną ręką na myszy komputerowej w celu uzyskania obrazu, a drugą ustawiając ostrość mikroskopu. Spowolnienie zwierząt (np. poprzez przejściowe umieszczenie płytek w temperaturze 4 °C) może nie być wymagane podczas pracy z fenotypami tubuogenezy w większości zatrzymanych zarodków i wczesnych larw. Obrazy mogą być rejestrowane przez kamerę CCD zamontowaną pod mikroskopem i oprogramowanie do przechwytywania obrazu.

4. Obrazowanie jelita C. elegans w wyższej rozdzielczości za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej 34,35

  1. Montaż i unieruchomienie
    1. Opuszkiem palca cienko rozprowadź niewielką ilość tłuszczu lub wazeliny w kółko na szklanym szkiełku podstawowym (o średnicy ~6-8 mm).
      Uwaga: Grubość koła smaru ma kluczowe znaczenie dla montażu. Aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania, należy obrazować tylko jedną lub kilka larw na raz i użyć ultracienkiego kółka smarowego z jak najmniejszą ilością płynu, tak aby zwierzę utknęło bezpośrednio między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym (jeśli zostanie to wykonane idealnie, zwierzę zostanie unieruchomione bez znieczulenia). Mocowanie jaj i starszych zwierząt wymaga nieco grubszego koła, aby uniknąć zniszczenia próbki podczas dodawania szkiełka nakrywkowego.
    2. Dodaj kroplę typowo 3,5 μl 10 mM roztworu azydku sodu do środka koła i wbij do niego robaki pod mikroskopem preparacyjnym.
      nuta: Przygotować 1 M roztwór podstawowy azydku sodu, rozpuszczając 65,01 mg NaN3 w 1 mldH2O; dodać 200 μl tego 1M roztworu do 20 ml buforu M9. Szybko wbij robaki do kropli roztworu azydku sodu, aby uniknąć wyschnięcia roztworu. Etapy należy wybierać oddzielnie w celu optymalnego montażu, dążąc do około 50 zarodków na szkiełko i około 20 larw podczas badania większych populacji. Do pobierania zarodków można użyć M9 zamiast roztworu azydku sodu. W przypadku stosowania azydku sodu zwierzęta muszą zostać zobrazowane w ciągu 30 minut, aby uniknąć uszkodzenia tkanek przez tę toksyczną substancję chemiczną.
      UWAGA: azydek sodu jest toksyczny.
    3. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe 22 mm × 22 mm na szkiełku. Uważaj, aby nie zmiażdżyć robaków. Użyj łagodnego nacisku i sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że robaki są dobrze zamocowane między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym. Oznacz slajd.
      Uwaga: Właściwa siła nacisku ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć uszkodzenia próbki (zbyt duży nacisk) i nieprawidłowego jej zamocowania (zbyt mały nacisk: zwierzęta unoszą się na wodzie zamiast przyklejać się do szkiełka). Zwierzęta unoszące się na wodzie zasadniczo uniemożliwiają odpowiednie obrazowanie.
  2. Obrazowania
    1. Umieść szkiełko pod mikroskopem konfokalnym. Szukaj robaków z obiektywem 10x i ostrością.
      Uwaga: Jeśli to możliwe, użyj jasnego światła, aby ustawić ostrość, aby uniknąć fotowybielania.
    2. Zmień obiektyw na 60x lub 100x i skup się na jelicie.
      UWAGA: Jelito można łatwo zidentyfikować w jasnym świetle po jego świetle biegnącym przez środek zwierzęcia, od gardła do odbytu w pobliżu czubka ogona. Zachowaj ostrożność podczas nakładania oleju do obiektywu olejowego 60x lub 100x. Mieszanie różnych rodzajów olejów może zakłócać dalsze obrazowanie. Umieść małą kroplę oleju na szkiełku podstawowym podczas korzystania z mikroskopu pionowego lub na obiektywie podczas korzystania z odwróconej lunety, uważając, aby nie zanieczyścić innych obiektywów lub części mikroskopu.
    3. Ustaw oświetlenie Kohler DIC/Nomarski dla obiektywu, który ma być używany do skanowania36. Zbadać zwierzę w świetle fluorescencyjnym z odpowiednim kanałem w celu sprawdzenia oznakowania jelita i/lub sprawdzenia fenotypu, w celu wybrania odpowiedniej próbki do obrazowania. Pracuj szybko, aby uniknąć wybielania.
    4. Przełącz się na skanowanie laserowe, aby ograniczyć prospektywny obraz do jelita, ustawiając granice skanowania po jego stronie grzbietowej i brzusznej.
      Uwaga: Nawiasowanie jelita w ten sposób ma kluczowe znaczenie, jeśli fluorofor oznacza również struktury poza jelitem. Podczas tego skanowania pilotażowego pracuj w warunkach szybkiego skanowania, aby uniknąć fotowybielania.
    5. Zatrzymaj skanowanie, aby wybrać parametry skanowania dla eksperymentu. Ustaw 6-20 sekcji do skanowania jelit wzdłuż osi z, np. w odstępach 0,2 μm, w zależności od zapytania, stadium zwierzęcia i/lub uwarunkowań technicznych. Ustaw uśrednianie klatek na obraz w zależności od złożoności etykietowania i wymaganej rozdzielczości, aby zredukować szum.
      Uwaga: Szczegóły ustawień różnią się w zależności od mikroskopu i eksperymentu. Może być konieczne zmniejszenie liczby skrawków, aby uniknąć wybielania, jeśli wykonujesz sekwencyjne skanowanie trzech różnych fluoroforów. Dostosuj liczbę klatek do liczby sekcji (powinna być mniejsza niż liczba sekcji, aby uniknąć zniekształceń obrazu; uwzględnij również wzrost fotowybielania). Zwykle wystarcza 4-6 ramek.
    6. Wróć do skanowania z ostatecznymi (wolnymi) warunkami skanowania laserowego i dostosuj: jasność (użyj minimalnego wzmocnienia, aby zredukować tło); moc lasera (tak wysoka, jak to wymagane, tak niska, jak to możliwe - zwiększa fotowybielanie; zwykle minimalne ustawienie jest odpowiednie); otworek (unikaj otwierania, jeśli nie jest to wymagane, aby utrzymać rozdzielczość).
      Uwaga: Warunki skanowania zależą od próbki i muszą być empirycznie określone na początku sesji skanowania. Upewnij się, że jasność nie przekracza nasycenia (ograniczy to możliwość późniejszej modyfikacji obrazu przez oprogramowanie do obrazowania). Ustalając warunki skanowania, należy również wziąć pod uwagę, że identyczne warunki muszą być stosowane do wszystkich obrazowania w eksperymentach, które porównują zwierzęta doświadczalne z kontrolnymi.
    7. Przechwytywanie serii obrazów. Scalanie obrazów w jeden obraz projekcyjny.
      Uwaga: W zależności od mikroskopu może być konieczne osobne zapisanie obrazów projekcyjnych i/lub nakładek.
    8. Podczas wykonywania obrazów wielokanałowych należy stosować skanowanie sekwencyjne, aby uniknąć przebijania między kanałami (krytyczne w przypadku badań kolokalizacyjnych).
      Uwaga: Może być konieczna zmiana ustawień obrazu ze względu na zwiększone fotowybielanie związane z dłuższym czasem skanowania.
    9. Zawsze zdobywaj odpowiednie obrazy (sekcje) DIC/Nomarski dla punktów orientacyjnych i ogólnego stanu morfologii skanowanego zwierzęcia.

5. Kwantyfikacja defektów biogenezy błony spolaryzowanej w jelicie C. elegans

Uwaga: Przykład: Podstawno-boczne przemieszczenie wierzchołkowego ERM-1::GFP i ektopowe tworzenie światła bocznego wywołane przez let-767i aps-1RNAi.

  1. Ocenianie fenotypów pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 5 A, D, E)
    1. Zdefiniuj kategorie do oceniania. Przykład: (i) typ dziki (WT), (ii) podstawno-boczne przemieszczenie ERM-1::GFP (wada polaryzacji) oraz (iii) ektopowe tworzenie światła (rozwija się po przemieszczeniu podstawno-bocznym).
      UWAGA: Analiza wizualna w małym powiększeniu nadaje się do oceny liczby zwierząt z określonym fenotypem lub bez niego. Tutaj wybraliśmy przykład trzech jakościowo różnych kategorii fenotypowych, które jednocześnie wskazują na pogorszenie analizowanego fenotypu polarności. Można jednak ocenić wiele różnych jakościowych i ilościowych fenotypów, takich jak defekty morfogenezy światła, brak/obecność (lub liczba) cytoplazmatycznych wakuoli GFP, średnica i rozmiar światła lub liczba torbieli śródświetlnych (patrz Rysunek 3 dla przykładów).
    2. W zależności od wielkości oczekiwanych różnic, należy ocenić około 100 żywych robaków na ich płytkach agarowych pod mikroskopem preparacyjnym w zduplikowanym lub potrójnym zestawie eksperymentów.
      Uwaga: Należy oceniać każde zwierzę, które pojawia się w polu widzenia podczas systematycznego skanowania tabliczek, np. od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu tablicy (upewnij się, że robaki mają równomiernie rozmieszczone płytki).
    3. Powtórz to dla 3 niezależnych zestawów eksperymentów. Wygeneruj wykres słupkowy i oceń znaczenie wyników.
  2. Ocenianie fenotypów pod mikroskopem konfokalnym (Ryc. 5 B)
    1. Zdefiniuj kategorie punktacji, np. liczba lumenów ektopowych na zwierzę
      UWAGA: Analiza wizualna w większym powiększeniu nadaje się do oceny ilościowego markera lub fenotypu na zwierzę i umożliwia ocenę markerów subkomórkowych, które mogą nie być dostrzegalne przez mikroskopię preparacyjną. Obecny przykład liczenia ektopowych lumenów na zwierzę w podzbiorze robaków z tego samego eksperymentu, poprzednio ocenianego za pomocą mikroskopii preparacyjnej (5.1.1, kategoria 3), udoskonala ocenę pogarszającego się fenotypu polarności, który jest tutaj badany. Można jednak ocenić wiele innych fenotypów lub parametrów, np. liczbę pęcherzyków, obecność/brak lub liczbę składników subkomórkowych, które kolokalizują, intensywność fluorescencji (ta ostatnia określona ilościowo za pomocą ImageJ; patrz towarzyszący artykuł na temat kanału wydalniczego)2.
    2. W zależności od wielkości oczekiwanych różnic, określ ilościowo marker fenotypowy (w tym przypadku światła ektopowe) u około 20 zwierząt w zduplikowanym lub trzykrotnym zestawie eksperymentów pod mikroskopem konfokalnym.
    3. Powtórz dla 3 niezależnych zestawów eksperymentów. Generuj wykresy słupkowe i oceniaj znaczenie wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak molekularnie analizować i wizualizować biogenezę spolaryzowanej błony i morfogenezę światła w jelicie C. elegans, na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. Dwudziestokomórkowe jednowarstwowe jelito C. elegans powstaje w wyniku ukierunkowanego podziału i migracji komórek podczas środkowej embriogenezy. W tym czasie utrwalają się spolaryzowane domeny błonowe, jednak de novo spolaryzowana biogeneza błonowa trwa w dojrzałym, ale rozszer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe podejścia genetyczne / RNAi do utraty funkcji i obrazowania (znakowanie i mikroskopowe) w celu wykorzystania nabłonka jelitowego C. elegans jako modelu do wizualnej i molekularnej sekcji biogenezy spolaryzowanej błony i światła in vivo .

Etykietowania

Protokół ten koncentruje się na barwieniu przeciwciał. Znakowanie in situ za pomocą przeciwciał jest wysoce specyficz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mario de Bono (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Wielka Brytania), Kennethowi J. Kemphuesowi (Cornell University, Ithaca, USA), Michelowi Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paryż, Francja), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Francja) oraz CGC, finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), dla szczepów i przeciwciał. Prace te były wspierane przez granty NIH GM078653, MGH IS 224570 i SAA 223809 dla V.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Barwienie przeciwciałami
poli-L-lizynaSigmaP5899
MetanolFisher ScientificA452-4
AcetonFisher ScientificA949SK-4
TweenFisher Scientific50-213-612
PermountFisher ScientificSP15-100
Mleko w proszkuSigmaMT409-1BTL
Przeciwciała pierwotne
MH27 (mysz)Stężenie: 1:20 Zasoby: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mysz)Stężenie: 1:10 Zasoby: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anty-ICB4 (królik)Stężenie: 1:5 Zasoby: Prezent od Mario de Bono (Medical Research Council, Anglia)
anty-PAR-3 (królik)Stężenie: 1:50 Zasoby: Dar od Kennetha J. Kemphuesa (Cornell University)
Przeciwciała drugorzędowe
Alexa Floor 568 (anty-królik)ABCamAB175471Stężenie: 1:200
Cy5 (anty-mysz)Technologie życiaA10524Stężenie: 1:200
TRITC (anty-królik)InvitrogenT2769Stężenie: 1:200
FITC (anty-mysz)SigmaF9006Stężenie: 1:100
Oznaczone chemikalia
Texas Red-PhalloidinStężenie: 1:100 Zasoby: Sondy molekularne-T7471
Materiały
Smar próżniowy SilikonBeckman335148
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific4448
Szkiełka nakrywkowe mikroskopu (22x22-1)Fisher Scientific12-542-B
C. elegans powiązanepatrz odniesienie29 dla standardowych procedur hodowli i konserwacji C. elegans.
LB Medium i płytypatrz referencja29 dla protokołów.
TryptoneAcros Organics611845000
Ekstrakt z drożdżyBD Biosciences212750
NaClSigmaS7653
Bacto AgarBD Biosciences214040
AmpicylinaSigmaA0116
TetracyklinaFisher ScientificBP912
M9 Średnipatrz referencja29 dla protokołów.
NaClSigmaS7653
KH2PO4SigmaP0662
Na2HPO4SigmaS7907
MgSO4SigmaM2773
NGM platespatrz referencja29 dla protokołów.
NaClSigmaS7653
PeptoneBD Biosciences211677
TryptoneAcros Organics611845000
Bacto AgarBD Biosciences214040
MgSO4SigmaM2773
CaCl2SigmaC3881
CholesterolSigmaC8667
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
<>płytki RNAipatrz referencja30 dla protokołów.
NaClSigmaS7653
PeptoneBD Biosciences211677
TryptoneAcros Organics611845000
Bacto AgarBD Biosciences214040
MgSO4SigmaM2773
CaCl2SigmaC3881
CholesterolSigmaC8667
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
IPTGUS BiologicalI8500
KarbenicylinaFisher ScientificBP2648
NaOHFisher ScientificSS266-1
Podchloryn soduFisher Scientific50371500
Bacteria
OP50 bacteriaCGC
HT115 bacteriaCGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)Źródło: BioScience
C. elegans Biblioteka karmienia ORF-RNAi (ref51)Źródło: BioScience
Imaging related
Sodium azideFisher ScientificBP9221-500
Equipment
mikroskop preparacyjnyMikroskopNikon SMZ-U
wyposażony w przystawkę do fluorescencji stereo o dużej mocy (Kramer Scientific), kamerę CCD z oprogramowaniem do przechwytywania Q i lampą fluorescencyjną X-Cite (Photonic Solutions)OlympusSZX12
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemTCS SL
zamontowany na odwróconym ECLIPSE Ti-E mikroskopNikonC2
preparacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
  2. Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. , (2017).
  3. Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).
  4. Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).
  5. Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
  6. Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).
  7. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).
  8. Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).
  9. Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
  10. Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).
  11. Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).
  12. Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).
  13. Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).
  14. Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12 (4), e1005950(2016).
  15. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).
  16. Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. , (2009).
  17. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  18. Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).
  19. Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. , (2017).
  20. McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).
  21. Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  22. Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  23. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  24. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  25. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  26. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
  28. JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  29. T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  30. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  31. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  32. Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).
  33. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  34. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  35. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  36. Netherlands, S. Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , Springer. Netherlands. (2008).
  37. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
  38. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
  39. Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).
  40. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
  41. Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
  42. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  43. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  44. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2007).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , http://dshb.biology.uiowa.edu (2017).
  49. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  50. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  51. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnab ona apikalnab ona bazolateralnaERM 1 GFPfluorescencyjne bia ka fuzyjne

Powiązane artykuły