Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

18.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56103

⸱

1 września 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia krok po kroku protokół bezstronnego stereologicznego szacowania liczby komórek neuronalnych dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego (tj. mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanej tabeli obiektów (płaszczyzna x, y, z) oraz oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu.

Streszczenie

W przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, analiza drogi nigrostriatalnej, w tym kwantyfikacja utraty neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej, jest niezbędna. Aby oszacować całkowitą liczbę neuronów dopaminergicznych, bezstronna stereologia przy użyciu metody frakcjonowania optycznego jest obecnie uważana za złoty standard. Ponieważ teoria stojąca za metodą frakcjonowania optycznego jest złożona, a stereologia jest trudna do osiągnięcia bez specjalistycznego sprzętu, istnieje kilka dostępnych na rynku kompletnych systemów stereologicznych, które zawierają niezbędne oprogramowanie, wyłącznie ze względu na liczenie komórek. Ponieważ zakup specjalistycznego zestawu do badań geologicznych nie zawsze jest wykonalny z wielu powodów, w niniejszym raporcie opisano metodę stereologicznego szacowania liczby dopaminergicznych komórek neuronalnych przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego, w tym mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanego stołu obiektów (płaszczyzna x, y, z) z oprogramowaniem do obrazowania oraz komputera do analizy. Podano wyjaśnienie krok po kroku, jak przeprowadzić stereologiczną kwantyfikację przy użyciu metody frakcjonowania optycznego, a także udostępniono wstępnie zaprogramowane pliki do obliczania szacowanej liczby komórek. Aby ocenić dokładność tej metody, przeprowadzono porównanie z danymi uzyskanymi z komercyjnie dostępnego aparatu do badania stereologicznego. Porównywalne liczby komórek znaleziono przy użyciu tego protokołu i urządzenia stereologicznego, demonstrując w ten sposób precyzję tego protokołu dla bezstronnej stereologii.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja liczby komórek neuronalnych jest kluczowa w przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, mającej na celu określenie poziomu neurodegeneracji w obrębie istoty czarnej (SN)1,2. Bezstronne stereologiczne oszacowanie liczby komórek w obszarze zainteresowania jest uważane za złoty standard3,4,5.

Przed nadejściem bezstronnej stereologii, liczba neuronów w sekcjach była oceniana poprzez manipulowanie zliczonymi profilami komórek, aby skorygować zmienne prawdopodobieństwa, że neurony pojawią się w zasięgu wzroku w sekcji. Jedną z najczęściej stosowanych metod była korekta ilościowo określonej liczby komórek opisana przez Abercrombie6. W tej metodzie starano się wziąć pod uwagę, że komórki mogą być oznaczane ilościowo więcej niż raz, jeśli fragmenty tej samej komórki zostaną znalezione w sąsiednich cienkich sekcjach. W związku z tym Abercrombie i inni autorzy stworzyli równania, które wymagały założeń dotyczących kształtu, rozmiaru i orientacji zliczanych komórek7,8. Jednak założenia te zwykle nie były realizowane, a zatem prowadziły do błędów systematycznych i rozbieżności z rzeczywistą liczbą komórek (tj. stronniczości). Co więcej, odchylenie nie mogło zostać zmniejszone przez dodatkowe próbkowanie3.

Do stereologicznego szacowania liczby komórek za pomocą optycznego frakcjonatora, stosuje się zasady matematyczne do bezpośredniego szacowania liczby komórek bezpośrednio w określonej, trójwymiarowej objętości. Zaletą tej metody jest to, że nie wiąże się z założeniami dotyczącymi kształtu, rozmiaru i orientacji liczonych komórek. W związku z tym szacowane liczby komórek są bliższe rzeczywistym wartościom i zbliżają się wraz ze wzrostem wielkości próbki (tj. bezstronne)3. Ponieważ podczas korzystania ze stereologii należy przestrzegać wielu zasad, aby metoda była bezstronna, opracowano gotowe do użycia komercyjne systemy stereologii (przegląd patrz Schmitz i Hof, 20054). Wyspecjalizowane systemy stereologiczne wdrażają metody stereologiczne oparte na projektowaniu z a priori zdefiniowanymi sondami i schematami próbkowania do ocen stereologicznych, które prowadzą do niezależności od kształtu, rozmiaru, rozkładu przestrzennego i orientacji analizowanych komórek4,9. Jednak dostępne na rynku systemy stereologiczne są drogie; Może to ograniczyć implementację w nowych badaniach.

Celem tego badania było opracowanie użytecznej techniki do stereologicznego szacowania liczby komórek dopaminergicznych w mysim SN opartej na projektowaniu, wykorzystując metodę optycznego frakcjonowania i używając standardowego sprzętu do mikroskopii (tj. mikroskopu świetlnego, standardowego oprogramowania mikroskopu i zmotoryzowanego stolika x, y, z). W tym celu przedstawiono przewodnik krok po kroku, jak przetwarzać tkankę mózgową myszy i jak oszacować liczbę komórek SN przy użyciu bezstronnej stereologii opartej na projektowaniu. Ponadto dostępne są szablony do obliczania szacowanej liczby komórek i współczynników błędu (CE).

Opisana tutaj metoda nie ogranicza się do analizy SN, ale może być dostosowana do użycia w innych anatomicznie zdefiniowanych regionach mózgu myszy lub szczura. Na przykład, bezstronna stereologia została wykorzystana do oszacowania liczby komórek neuronalnych w hipokampie10 i locus coeruleus11. Dodatkowo można również ocenić typy komórek inne niż neurony, takie jak astrocyty12 i microglia13. Dlatego metoda ta może być przydatna dla naukowców, którzy zamierzają wdrożyć bezstronną stereologię w swoich badaniach, ale nie są skłonni wydawać dużych pieniędzy na zakup systemu stereologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przestrzegano wszystkich obowiązujących międzynarodowych, krajowych i/lub instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Protokół został zatwierdzony przez lokalne organy nadzorcze w Regierung von Unterfranken, Wuerzburg, Niemcy.

1. Obróbka tkanek i immunohistochemia

  1. Uśmiercić myszy za pomocą CO2 lub innej zatwierdzonej metody.
  2. Przeprowadzić perfuzję transkardialną sześciu 12-tygodniowych samców myszy C56Bl/6N przy użyciu 10 mL 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) z użyciem igły 25-G i pompy infuzyjnej, a następnie 70 mL 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M PBS.
    OSTROŻNIE: PFA jest toksyczny, alergizujący i rakotwórczy.
  3. Przeprowadzić sekcję mózgu myszy w płaszczyźnie czołowej za pomocą matrycy do cięcia mózgu w obszarze +0,74 mm od Bregmy (Rycina 25, atlas mózgu myszy Paxinosa i Franklina14).
  4. Umieścić grzbietową część mózgu, w tym istotę czarną (SN), w 4% PFA w 0,1 M PBS na 1 d w temperaturze 4 °C w celu fiksacji przez imersję.
  5. Zastąpić PFA 30% roztworem sacharozy/0,1 mol PBS w celu krioprotekcji i inkubować przez kolejne 2 d w temperaturze 4 °C.
  6. Umieścić grzbietową część mózgu w formie do kriotomii wypełnionej związkiem OCT (optimal cutting temperature) i powoli zamrozić tkankę w izopentanie chłodzonym suchym lodem.
    OSTROŻNIE: Suchy lód jest ekstremalnie zimny (-78 °C); podczas pracy z suchym lodem należy używać środków ochrony indywidualnej (PPE), w tym rękawic. Suchy lód odparowuje do CO2, dlatego należy pracować pod wyciągiem.
  7. Wyciąć seryjnie 30-µm krioprzekroje w płaszczyźnie czołowej i zebrać sekcje, zaczynając od 2,46 mm od Bregmy (Rycina 51, atlas mózgu myszy Paxinosa i Franklina14) i kończąc na 4,04 mm od Bregmy (Rycina 64, atlas mózgu myszy Paxinosa i Franklina14).
  8. Przechowywać cztery serie w probówkach wypełnionych krioprotektorem (30% glicerolu, 30% etoksyetanolu i 40% PBS) w temperaturze -20 °C. Podczas procedury cięcia oznaczyć prawą półkulę, wykonując niewielkie nakłucie w górnym obszarze pnia mózgu.
  9. Do barwienia immunohistochemicznego wybrać jedną serię przekrojów na mysz. Preinkubować swobodnie pływające sekcje przez 1 h w 10% normalnym surowicy koziej (NGS)/2% BSA/0,5% detergentu w 0,1 mol PBS na shakerze. Inkubować sekcje z przeciwciałem króliczym przeciwko mysiej tyrozynowej hydroksylazie (TH; rozcieńczenie 1:1 000) rozcieńczonym w 2% NGS/2% BSA/0,5% detergentu w 0,1 mol PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. Zastosować przeciwciała wtórne przeciwko króliczym immunoglobulinom (Ig) (rozcieńczenie 1:100) przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie odczyn awidyna/biotyna (rozcieńczenie 1:100). Inkubować i barwić 3,3-diaminobenzydynotetrachlorowodorkiem (DAB) i H2O2. Po zabarwieniu zamontować sekcje na powlekanych szkiełkach przedmiotowych.
    UWAGA: Dopaminergiczne neurony SN TH+ przedstawiono na Rycynie 1a. Poprzez zabarwienie jednej serii, na każde zwierzę zabarwiane jest średnio 13 sekcji SN, obejmujących od części rostralnej do kaudalnej części zwartej (SNpc) i siatkowatej istoty czarnej (Rycina 1b). Sekcje są oddzielone o 120 µm (1/4 serii) (Rycina 1c).
    OSTROŻNIE: DAB jest podejrzany o działanie rakotwórcze. Jest toksyczny w przypadku kontaktu i inhalacji. Podczas pracy z DAB należy używać środków ochrony indywidualnej (PPE).

2. Pozyskiwanie obrazów

  1. Wykonaj cyfrową akwizycję obrazów przekrojów SN barwionych immunohistochemicznie na TH, korzystając z oprogramowania obrazowego sprzężonego z mikroskopem. Każdy przekrój z jednej serii analizuj oddzielnie.
  2. Użyj opcji skanowania preparatu (scan slide) w oprogramowaniu obrazowym. Obrazy zapisz w formacie TIFF, aby zapewnić ich wysoką jakość (Rysunek 2).
    UWAGA: Rozdzielczość obrazu wynosi 312 pikseli na cm.
  3. Naciśnij „Acquire”, aby otworzyć okno akwizycji (Rysunek 2a).
  4. Ustaw binning na „2” dla obrazów w skali szarości.
    UWAGA: Akwizycja obrazów w skali szarości zamiast zdjęć kolorowych zmniejsza rozmiar końcowego pliku obrazu stosu (Rysunek 2a).
  5. Kliknij „Show Live” w oknie akwizycji, aby otworzyć nowe okno wyświetlające obraz przekroju na żywo (Rysunek 2a i b).
  6. Kliknij „Stage” w oknie akwizycji. W menu rozwijanym wybierz „Scan Slide” i zaznacz odpowiednie pole wyboru (Rysunek 2c).
    UWAGA: Umożliwia to akwizycję i wyrównanie obrazów SN przy dużym powiększeniu (powiększenie 630X) w płaszczyźnie x,y, a także akwizycję obrazów stosu z odległością 1 µm między kolejnymi obrazami w płaszczyźnie z, obejmując całkowity zakres 13 µm.
  7. Wybierz obiektyw 2,5X, aby zlokalizować SN.
  8. Zmień obiektyw na 63x.
  9. Zdefiniuj lewy górny róg (TopLeft) (Rysunek 2c) oraz prawy dolny róg (LowRight) (Rysunek 2d) przekroju, klikając „Set”.
  10. Kliknij „Z-Series” i zaznacz pole „Z-Plane series” (Rysunek 2e).
  11. Wyznacz rzeczywistą grubość zamontowanych przekrojów w trzech losowo wybranych miejscach zliczania na każdy przekrój przy użyciu oprogramowania obrazowego. W tym celu kliknij „View Top Offset”, aby zdefiniować górną krawędź przekroju (Rysunek 2e), a następnie kliknij „Stop View Top” (Rysunek 2f). Następnie kliknij „View Bottom Offset” (Rysunek 2f), a potem „Stop View Bottom” (Rysunek 2g). Zapisz grubość przekroju.
  12. Odejmij 3 µm (strefa ochronna) od górnego offsetu i wpisz wynik w polu górnego offsetu (Rysunek 2h). Odejmij 13 µm (wysokość dysektora optycznego) od wartości górnego offsetu i wpisz wynik w polu dolnego offsetu (Rysunek 2i). Wybierz następujące parametry: steps, 14; size, 1,00 (Rysunek 2i).
    UWAGA: Odpowiada to grubości 13 µm w płaszczyźnie z, z odległością 1 µm między kolejnymi obrazami.
  13. Wybierz katalog do zapisu pliku (Rysunek 2j).
  14. Kliknij „Sequence”, aby rozpocząć akwizycję (Rysunek 2j).
  15. Kliknij „Processing” i wybierz następujące parametry: „All Planes”, z opcji „Sequence”; „Montage” oraz pola „Fast” i „Stitching”, z nakładaniem obrazów na poziomie 10% (Rysunek 2k). Rozpocznij składanie (stitching) obrazów, klikając „start”.
    UWAGA: Pozwoli to wygenerować obrazy stosu do analizy (Rysunek 2l, Rysunek 3a-e).

3. Kolejność oceny stereologicznej

  1. Przeprowadź analizę obrazów stosu SN przy użyciu oprogramowania NIH ImageJ w wersji 4.7.
  2. Pobierz z witryny ImageJ.nih.gov dwie wymagane wtyczki: wtyczkę „Grid Overlay”15 oraz wtyczkę „Cell Counter”16. Zainstaluj obie wtyczki zgodnie z opisem.
  3. W celu bezstronnej oceny stereologicznej zdefiniuj parametry zliczania w następujący sposób: rozmiar siatki 130 x 130 µm, ramka zliczania 50 x 50 µm oraz wysokość disektora optycznego 13 µm.
  4. Otwórz obraz, klikając „File” → „Open” (Rycina 4a). Ustaw skalę obrazu za pomocą polecenia „Analyze” → „Set Scale” (Rycina 4b). Na tym etapie zmień zdefiniowany rozmiar z pikseli na µm (Rycina 4c).
    UWAGA: Dla analizowanych obrazów 425 pikseli odpowiada 100 µm.
  5. Wybierz polecenie „Plugins” → „Grid” → „Grid Type: Lines”, aby losowo wstawić siatkę. Zaznacz pole „Random Offset”. Zdefiniuj rozmiar jednego kwadratu wewnątrz siatki (kwadrat siatki) jako 130 µm x 130 µm = 16 900 µm2 (Rycina 3b oraz Rycina 4d i e).
  6. Zmień typ obrazu z 16-bitowego na RGB Color (kliknij „Image” → „Type” → „RGB Color”) (Rycina 4f). Zlokalizuj SNpc zgodnie z opisem Baqueta et al.17. Obrysuj SNpc za pomocą narzędzia „Paintbrush Tool” (szerokość pędzla: 11) (Rycina 3c i Rycina 4g-i).
  7. Cofnij polecenie „Set Scale”, klikając „Analyze” → „Set Scale” → „Click to Remove Scale” (Rycina 4j-l), aby umożliwić wykonywanie obliczeń w pikselach zamiast w µm.
  8. Zrób zrzut ekranu (Rycina 4m), zapisz plik obrazu i otwórz nowy plik w programie ImageJ (Rycina 4n). Wybierz „Point” (Rycina 4o) i szerokość pędzla 25 (Rycina 4p). Zaznacz każdy kwadrat siatki stykający się z SN w celu umieszczenia disektora optycznego (Rycina 4q). Przeprowadź analizę liczby komórek we wszystkich disektorach optycznych zlokalizowanych w całości lub częściowo w obrysowanym obszarze SN.
  9. Wybierz jeden kwadrat siatki, który obejmuje części SN. Zmierz górny lewy róg tego kwadratu kursorem w ImageJ, aby zdefiniować początkowe współrzędne x i y (Rycina 4r).
    UWAGA: Współrzędne zostaną wprowadzone do pozycjonowania disektora optycznego przy użyciu arkusza „optical disector position” (Rycina 4s), zgodnie z opisem w kroku 4.
  10. Oblicz pozycję disektora optycznego, korzystając z szablonu arkusza kalkulacyjnego zatytułowanego „Optical disector position”, zgodnie z opisem w kroku 4.
  11. Skalibruj disektor optyczny (makro napisane przez Christophera S. Warda, Plik uzupełniający), klikając „Plugins” → „Macros” → „Edit” (Rycina 4t), otwórz plik „opt_dis_grid.txt” (Rycina 4u) i zdefiniuj rozmiar „usergrid” w pikselach, który odpowiada wymiarom x,y disektora optycznego (Rycina 4v). Wybierz rozmiar 50 µm x 50 µm, tak aby rozmiar jednego boku usergrid został zdefiniowany jako 212,5 piksela (50 x 4,25 piksela).
  12. Wyznacz pozycję disektora optycznego w obrazie stosu, wprowadzając współrzędne ImageX i ImageY definiujące środek disektora optycznego (Rycina 4v). Uruchom makro („Macros” → „Run Macro”) (Rycina 4w).
    UWAGA: Siatka zniknie z obrazu stosu (Rycina 3d i Rycina 4x). Disektor optyczny będzie widoczny podczas przesuwania się w dół w płaszczyźnie z (Rycina 3e i Rycina 4x).
  13. Wybierz „Plugins” → „Cell Counter”, aby uruchomić wtyczkę Cell Counter (Rycina 4y). Zainicjuj Cell Counter i wybierz typ znacznika (Rycina 4z). Powiększ obraz (kliknij „+”) i przeprowadź stereologiczną ocenę liczby komórek przy powiększeniu 200%.
  14. Zidentyfikuj perykaria neuronów dopaminergicznych po ich zaokrąglonym lub owalnym kształcie oraz wielkości komórek (Rycina 1a). Ilościowo określ liczbę komórek zgodnie z zasadami stereologii.
    UWAGA: Ponieważ disektor optyczny jest trójwymiarową sześcianem (Rycina 5a), zdefiniuj ściany wykluczenia jako przednią, lewą i górną ścianę sześcianu (kolor czerwony). W związku z tym nie zliczaj komórek TH+, które stykają się z czerwoną linią (lewą i przednią) lub górną ścianą. Dodaj wyniki zliczania komórek do przygotowanego pliku arkusza kalkulacyjnego zatytułowanego „Calculation of cell count” (krok 5).
  15. Na podstawie obrazu SN oblicz kolejny kwadrat siatki, w którym należy umieścić disektor optyczny dla następnego zliczania komórek, stosując skoki x,y o rozmiarze nałożonej siatki (Rycina 5b) oraz szablon arkusza „Optical disector position”, zgodnie z opisem w kroku 4.
  16. Przeprowadź oszacowanie liczby komórek za pomocą arkusza „Calculation of cell count” (krok 5).

4. Obliczanie pozycji optycznego dysektora przy użyciu szablonu arkusza kalkulacyjnego „Optical Disector Position”

  1. Oblicz rozmiar i pozycję każdego dysektora optycznego, który zostanie umieszczony w nakładającej się siatce w obrębie konturu SN (Rysunek 5b), korzystając z pliku arkusza kalkulacyjnego „Optical disector position.xlsx” (Plik uzupełniający).
  2. Wprowadź przelicznik pikseli na µm, określony przez polecenie „Set Scale”, w zaznaczone na żółto pola w pliku „Optical disector position.xlsx” (Rysunek 6a i Plik uzupełniający).
  3. Wprowadź planowany rozmiar dysektora optycznego oraz rozmiar pola siatki nakładającej się siatki, określony jako długość jednego boku (w µm), w zaznaczone na pomarańczowo pola.
    UWAGA: Wyniki są przedstawione w czerwonych polach obok pól pomarańczowych.
  4. Zacznij od pola siatki w obrębie konturu SN, które zostało wyznaczone jako punkt startowy (wybrano jedno pole siatki na początek, zgodnie z krokiem 3.9 powyżej).
  5. Wprowadź współrzędne x i y, zmierzone w kroku 3.9, do zielonych pól w pliku (na podstawie tych wartości zostaną obliczone współrzędne x,y środka dysektora optycznego w tym pierwszym polu, a wyniki zostaną przedstawione w niebieskich polach). Uruchom makro opt_dis_grid.txt (Plik uzupełniający).
  6. Oblicz współrzędne x,y kolejnych dysektorów optycznych, wprowadzając odległość pola siatki (mierzoną w liczbie pól) względem pierwszego pola siatki (brązowe pola).
    UWAGA: +x: pole siatki znajduje się po prawej stronie; -x: pole siatki znajduje się po lewej stronie; +y: pole siatki znajduje się na dole; -y: pole siatki znajduje się na górze. Wyniki są pokazane w szarych polach.

5. Szacowanie liczby komórek przy użyciu arkusza kalkulacyjnego „Obliczanie liczby komórek”

  1. Obliczyć szacowaną liczbę komórek SN TH+ na zwierzę (N), korzystając ze wzoru opublikowanego przez West et al., 19913, gdzie ∑Q- jest definiowane jako całkowita liczba neuronów TH+ policzonych we wszystkich disektorach optycznych jednego przekroju mózgu.
    UWAGA: W równaniu uwzględniono wysokość disektora optycznego (h) w stosunku do zmierzonej grubości przekroju (t). Ułamek próbkowania powierzchni (asf) definiuje się jako stosunek powierzchni (A) ramki disektora optycznego (A optical disector) do powierzchni kwadratu siatki (A x,y step) (A optical disector/A x,y step) (Rysunek 3b), a ułamek próbkowania przekrojów (ssf) definiuje się jako stosunek liczby wybranych przekrojów do wszystkich seryjnie wyciętych przekrojów mózgu:
    figure-protocol-1
    Aby zapewnić wysoką jakość szacunków ilościowych, współczynnik błędu (CE) powinien być niższy niż 0,10. Wyznaczyć CE, korzystając ze wzoru Keuker et al., 200110:
    figure-protocol-2
  2. W celu stereologicznego oszacowania liczby komórek w obrębie SN każdej myszy, wprowadzić do żółtych pól w pliku arkusza kalkulacyjnego „Calculation of cell count.xlsx” (Rysunek 6b i Plik uzupełniający) wskazane informacje dotyczące całkowitej liczby wygenerowanych serii na mysz, wysokości disektora optycznego, powierzchni x,y disektora optycznego (A optical disector, w µm2), powierzchni x,y kwadratu siatki (A x,y step, w µm2) oraz średniej zmierzonej grubości przekroju (w µm).
  3. Przeanalizować każdy przekrój SN pochodzący od tego samego zwierzęcia, zgodnie z opisem w kroku 5.
  4. Wprowadzić liczby komórek dla każdego disektora optycznego w szarych polach, gdzie każda linia odnosi się do jednego przekroju SN, korzystając z pliku arkusza kalkulacyjnego „Calculation of cell count.xlsx” (Plik uzupełniający).
    UWAGA: Szacowana liczba komórek oraz obliczony CE są przedstawione w niebieskich polach (Rysunek 6b).

6. Szacowanie liczby komórek przy użyciu dostępnego komercyjnie systemu stereologicznego

  1. Rozpocznij szacowanie liczby komórek dopaminergicznych SNpc, klikając „Probes” → „Optical Fractionator Workflow”, aby otworzyć okno Optical Fractionator Workflow.
    UWAGA: Pojawi się nowe okno, w którym należy określić, czy będzie liczona nowa seria SN.
  2. Rozpocznij nową serię przekrojów SN TH+, klikając „Start a new subject” w wyskakującym oknie.
  3. Przejdź przez poszczególne etapy Optical Fractionator Workflow. W pierwszym kroku skonfiguruj obiekt. W tym celu wprowadź imię badacza, nazwę obiektu (grupa SN) oraz inne przydatne informacje. Wprowadź liczbę przekrojów do policzenia dla tego SN. Wprowadź grubość ciętych przekrojów tkanki. Wprowadź interwał przekrojów, który w tym przypadku wynosi cztery. Wprowadź losowo wyznaczony numer przekroju, od którego należy zacząć.
  4. W drugim kroku ustaw mikroskop na niskie powiększenie (obiektyw 2X) i wybierz „2X Mag Lens” z menu.
  5. W kroku 3 obrysuj lewym przyciskiem myszy obszar zainteresowania, którym jest SNpc, zgodnie z opisem Baquet et al., 200917.
  6. W kroku 4 ustaw mikroskop na wysokie powiększenie. W tym celu zmień obiektyw na 100X i wybierz „100X Mag lens” z menu rozwijanego.
  7. W kroku 5 zmierz grubość montowania, ustawiając ostrość na górną i dolną powierzchnię przekroju.
  8. W kroku 6 zdefiniuj rozmiar ramki zliczającej jako 50 x 50 µm; jest to rozmiar dysektora optycznego (x,y).
  9. W kroku 7 ustaw rozmiar siatki systematycznego losowania (SRS) na 130 x 130 µm.
  10. W kroku 8 wprowadź 3-µm strefę ochronną (guard zone).
  11. Zapisz ustawienia w kroku 9.
  12. Na koniec, w kroku 10 Optical Fractionator Workflow, policz komórki dopaminergiczne TH+ w każdym z dysektorów optycznych w obrębie siatki SRS. W tym celu kliknij przycisk „Counting”.
  13. Po zakończeniu analizy jednego przekroju kliknij przycisk „Begin Next Section”, aby rozpocząć Optical Fractionator Workflow dla następnego przekroju SN z tej samej serii SN.
  14. Gdy zostanie ilościowo określony ostatni przekrój SN w jednej serii SN, kliknij „I've Finished Counting”.
  15. Kliknij przycisk „View Results”, aby wyświetlić wyniki próbkowania stereologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując przedstawioną metodę, szacowana liczba neuronów dopaminergicznych TH+ w prawej SN mieściła się w zakresie od 7 363 do 7 987 komórek, a w lewej SN od 7 446 do 7 904 komórek. Zatem średnia liczba neuronów dopaminergicznych (± SEM) wynosiła 7 647 ± 83 komórki dla prawej SN i 7 675 ± 66 dla lewej SN. Obliczona wartość CE dla każdego zwierzęcia była niższa niż 0,08 (zakres: 0,073–0,079) (Rycina 7). Aby ocenić porównywalność tej metody z komercyjnie dostęp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stereologia zaczyna się od przetwarzania tkanek. Seryjne cięcie tkanki SN musi być wykonywane ostrożnie, aby zapobiec utracie skrawków podczas analizy stereologicznej. Dodatkowo jednym z istotnych kroków jest zaznaczenie jednej półkuli w celu odróżnienia prawej od lewej SN podczas wykonywania stereologii. Umieszczenie maleńkiego otworu w górnej części pnia mózgu przyniosło najlepsze wyniki w prezentowanym badaniu. Ponadto, ponieważ praca z metodą frakcjonowania optycznego wymaga, aby tkanka była cięta na grube odcinki ok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

C. W. I. zasiadał w radach naukowych Merz Pharmaceuticals, LLC i TEVA; otrzymał dofinansowanie na podróż od firm Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC i Allergan, Inc.; i otrzymał honoraria mówców od Merz, TEVA i Allergan, Inc. poza zgłoszoną pracą. J. V. pełnił funkcję konsultanta dla Boston Scientific, Medtronic i AbbVie, a poza zgłoszoną pracą otrzymał honoraria od Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan i GlobalKinetics.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Keali Röhm, Louisie Frieß i Heike Menzel za ich fachową pomoc techniczną; Heldze Brünner za opiekę nad zwierzętami; oraz Chistopherowi S. Wardowi za generowanie i dystrybucję wtyczki optycznej siatki disektorowej dla oprogramowania ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
myszy PaxinosMózg myszy George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom zaprojektowany i stworzony przez Paula Halasza
Matrix Slicer MyszZivic InstrumentsBSMAS 001-1
paraformaldehydMerck1040051000
sacharoza /D(+) SacharozaRoth4621.1
izopentanRoth3927.1
glicerolMerck1040931000
EtanolSigma Aldrich32205-1L
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
fosforanowy buforowany sola fizjologiczna Składniki:
sodium chlorideSigma Aldrich31434-1KG-R
diwodorofosforan potasuMerck1048731000
wodorofosforan disodu dwuwodnyMerck1065801000
chlorek potasuMerck1049360500
normalna surowica koziaDakoX0907
albumina surowicy bydlęcejSigmaA4503-100G
Triton X-100Sigma AldrichX100-100mldetergent
3,3-diaminobenzydyna-tetrahydrochlorid/DAB tabletki 10mg pH 7,0Kem En Tec4170
H2O2/ Nadtlenek wodoru 30%Merck1072090250
awidyna/biotyna odczynnikThermo Scientific32050Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
królik przeciwciało przeciw mysiej hydroksylazie tyrozynowejabcamAb1121:1000
biotynylowane kozie przeciwciało anty-królikowe IgG H+Llaboratoria wektoroweBA-10001:100
StereoInvestigator wersja 11.07MBF
BX53mikroskop Olympus
VisiviewVisitron Systems GmbH3.3.0.2
Axiophot2Oprogramowanie Zeiss
ImageJNIHWersja 4.7
Tissue-TEK OCTSakura4583
siatki suchego lodu
Wayne Rasbandhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
wtyczka licznika komórekKurt de Voshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
disekcja optyczna makroChristopher Ward
C57Bl/6N samce myszyCharles River, Niemcy
Szkiełka obiektowe z powłoką SuperFrost PlusLangenbrinck, Niemcy
Igła 25G Microlance 3BD300400
REGLO Analogowa pompa infuzyjnaSystem IsmatecISM 829
StereoInvestigatorStereoInvestigator wersja 11.07
BX53Mikroskop BX53
samodzielna stereologiaVisiview
Axiophot2Axiophot2
Atlas Mózg wtyczka nakładki Mikroskop

Bibliografia

  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881(2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

M zg myszyhydroksylaza tyrozynowaobiektywna stereologialiczenie kom rekanaliza obrazu
Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.