Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

Podsumowanie

Ta praca przedstawia krok po kroku protokół bezstronnego stereologicznego szacowania liczby komórek neuronalnych dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego (tj. mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanej tabeli obiektów (płaszczyzna x, y, z) oraz oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu.

Streszczenie

W przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, analiza drogi nigrostriatalnej, w tym kwantyfikacja utraty neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej, jest niezbędna. Aby oszacować całkowitą liczbę neuronów dopaminergicznych, bezstronna stereologia przy użyciu metody frakcjonowania optycznego jest obecnie uważana za złoty standard. Ponieważ teoria stojąca za metodą frakcjonowania optycznego jest złożona, a stereologia jest trudna do osiągnięcia bez specjalistycznego sprzętu, istnieje kilka dostępnych na rynku kompletnych systemów stereologicznych, które zawierają niezbędne oprogramowanie, wyłącznie ze względu na liczenie komórek. Ponieważ zakup specjalistycznego zestawu do badań geologicznych nie zawsze jest wykonalny z wielu powodów, w niniejszym raporcie opisano metodę stereologicznego szacowania liczby dopaminergicznych komórek neuronalnych przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego, w tym mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanego stołu obiektów (płaszczyzna x, y, z) z oprogramowaniem do obrazowania oraz komputera do analizy. Podano wyjaśnienie krok po kroku, jak przeprowadzić stereologiczną kwantyfikację przy użyciu metody frakcjonowania optycznego, a także udostępniono wstępnie zaprogramowane pliki do obliczania szacowanej liczby komórek. Aby ocenić dokładność tej metody, przeprowadzono porównanie z danymi uzyskanymi z komercyjnie dostępnego aparatu do badania stereologicznego. Porównywalne liczby komórek znaleziono przy użyciu tego protokołu i urządzenia stereologicznego, demonstrując w ten sposób precyzję tego protokołu dla bezstronnej stereologii.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja liczby komórek neuronalnych jest kluczowa w przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, mającej na celu określenie poziomu neurodegeneracji w obrębie istoty czarnej (SN)^1,2. Bezstronne stereologiczne oszacowanie liczby komórek w obszarze zainteresowania jest uważane za złoty standard^3,4,5.

Przed nadejściem bezstronnej stereologii, liczba neuronów w sekcjach była oceniana poprzez manipulowanie zliczonymi profilami komórek, aby skorygować zmienne prawdopodobieństwa, że neurony pojawią się w zasięgu wzroku w sekcji. Jedną z najczęściej stosowanych metod była korekta ilościowo określonej liczby komórek opisana przez Abercrombie⁶. W tej metodzie starano się wziąć pod uwagę, że komórki mogą być oznaczane ilościowo więcej niż raz, jeśli fragmenty tej samej komórki zostaną znalezione w sąsiednich cienkich sekcjach. W związku z tym Abercrombie i inni autorzy stworzyli równania, które wymagały założeń dotyczących kształtu, rozmiaru i orientacji zliczanych komórek^7,8. Jednak założenia te zwykle nie były realizowane, a zatem prowadziły do błędów systematycznych i rozbieżności z rzeczywistą liczbą komórek (tj. stronniczości). Co więcej, odchylenie nie mogło zostać zmniejszone przez dodatkowe próbkowanie³.

Do stereologicznego szacowania liczby komórek za pomocą optycznego frakcjonatora, stosuje się zasady matematyczne do bezpośredniego szacowania liczby komórek bezpośrednio w określonej, trójwymiarowej objętości. Zaletą tej metody jest to, że nie wiąże się z założeniami dotyczącymi kształtu, rozmiaru i orientacji liczonych komórek. W związku z tym szacowane liczby komórek są bliższe rzeczywistym wartościom i zbliżają się wraz ze wzrostem wielkości próbki (tj. bezstronne)³. Ponieważ podczas korzystania ze stereologii należy przestrzegać wielu zasad, aby metoda była bezstronna, opracowano gotowe do użycia komercyjne systemy stereologii (przegląd patrz Schmitz i Hof, 2005⁴). Wyspecjalizowane systemy stereologiczne wdrażają metody stereologiczne oparte na projektowaniu z a priori zdefiniowanymi sondami i schematami próbkowania do ocen stereologicznych, które prowadzą do niezależności od kształtu, rozmiaru, rozkładu przestrzennego i orientacji analizowanych komórek^4,9. Jednak dostępne na rynku systemy stereologiczne są drogie; Może to ograniczyć implementację w nowych badaniach.

Celem tego badania było opracowanie użytecznej techniki do stereologicznego szacowania liczby komórek dopaminergicznych w mysim SN opartej na projektowaniu, wykorzystując metodę optycznego frakcjonowania i używając standardowego sprzętu do mikroskopii (tj. mikroskopu świetlnego, standardowego oprogramowania mikroskopu i zmotoryzowanego stolika x, y, z). W tym celu przedstawiono przewodnik krok po kroku, jak przetwarzać tkankę mózgową myszy i jak oszacować liczbę komórek SN przy użyciu bezstronnej stereologii opartej na projektowaniu. Ponadto dostępne są szablony do obliczania szacowanej liczby komórek i współczynników błędu (CE).

Opisana tutaj metoda nie ogranicza się do analizy SN, ale może być dostosowana do użycia w innych anatomicznie zdefiniowanych regionach mózgu myszy lub szczura. Na przykład, bezstronna stereologia została wykorzystana do oszacowania liczby komórek neuronalnych w hipokampie¹⁰ i locus coeruleus¹¹. Dodatkowo można również ocenić typy komórek inne niż neurony, takie jak astrocyty¹² i microglia¹³. Dlatego metoda ta może być przydatna dla naukowców, którzy zamierzają wdrożyć bezstronną stereologię w swoich badaniach, ale nie są skłonni wydawać dużych pieniędzy na zakup systemu stereologicznego.

Protokół

Wszystkie obowiązujące międzynarodowe, krajowe i/lub instytucjonalne wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt były przestrzegane. Protokół został zatwierdzony przez władze lokalne w Regierung von Unterfranken w Würzburgu w Niemczech.

1. Przetwarzanie tkanek i immunohistochemia

1. Eutanazja myszy za pomocą CO₂ lub innej zatwierdzonej metody.
2. Sześć 12-tygodniowych samców myszy C56Bl/6N należy przeprowadzić transsercowo za pomocą 10 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą igły 25 G i pompy infuzyjnej, a następnie 70 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M PBS.
   ostrożność: PFA jest toksyczny, alergizujący i rakotwórczy.
3. Wypreparuj mózg myszy w płaszczyźnie koronalnej za pomocą slicera macierzy mózgowej w obszarze +0,74 mm od Bregmy (Rysunek 25, atlas mózgu myszy Paxinos i Franklin atlas¹⁴).
4. Umieścić grzbietową część mózgu, w tym SN, w 4% PFA w 0,1 M PBS przez 1 d w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia przez zanurzenie.
5. Wymienić PFA na 30% roztwór sacharozy/0,1 mola PBS do krioochrony i inkubować przez kolejne 2 dni w temperaturze 4 °C.
6. Umieść grzbietową część mózgu w kriofordzie wypełnionym związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i powoli zamrażaj tkankę w płynnym, chłodzonym suchym lodem izopentanie.
   ostrożność: Suchy lód jest bardzo zimny (-78 °C); podczas pracy z suchym lodem należy używać środków ochrony osobistej (PPE), w tym rękawic. Suchy lód odparowuje w CO₂ ; Dlatego pracuj pod wyciągiem.
7. Seryjnie wytnij kriosekcje 30 μm w płaszczyźnie koronalnej i zbierz sekcje, zaczynając od 2,46 mm od Bregmy (Rysunek 51, Paxinos i atlas mózgu myszy Franklina¹⁴) i kończąc na 4,04 mm od Bregmy (Rysunek 64, atlas mózgu myszy Paxinos i Franklin¹⁴).
8. Przechowuj cztery serie w probówkach wypełnionych krioprotektantem (30% glicerolu, 30% etoksyetanolu i 40% PBS) w temperaturze -20 °C. Podczas procedury cięcia zaznacz prawą półkulę, nakłuwając mały otwór w górnej części pnia mózgu.
9. W przypadku barwienia immunohistochemicznego wybierz jedną serię sekcji na mysz. Wstępnie inkubować swobodnie pływające sekcje przez 1 godzinę w 10% normalnej surowicy koziej (NGS)/2% BSA/0,5% detergentu w 0,1 mola PBS na shakerze. Inkubować skrawki z króliczym przeciwciałem przeciw mysiej hydroksylazie tyrozynowej (TH; rozcieńczenie 1:1000) rozcieńczonym w 2% NGS/2% BSA/0,5% detergentu w 0,1 mola PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
10. Zastosować przeciwciała drugorzędowe przeciwko króliczemu Ig (rozcieńczenie 1:100) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie odczynnik awidyna/biotyna (rozcieńczenie 1:100). Inkubować i barwić tetrachlorowodorkiem 3,3-diaminobenzydyny (DAB) i_H2O2. Zamontuj sekcje po zabarwieniu ich na szkiełkach do powlekanych przedmiotów.
    UWAGA: Dopaminergiczne neurony SN TH+ są pokazane w Rysunek 1a. Poprzez barwienie jednej serii, średnio 13 odcinków SN, rozciągających się od części rostralnej do ogonowej SN pars compacta (SNpc) i reticulata, jest barwionych na zwierzę (Rysunek 1b). Sekcje są oddzielone od siebie 120 μm (seria 1/4) (Rysunek 1c).
    ostrożność: DAB jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. Jest toksyczny przez kontakt i wdychanie. Używaj środków ochrony osobistej podczas pracy z DAB.

2. Akwizycja obrazów

1. Cyfrowe uchwycenie immunohistochemicznie wybarwionych skrawków SN za pomocą oprogramowania do obrazowania, które jest sprzężone z mikroskopem. Osobno przeanalizuj każdą sekcję jednej serii.
2. Użyj opcji suwaka skanowania w oprogramowaniu do obrazowania. Zapisz w formacie TIFF, aby uzyskać obrazy o wysokiej jakości (Rysunek 2).
   UWAGA: Rozdzielczość obrazu wynosi 312 pikseli na cm.
3. Naciśnij "Pobierz", aby otworzyć okno akwizycji (Rysunek 2a).
4. Ustaw kategoryzację na "2" dla obrazów w skali szarości.
   UWAGA: Akwizycja obrazów w skali szarości zamiast obrazów kolorowych zmniejsza rozmiar końcowego pliku obrazu stosu (Rysunek 2a).
5. Kliknij "Pokaż na żywo" w oknie akwizycji, aby otworzyć nowe okno pokazujące obraz sekcji na żywo (Rysunek 2a i b).
6. Kliknij "Etap" w oknie akwizycji. Wybierz "Skanuj slajd" z menu rozwijanego i zaznacz pole (Rysunek 2c).
   UWAGA: Umożliwia to akwizycję i wyrównanie obrazów SN o dużym powiększeniu (powiększenie 630X) w płaszczyźnie x,y, a także akwizycję obrazów stosowych z odległością między kolejnymi obrazami 1 μm w płaszczyźnie z, obejmującą łączny zakres 13 μm.
7. Wybierz obiektyw 2,5X, aby wyszukać numer seryjny.
8. Zmień obiektyw na 63x.
9. Zdefiniuj lewy górny róg (Górny róg) (Rysunek 2c) i prawy dolny róg (Prawy dolny) (Rysunek 2d) sekcji, klikając "Ustaw".
10. Kliknij "Z-Series" i zaznacz pole "Z-Plane series" (Rysunek 2e).
11. Określ rzeczywistą grubość zamontowanych sekcji w trzech losowo wybranych miejscach zliczania na sekcję za pomocą oprogramowania do obrazowania. W tym celu kliknij "Wyświetl przesunięcie góry", aby zdefiniować górną część sekcji (Rysunek 2e), a następnie kliknij "Zatrzymaj widok górny" (Rysunek 2f). Następnie kliknij "Wyświetl przesunięcie dolne" (Rysunek 2f), a następnie kliknij "Zatrzymaj widok od dołu" (Rysunek 2g). Zapisz grubość przekroju.
12. Odejmij 3 μm (strefa ochronna) od górnego przesunięcia i wpisz wynik w górnej szczelinie przesunięcia (Rysunek 2h). Odejmij 13 μm (wysokość disektora optycznego) od numeru górnego przesunięcia i wpisz wynik w dolnej szczelinie przesunięcia (rysunek 2i). Wybierz następujące parametry: kroki, 14; rozmiar, 1,00 (Rysunek 2i).
    UWAGA: Odpowiada to grubości w płaszczyźnie z wynoszącej 13 μm, z odległością 1 μm między kolejnymi obrazami.
13. Wybierz katalog, w którym chcesz zapisać plik (Rysunek 2j).
14. Kliknij "Sekwencja", aby rozpocząć akwizycję (Rysunek 2j).
15. Kliknij "Przetwarzanie" i wybierz następujące parametry: "Wszystkie płaszczyzny", z "Sekwencja; " "Montaż; " oraz pola "Fast" (Szybko) i "Stitching (Łączenie") z nakładaniem się obrazów wynoszącym 10% (Rysunek 2k). Rozpocznij zszywanie obrazów, klikając "start".
    UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie obrazów stosu do analizy (Rysunek 2l, Rysunek 3a-e).

3. Sekwencja oceny stereologicznej

1. Wykonaj analizę obrazów stosu SN za pomocą oprogramowania NIH ImageJ w wersji 4.7.
2. Pobierz dwie potrzebne wtyczki ze strony internetowej ImageJ.nih.gov: wtyczkę "Grid Overlay"¹⁵ i wtyczkę "Cell Counter"¹⁶. Zainstaluj obie wtyczki zgodnie z opisem.
3. W celu bezstronnej oceny stereologicznej należy zdefiniować parametry zliczania w następujący sposób: rozmiar siatki 130 x 130 μm, ramka zliczająca 50 x 50 μm i wysokość disektora optycznego 13 μm.
4. Otwórz obraz, klikając "Plik" → "Otwórz" (Rysunek 4a) Ustaw skalę obrazu za pomocą polecenia "Analizuj" → "Ustaw skalę" (Rysunek 4b). Na tym etapie zmień zdefiniowany rozmiar z pikseli na μm (Rysunek 4c).
   UWAGA: Dla analizowanych obrazów 425 pikseli odpowiada 100 μm.
5. Wybierz polecenie "Wtyczki" → "Siatka" → "Typ siatki: Linie", aby losowo wstawić siatkę. Zaznacz pole "Losowe przesunięcie". Zdefiniuj rozmiar jednego kwadratu w siatce (kwadrat siatki) jako 130 μm x 130 μm = 16 900 μm² (Rysunek 3b i Rysunek 4d i e).
6. Zmień typ obrazu z 16-bitowego na kolor RGB (kliknij "Obraz" → "Typ" → "Kolor RGB") (Rysunek 4f). Zlokalizuj SNpc, zgodnie z opisem Baqueta i wsp.¹⁷. Otaczaj SNpc za pomocą narzędzia "Pędzel" (szerokość pędzla: 11) (Rysunek 3c i Rysunek 4g-i).
7. Cofnij polecenie "Ustaw skalę", klikając "Analizuj" → "Ustaw skalę" → "Kliknij, aby usunąć skalę" (Rysunek 4j-l), aby włączyć wykonywanie obliczeń w pikselach, a nie w μm.
8. Zrób zrzut ekranu (Rysunek 4m), zapisz plik obrazu i otwórz nowy plik za pomocą narzędzia ImageJ (Rysunek 4n). Wybierz "Punkt" (Rysunek 4o) i szerokość pędzla 25 (Rysunek 4p). Zaznacz każdy kwadrat siatki, który styka się z SN, w celu umieszczenia disektora optycznego (Rysunek 4q). Wykonaj analizę liczby komórek we wszystkich disektorach optycznych, które są zlokalizowane całkowicie lub częściowo w obrębie nakreślonego SN.
9. Wybierz jeden kwadrat siatki, który zawiera części SN. Zmierz lewy górny róg tego kwadratu za pomocą kursora na obrazie J, aby zdefiniować współrzędne x i y, od których należy zacząć (Rysunek 4r).
   UWAGA: Współrzędne zostaną wstawione do optycznego pozycjonowania disektora za pomocą "pozycji optycznej disektora" (rysunek 4s), jak opisano w kroku 4.
10. Oblicz pozycję dysektora optycznego, korzystając z szablonu arkusza kalkulacyjnego zatytułowanego "Pozycja dysektora optycznego", zgodnie z opisem w kroku 4.
11. Skalibruj disektorię optyczną (makro napisane przez Christophera S. Warda, plik uzupełniający), klikając "Wtyczki" → "Makra" → "Edytuj" (Rysunek 4t), otwórz plik "opt_dis_grid.txt" (Rysunek 4u) i zdefiniuj rozmiar "siatki użytkownika" w pikselach, który odpowiada wymiarowi x,y disektora optycznego (Rysunek 4v). Wybierz rozmiar 50 μm x 50 μm, tak aby rozmiar jednej strony siatki użytkownika był zdefiniowany jako 212,5 piksela (50 x 4,25 piksela).
12. Określ położenie disektora optycznego na obrazie stosu, wstawiając współrzędne ImageX i ImageY, które definiują środek disektora optycznego (Rysunek 4v). Uruchom makro ("Makra" → "Uruchom makro") (Rysunek 4w).
    UWAGA: Siatka zniknie z obrazu stosu (Rysunek 3d i Rysunek 4x). Disektor optyczny będzie się utrzymywał podczas przesuwania się w dół w płaszczyźnie z (Rysunek 3e i Rysunek 4x).
13. Wybierz "Wtyczki" → "Licznik komórek", aby uruchomić wtyczkę licznika komórek (Rysunek 4y). Zainicjuj licznik komórek i wybierz typ znacznika (Rysunek 4z). Powiększ obraz (kliknij "+") i wykonaj stereologiczną ocenę liczby komórek w powiększeniu 200%.
14. Zidentyfikuj dopaminergiczne perykarya neuronalne na podstawie ich zaokrąglonego lub jajowatego kształtu i wielkości komórki (Rysunek 1a). Określ ilościowo liczbę komórek za pomocą reguł stereologicznych.
    UWAGA: Ponieważ disektor optyczny jest trójwymiarowym sześcianem (Rysunek 5a), zdefiniuj boki wykluczenia jako przednią, lewą i górną stronę sześcianu (czerwony). Dlatego nie licz komórek TH+, które stykają się ani z czerwoną linią (lewą i przód), ani z górną stroną. Dodaj wyniki inwentaryzacji komórek do przygotowanego pliku arkusza kalkulacyjnego zatytułowanego "Obliczanie liczby komórek" (krok 5).
15. Zgodnie z obrazem SN oblicz następny kwadrat siatki, w którym umieścisz disektor optyczny dla następnego zliczenia komórek, używając kroków x,y rozmiaru nałożonej siatki (Rysunek 5b) i szablonu arkusza kalkulacyjnego "Pozycja disektora optycznego", jak opisano w kroku 4.
16. Wykonaj oszacowanie liczby komórek za pomocą arkusza kalkulacyjnego "Obliczanie liczby komórek" (krok 5).

4. Obliczanie pozycji disektora optycznego za pomocą szablonu arkusza kalkulacyjnego "Pozycja disektora optycznego"

1. Oblicz rozmiar i położenie każdej dysektora optycznej, która ma zostać umieszczona w nałożonej siatce w obrysie SN (Rysunek 5b) za pomocą pliku arkusza kalkulacyjnego "Optical disector position.xlsx" (Plik uzupełniający).
2. Wstaw konwersję pikseli na μm, zgodnie z poleceniem "Ustaw skalę", do zaznaczonych na żółto pozycji pliku "Optical disector position.xlsx" (Rysunek 6a i plik uzupełniający).
3. Wstawić planowany rozmiar dysektora optycznego i rozmiar kwadratu siatki nałożonej na siebie, określony przez długość jednego boku (w μm), w miejscach oznaczonych na pomarańczowo.
   UWAGA: Wyniki są przedstawione w czerwonych polach obok pomarańczowych pól.
4. Zacznij od kwadratu siatki w obrysie SN, który został określony jako punkt początkowy (na początek wybrano jeden kwadrat siatki, jak w kroku 3.9 powyżej).
5. Wstaw współrzędne x i y, zgodnie z pomiarami w kroku 3.9, do zielonych pól pliku (przy użyciu tych wartości obliczane są współrzędne x,y środka dysektora optycznego w tym pierwszym kwadracie, a wyniki są przedstawiane w niebieskich polach). Uruchom makro opt_dis_grid.txt (plik uzupełniający).
6. Oblicz współrzędne x,y kolejnych disektorów optycznych, wstawiając odległość siatka do kwadratu (mierzona w liczbie kwadratów) względem pierwszego kwadratu siatki (brązowe pola).
   UWAGA: +x: kwadrat siatki znajduje się po prawej stronie; -x: kwadrat siatki znajduje się po lewej stronie; +y: kwadrat siatki znajduje się na dole; -y: kwadrat siatki znajduje się na górze. Wyniki są wyświetlane w szarych polach.

5. Szacowanie liczby komórek za pomocą arkusza kalkulacyjnego "Obliczanie liczby komórek"

1. Oblicz szacowaną liczbę komórek SN TH+ na zwierzę (N) za pomocą wzoru opublikowanego przez West et al., 1991³, gdzie ∑Q^- definiuje się jako całkowitą liczbę neuronów TH+ zliczonych we wszystkich disektorach optycznych jednej sekcji mózgu.
   UWAGA: Wysokość dysektora optycznego (h) w stosunku do zmierzonej grubości przekroju (t) jest uwzględniona w równaniu. Frakcja próbkowania powierzchniowego (asf) jest zdefiniowana jako proporcja powierzchni (A) rozmiaru ramy disektora optycznego (disektor optyczny) w rozmiarze kwadratu siatki (krok x,y) (krok A optyczna/krok x,y) (Rysunek 3b), a frakcja próbkowania sekcji (ssf) jest zdefiniowana jako proporcja sekcji całego seryjnie ciętego mózgu:
   
   Aby zapewnić wysoką jakość szacunków ilościowych, współczynnik błędu (CE) powinien być niższy niż 0,10. Określ CE za pomocą wzoru Keuker et al., 2001¹⁰:
   
2. W celu stereologicznego oszacowania liczby komórek w SN każdej myszy należy wprowadzić wskazane informacje dotyczące całkowitej liczby wygenerowanych serii na mysz, wysokości disektora optycznego, obszaru x,y disektora optycznego (Disektor optyczny A, w μm²), pola x,y kwadratu siatki (A x, krok y, w μm²) oraz średnią zmierzoną grubość przekroju (w μm) w żółtych polach za pomocą pliku arkusza kalkulacyjnego "Obliczanie count.xlsx komórki" (Rysunek 6b i plik uzupełniający).
3. Przeanalizuj każdy odcinek SN tego samego zwierzęcia, jak opisano w kroku 5.
4. Wstaw liczbę komórek dla każdej disektora optycznego w szarych polach, przy czym każda linia odnosi się do jednej sekcji SN, korzystając z pliku arkusza kalkulacyjnego "Obliczanie count.xlsx komórki" (plik uzupełniający).
   UWAGA: Szacowana liczba komórek i obliczone CE są przedstawione w niebieskich polach (Rysunek 6b).

6. Szacowanie liczby komórek za pomocą dostępnego na rynku systemu stereologicznego

1. Rozpocznij szacowanie liczby komórek dopaminergicznego SNpc, klikając "Sondy" → "Przepływ pracy frakcjonatora optycznego", aby otworzyć okno przepływu pracy frakcjonowania optycznego.
   UWAGA: Pojawi się nowe okno, w którym można określić, czy zostanie policzona nowa seria SN.
2. Rozpocznij nową serię sekcji TH+ SN, klikając "Rozpocznij nowy temat" w wyskakującym okienku.
3. Przejdź przez różne etapy przepływu pracy frakcjonatora optycznego. Skonfiguruj temat w pierwszym kroku. W tym celu należy wpisać imię i nazwisko badacza, imię i nazwisko podmiotu (grupa SN) oraz inne przydatne informacje. Wstaw numery sekcji do zliczenia dla tego numeru seryjnego. Wstaw grubość wyciętych skrawków tkanki. Wstaw interwał sekcji, który w tym przypadku wynosi cztery. Na początek wstaw losowo określony numer sekcji.
4. W drugim kroku ustaw mikroskop na niskie powiększenie (obiektyw 2X) i wybierz z menu "2X Mag Lens".
5. W kroku 3 prześledź obszar zainteresowania za pomocą lewego przycisku myszy, którym jest SNpc, zgodnie z opisem Baquet et al., 2009¹⁷.
6. Ustaw mikroskop na duże powiększenie w kroku 4. W tym celu zmień obiektyw na 100X i wybierz "Soczewka 100X Mag" z menu rozwijanego.
7. Zmierz grubość zamontowanej w kroku 5, skupiając się na górze i na dole sekcji.
8. W kroku 6 zdefiniuj rozmiar ramki zliczającej jako 50 x 50 μm; jest to rozmiar disektora optycznego (x,y).
9. W kroku 7 ustaw rozmiar siatki systematycznego losowego pobierania próbek (SRS) na 130 x 130 μm.
10. Wprowadź strefę ochronną 3 μm w kroku 8.
11. Zapisz ustawienia w kroku 9.
12. Na koniec policz komórki dopaminergiczne TH+ w każdej z disektorów optycznych w siatce SRS w kroku 10 przepływu pracy frakcjonatora optycznego. W tym celu zacznij od kliknięcia przycisku "Liczenie".
13. Po zakończeniu jednej sekcji kliknij przycisk "Rozpocznij następną sekcję", aby rozpocząć przepływ pracy frakcjonatora optycznego następnej sekcji SN tej samej serii SN.
14. Po ilościowym określeniu ostatniego odcinka SN jednej serii SN kliknij "I've Finished Counting" (Zakończyłem liczenie).
15. Kliknij przycisk "Wyświetl wyniki", aby wyświetlić wyniki pobierania próbek stereologicznych.

Wyniki

Przy użyciu przedstawionej metody, szacowana liczba neuronów dopaminergicznych TH+ w prawym SN wahała się między 7 363 a 7 987 komórek, a w lewym SN między 7 446 a 7 904 komórek. Zatem średnia liczba neuronów dopaminergicznych (± SEM) wynosiła 7647 ± 83 komórek dla prawego SN i 7675 ± 66 dla lewego SN. Obliczone CE dla każdego zwierzęcia było niższe niż 0,08 (zakres: 0,073-0,079) (Rysunek 7). Aby zapewnić porównywalność tej metody z dostępnymi na rynku i specjalistyczn...

Dyskusja

Stereologia zaczyna się od przetwarzania tkanek. Seryjne cięcie tkanki SN musi być wykonywane ostrożnie, aby zapobiec utracie skrawków podczas analizy stereologicznej. Dodatkowo jednym z istotnych kroków jest zaznaczenie jednej półkuli w celu odróżnienia prawej od lewej SN podczas wykonywania stereologii. Umieszczenie maleńkiego otworu w górnej części pnia mózgu przyniosło najlepsze wyniki w prezentowanym badaniu. Ponadto, ponieważ praca z metodą frakcjonowania optycznego wymaga, aby tkanka była cięta na grube odcinki ok...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		myszy Paxinos	Mózg myszy George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom zaprojektowany i stworzony przez Paula Halasza
Matrix Slicer Mysz	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyd	Merck	1040051000
sacharoza /D(+) Sacharoza	Roth	4621.1
izopentan	Roth	3927.1
glicerol	Merck	1040931000
Etanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
fosforanowy buforowany sola fizjologiczna Składniki:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
diwodorofosforan potasu	Merck	1048731000
wodorofosforan disodu dwuwodny	Merck	1065801000
chlorek potasu	Merck	1049360500
normalna surowica kozia	Dako	X0907
albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-diaminobenzydyna-tetrahydrochlorid/DAB tabletki 10mg pH 7,0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Nadtlenek wodoru 30%	Merck	1072090250
awidyna/biotyna odczynnik	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
królik przeciwciało przeciw mysiej hydroksylazie tyrozynowej	abcam	Ab112	1:1000
biotynylowane kozie przeciwciało anty-królikowe IgG H+L	laboratoria wektorowe	BA-1000	1:100
StereoInvestigator wersja 11.07	MBF
BX53	mikroskop Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Oprogramowanie Zeiss
ImageJ	NIH	Wersja 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
siatki suchego lodu
	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
wtyczka licznika komórek	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
disekcja optyczna makro	Christopher Ward
C57Bl/6N samce myszy	Charles River, Niemcy
Szkiełka obiektowe z powłoką SuperFrost Plus	Langenbrinck, Niemcy
Igła 25G Microlance 3	BD	300400
REGLO Analogowa pompa infuzyjna	System Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator			StereoInvestigator wersja 11.07
		BX53	Mikroskop BX53
samodzielna stereologia			Visiview
Axiophot2			Axiophot2