Tworzenie i stosowanie odniesienia w celu ułatwienia dyskusji i klasyfikacji białek w zróżnicowanej grupie

Summary

Celem tego protokołu jest opracowanie odniesienia dla rozbieżnych białek w grupie, która nie ma spójnych kryteriów nomenklatury i klasyfikacji. Odniesienie to ułatwi analizy i dyskusję na temat grupy jako całości i może być używane jako uzupełnienie ustalonych nazw.

Abstract

Powiązane białka, które były badane w różnych laboratoriach przy użyciu różnych organizmów, mogą nie mieć jednolitego systemu nazewnictwa i klasyfikacji, co utrudnia dyskusję na temat grupy jako całości i umieszczanie nowych sekwencji w odpowiednim kontekście. Opracowanie odniesienia, które nadaje priorytet ważnym cechom sekwencji związanym ze strukturą i/lub aktywnością, może być wykorzystane jako dodatek do ustalonych nazw, aby dodać pewną spójność do zróżnicowanej grupy białek. W tym artykule wykorzystano nadrodzinę alfa-helisy stabilizowanej cysteiną (CS-αβ) jako przykład, aby pokazać, w jaki sposób odniesienie wygenerowane w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego może wyjaśnić relacje między istniejącymi białkami w nadrodzinie, a także ułatwić dodawanie nowych sekwencji. Pokazuje również, w jaki sposób odniesienie może pomóc w udoskonaleniu dopasowań sekwencji generowanych w powszechnie używanym oprogramowaniu, co wpływa na ważność analiz filogenetycznych. Użycie odniesienia będzie prawdopodobnie najbardziej pomocne w przypadku grup białek, które obejmują wysoce rozbieżne sekwencje z szerokiego spektrum taksonów, z cechami, które nie są odpowiednio uchwycone przez analizy molekularne.

Introduction

Nazwa białka powinna odzwierciedlać jego cechy i związek z innymi białkami. Niestety, imiona są zazwyczaj nadawane w momencie odkrycia, a wraz z postępem badań rozumienie szerszego kontekstu może się zmieniać. Może to prowadzić do wielu nazw, jeśli białko zostało niezależnie zidentyfikowane przez więcej niż jedno laboratorium, do zmian w nomenklaturze lub cechach uznawanych za ostateczne przy przypisywaniu nazwy oraz do tego, że nazwa nie odróżnia już wystarczająco białka od innych.

Defensyny bezkręgowców stanowią dobry przykład degeneracji w nomenklaturze i klasyfikacji. Pierwsze defensyny bezkręgowców zostały zgłoszone przez owady, a nazwa "defensyna owadów" została zaproponowana w oparciu o postrzeganą homologię do defensyn ssaków^1,2. Termin defensyna jest nadal używany, mimo że obecnie jest jasne, że defensyny bezkręgowców i ssaków nie mają wspólnego przodka^3,4. W zależności od gatunku, bezkręgowiec "defensyna" może mieć sześć lub osiem cystein (które tworzą trzy lub cztery wiązania dwusiarczkowe) i różne działania przeciwdrobnoustrojowe. Sytuację komplikuje fakt, że białka o tych samych cechach co defensyny nie zawsze są nazywane "defensynami", jak na przykład niedawno zidentyfikowane kremycyny z Caenorhabditis remanei⁵. Ponadto duże defensyny bezkręgowców są bardziej skłonne do ewolucyjnego pokrewieństwa z β-defensynami kręgowców niż z innymi defensynami bezkręgowców⁶. Mimo to badacze czasami opierają się na nazwie "defensyna" przy określaniu, które sekwencje powinny zostać uwzględnione w analizach.

Badania strukturalne wykazały podobieństwo między defensynami owadów a toksynami skorpionów⁷, a fałda CS-αβ została następnie uznana za definiującą cechę strukturalną defensyn owadów⁸. To zagięcie definiuje nadrodzinę podobną do toksyny skorpiona (CS-αβ) w bazie danych Strukturalnej Klasyfikacji Białek (SCOP)⁹, która obecnie obejmuje pięć rodzin: defensyny owadów, krótkołańcuchowe toksyny skorpionów, długołańcuchowe toksyny skorpionów, MGD-1 (z) i defensyny roślinne. Ta nadrodzina jest synonimem niedawno opisanej klasy cis-defensins⁴ i nadrodziny 3.30.30.10 w bazie danych CATH/Gene 3D^10,11. Badania nad różnymi taksonami bezkręgowców, roślinami i grzybami pokazują, że nazwy białek zawierających ten fałd nie są wyraźnie związane z liczbą cysteiny lub wzorcem wiązań, aktywnością przeciwdrobnoustrojową lub historią ewolucyjną¹².

Brak spójności i jasnych kryteriów utrudnia nazwanie i sklasyfikowanie nowo zidentyfikowanych sekwencji w tej nadrodzinie. Główną przeszkodą w porównywaniu białek w tej nadrodzinie jest to, że cysteiny są ponumerowane w odniesieniu do każdej pojedynczej sekwencji (pierwsza cysteina w każdej sekwencji to C1), bez możliwości wyjaśnienia roli strukturalnej. Oznacza to, że można porównywać tylko sekwencje o tej samej liczbie cystein. Zachowanie sekwencji jest niewielkie, poza cysteinami tworzącymi fałd CS-αβ, co utrudnia wyrównanie i analizy filogenetyczne. Opracowując system numeracji, który nadaje priorytet cechom konstrukcyjnym, sekwencje nadrodzin mogą być łatwiej porównywane i dopasowywane. Cechy zachowane, a także te definiujące podgrupy, mogą być szybko wizualizowane, a nowe sekwencje mogą być łatwiej umieszczane w odpowiednim kontekście.

Ten artykuł wykorzystuje arkusz kalkulacyjny (np. Excel) do wygenerowania systemu numeracji referencyjnej dla nadrodziny CS-αβ. Pokazuje, w jaki sposób wyjaśnia to porównania między sekwencjami i stosuje je do nowych sekwencji CS-αβ zidentyfikowanych z niesporczaków. Na przykładzie nadrodziny CS-αβ protokół został napisany w celu zapewnienia wskazówek podczas korzystania z sekwencji będących przedmiotem zainteresowania; Nie jest jednak przeznaczony do bycia specyficznym dla tej nadrodziny lub sekwencji bogatych w cysteinę. Metoda ta będzie prawdopodobnie najbardziej przydatna dla grup białek, które były badane niezależnie w rozbieżnych taksonach i/lub mają niewielką ogólną homologię sekwencji, z dyskretnymi cechami, które mogą nie być łatwo rozpoznane przez oprogramowanie do analizy molekularnej. Ta metoda wymaga pewnych decyzji a priori dotyczących ważnych cech, więc będzie miała ograniczoną użyteczność, jeśli nie zostaną zidentyfikowane żadne ważne cechy. Podstawowym celem jest pokazanie, w jaki sposób można osiągnąć prostą wizualizację relacji sekwencyjnych. Można to następnie wykorzystać do informowania o wyrównaniu i analizie sekwencji, ale jeśli wyrównanie i analiza są głównymi celami, metoda kodów kreskowych byłaby odpowiednią alternatywą, która ma większe możliwości automatyzacji¹³. Obecna metoda wyświetla cechy każdego peptydu w formie liniowej, więc nie będzie pomocna w bezpośredniej wizualizacji struktury 3D.

Protocol

1. Określ cechy definiujące grupę białek będących przedmiotem zainteresowania

1. Zapoznaj się z poprzednimi publikacjami, aby ustalić, czy istnieje konsensus co do cech, które są niezbędne, aby zostać uznanym za część grupy. Zwróć uwagę na wszelkie niespójności lub różnice w opiniach między grupami badawczymi i uwzględnij cechy, które mogą służyć do odróżnienia jednej podgrupy od drugiej.
2. Jeśli poprzednia literatura nie dotyczyła cech definiujących, użyj sekwencji, które są uważane za reprezentatywne dla grupy, jako punktu wyjścia do identyfikacji cech konserwatywnych.

2. Zbierz odpowiednie sekwencje

1. Jeśli napisano recenzje, które zawierają analizy sekwencji reprezentujących grupę, uwzględnij te sekwencje w nieprzetworzonym zestawie danych. Pobieraj sekwencje za pomocą numerów dostępu, do których odwołuje się literatura, i zapisz je w standardowym programie do edycji sekwencji (np. EditSeq w pakiecie Lasergene lub jednym z wielu dostępnych za darmo w Internecie).
2. Jeśli dana grupa została zdefiniowana w jednej ze strukturalnych baz danych, należy dołączyć sekwencje, które baza danych wymienia jako część grupy. Pobierz sekwencje, korzystając z numerów dostępu podanych w bazie danych i zapisz w standardowym programie do edycji sekwencji, jak wyżej.
   UWAGA: Na przykład sekwencje skategoryzowane w nadrodzinie CS-αβ (podobnej do toksyny skorpiona) w bazie danych SCOP można znaleźć tutaj: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. Wykonaj wyszukiwanie w Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)¹⁴ publicznych bazach danych online dostępnych za pośrednictwem National Center for Biotechnology Information (NCBI) w celu znalezienia sekwencji, które mogły nie zostać uwzględnione w literaturze lub strukturalnych bazach danych. Aby uzyskać najbardziej kompletne wyniki, należy użyć zarówno programu BLAST (blastp), jak i translacji blast with protein query (tblastn); Oba są dostępne pod adresem: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   1. Użyj sekwencji, o których wiadomo, że są częścią grupy zainteresowania, jako sekwencji zapytań. Skopiuj i wklej sekwencję w polu wyszukiwania u góry lub podaj numer dostępu GenBank lub identyfikator gi, jeśli jest dostępny.
   2. Wybierz bazę danych z menu rozwijanego. Wybierz nieredundantne sekwencje białek (nr) dla blastp i wyrażone znaczniki sekwencji dla tblastn.
   3. Wyszukiwanie wyników w określonych taksonach w otoczeniu organizmu należy wpisać nazwę organizmu lub taksonu i wybrać z listy, która pojawia się podczas wpisywania. Aby dodać dodatkowe organizmy lub taksony do wykluczenia, kliknij przycisk "+", a pojawi się kolejne pole. Wyklucz wszelkie niechciane taksony w polu organizmu, wpisując nazwę organizmu lub taksonu, wybierając z listy, która pojawia się podczas pisania, i zaznaczając pole "Wyklucz" po prawej stronie.
   4. Uzyskaj dostęp do dodatkowych parametrów, klikając "Parametry algorytmu" u dołu strony. Pozostaw wartość domyślną, chyba że istnieje uzasadnienie zmiany parametru.
   5. Kliknij przycisk "BLAST", aby uruchomić analizę; może minąć trochę czasu, zanim pojawią się wyniki. Ogólnie rzecz biorąc, pobieraj trafienia z oczekiwaną wartością (lub wartością e) "-05" lub lepszą i zapisuj je w standardowym programie do edycji sekwencji.
      1. Jeśli wszystkie trafienia przekraczają ten próg, uruchom ponownie wyszukiwanie ze zwiększoną liczbą sekwencji docelowych (w sekcji parametrów algorytmu), aby uzyskać wszystkie odpowiednie sekwencje.
4. W razie potrzeby przyciąć sekwencje, aby wykluczyć nieistotne informacje (np. fałd CS-αβ dotyczy tylko dojrzałego peptydu). Zidentyfikuj peptydy sygnałowe i pro-peptydy do usunięcia za pomocą ProP¹⁵ (dostępny online) lub SignalP dla bardziej zaawansowanego przewidywania peptydów sygnałowych¹⁶ (dostępny online).

3. Wygeneruj odniesienie w arkuszu kalkulacyjnym na podstawie ważnych cech, które zostały zidentyfikowane

1. Zidentyfikuj cechy definiujące grupę interesów. Na przykład, użyj fałdu CS-αβ ostatecznie ustalonego przez strukturę roztworu defensyny A owadów z Phormia terraenovae (Rysunek 1)⁸.
   1. To zagięcie zawiera mniejszy motyw zwany helisą stabilizowaną cysteiną (CSH)¹⁷; zidentyfikuj ten motyw za pomocą CXXXC (gdzie X jest dowolnym aminokwasem) przed CXC, które tworzą dwa wiązania dwusiarczkowe (Rysunek 1, ciągłe różowe linie).
      UWAGA: Aby uzupełnić motyw CS-αβ, trzecie wiązanie dwusiarczkowe jest tworzone z dodatkowych cystein umieszczonych przed każdą połową motywu CSH (Rysunek 1, przerywane różowe linie).
2. Wprowadź te definiujące cechy do arkusza kalkulacyjnego. Zobacz Rysunek 2.
   1. Kolumny służą do reprezentowania zachowanych obiektów oraz do reprezentowania odstępów między tymi obiektami. Kolumny powinny być wystarczająco szerokie, aby zmieściły się w liczbach, i upewnij się, że mają stałą szerokość. Ustaw szerokość za pomocą opcji "Format| Szerokość kolumny" (Rysunek 2, różowa strzałka).
   2. Użyj wierszy dla nazw sekwencji.
   3. Gdy sekwencja ma tę cechę, wypełnij pole za pomocą funkcji fill (Rysunek 2, różowy kwadrat). W przypadku odstępów między obiektami wprowadź liczbę aminokwasów w polu pomiędzy nimi i pozostaw je niewypełnione. Na przykład użycie sekwencji defensyny owadów daje odniesienie, które obejmuje sześć cystein, z określonymi odstępami między C2 i C3 oraz między C5 i C6.
3. Dodaj reprezentatywne sekwencje, które zostały wcześniej ustalone jako członkowie grupy na podstawie strukturalnych baz danych i literatury.
   UWAGA: Na przykład wcześniejsza literatura i baza danych SCOP identyfikują kilka grup do włączenia: defensyny owadów, krótkołańcuchowe toksyny skorpionów, długołańcuchowe toksyny skorpionów, MGD-1, defensyny roślinne, nicienie ABF, drosomycyny z Drosophila i macyny. Literatura identyfikuje również sekwencję bakteryjną z tylko czterema cysteinami, które mogą reprezentować przodka tej nadrodziny¹⁸. Dodanie tych sekwencji zwiększa liczbę cystein w odniesieniu z sześciu do dziesięciu, ale utrzymuje wyrównanie ważnych cech strukturalnych (Rysunek 3).
   1. Aby dodać cechę, która prawdopodobnie zdefiniuje podgrupę sekwencji (na przykład dodatkową cysteinę), użyj funkcji "Wstaw" (Rysunek 3, różowa strzałka).
   2. Jeśli w danej sekwencji brakuje cech, pozostaw pole niewypełnione i połącz je z polami reprezentującymi aminokwasy pośrednie. W razie potrzeby scal komórki za pomocą funkcji scalania i centrowania (Rysunek 3, różowe pole).
4. Kontynuuj dodawanie sekwencji do grup, aby uzyskać lepszy obraz zmienności w każdej grupie większej nadrodziny. Podsumuj charakterystykę grupy, aby ułatwić porównania (Rysunek 4).
   1. Gdy liczba aminokwasów między głównymi cechami jest różna, użyj łącznika, aby wskazać zakres, na przykład 6 - 12 (6 do 12 aminokwasów) i ukośnika, aby wskazać albo/lub, na przykład 7/10 (7 lub 10 aminokwasów).
   2. Wybierz sposób opisywania cech sekwencji, które mogą być istotne, ale nie występują na tyle często, aby można je było uwzględnić w odwołaniu. Na przykład, ponieważ cysteiny są ważne w tej nadrodzinie, oznacz dodatkowe cysteiny (Rysunek 4, różowe pola).
5. Dodaj nowo zidentyfikowane sekwencje do arkusza kalkulacyjnego, korzystając z ustalonych sekwencji jako przewodnika. Na przykład, dodanie sekwencji niesporczaków (żółty) pokazuje, że sekwencje niesporczaków należą do kilku różnych grup nadrodziny (Rysunek 5 pokazuje podsumowania zamiast wiersza na sekwencję dla celów kosmicznych).
6. Pokazanie zmienności w obrębie grupy taksonomicznej poprzez przegrupowanie wierszy (Rysunek 6).

4. Użyj referencji, aby uściślić wyrównanie aminokwasów

UWAGA: Istnieje wiele programów, które mogą być używane do wielokrotnego dopasowania sekwencji, ale ta demonstracja użyje Molekularnej Analizy Genetyki Ewolucyjnej (MEGA6)¹⁹, ponieważ jest ona dostępna do pobrania za darmo.

1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie.
2. Rozpocznij nowe wyrównanie w MEGA, wybierając "Edytuj/Zbuduj wyrównanie" na karcie Wyrównaj. Wybierz "Utwórz nowe wyrównanie" w wyświetlonym polu i kliknij "OK". Następnie wybierz "Białko".
3. Wybierz "Wstaw sekwencję z pliku" w menu "Edycja", aby zaimportować sekwencje.
   UWAGA: Sekwencje będą musiały być w formacie FASTA, aby można je było zaimportować do MEGA. Kolory tła, które odzwierciedlają różne typy aminokwasów, są używane domyślnie, ale tę opcję można wyłączyć w menu "Wyświetlacz".
4. Po wprowadzeniu wszystkich sekwencji kliknij ikonę zginanego ramienia, a następnie "Wyrównaj białko", aby wyrównać sekwencje za pomocą algorytmu MUSCLE ²⁰.
   UWAGA: ClustalW jest również dostępny.
   1. Jeśli pojawi się komunikat informujący, że nic nie zostało zaznaczone i prosi o zaznaczenie wszystkiego, kliknij "OK".
   2. UWAGA: Otwiera się okno, w którym można zmienić niektóre parametry, ale należy je zmieniać tylko wtedy, gdy jest ku temu powód. W tej analizie użyto podzbioru sekwencji analizowanych w poprzednim artykule¹².
5. Sprawdź wyrównanie w oparciu o ważne cechy; zwróć uwagę, że górny pasek nad sekwencjami pokaże wszystkie kolumny, w których aminokwas jest całkowicie konserwatywny (*). Zobacz Rysunek 7. Zobacz, że początkowe wyrównanie pokazuje tylko trzy z czterech konserwatywnych cystein (Rysunek 7, różowe pola); patrząc w dół kolumny, sekwencja AlCRP jest wyraźnie niewyrównana (Rysunek 7, różowa strzałka).
6. Aby pozbyć się dużej przerwy między I a zachowanym C, zaznacz kreski i naciśnij "usuń". Nie zaznaczaj żadnych aminokwasów, ponieważ one również zostaną usunięte.
7. Aby przesunąć aminokwasy w prawo, podświetl i naciśnij spację.
   1. Zauważ, że AlCRP ma teraz wyrównane cysteiny strukturalne i że ostatnie C motywu CXXXC jest zachowane w całym wyrównaniu (Rysunek 8). W razie potrzeby dostosuj wyrównanie, aby nadać priorytet najważniejszym cechom sekwencji.

5. Porównaj grupy zidentyfikowane za pomocą referencji z wynikami analiz filogenetycznych

1. Na podstawie wstępnych dopasowań określ, które sekwencje powinny zostać uwzględnione w analizie filogenetycznej; w przypadku niewielkiej liczby sekwencji ten krok może być zbędny.
   1. Zachowaj plik wyrównania, który zawiera wszystkie sekwencje, ale w przypadku analizy filogenetycznej usuń zbędne sekwencje (Rysunek 9, różowe pola pokazują pary nadmiarowych sekwencji).
   2. Jeśli zbiór danych zawiera dużą liczbę sekwencji, należy przeprowadzić wstępną analizę i wybrać przedstawicieli z grup, które zawsze tworzą klad.
2. Określ najlepszy model podstawiania aminokwasów.
   1. Eksportuj wyrównanie w formacie MEGA (w zakładce danych).
   2. Przejdź do menu Modele i wybierz "Znajdź najlepszy model DNA/białka". Wybierz właśnie zapisany plik i otwórz go; otworzy się okno z pewnymi parametrami, które można zmienić.
   3. Użyj parametrów domyślnych, chyba że istnieje powód do ich zmiany. Kliknij "Oblicz", aby rozpocząć analizę.
3. Przeprowadź analizę maksymalnego prawdopodobieństwa (ML) w MEGA.
   1. Wybierz "Zbuduj/Przetestuj Drzewo Maksymalnego Prawdopodobieństwa" z menu Filogeneza.
   2. Wybierz model uznany za najlepiej pasujący do danych z kroku 5.2 (dane wyjściowe będą zawierać model podstawiania, a także najlepszy parametr "stawki wśród witryn").
   3. Wybierz 1 000 replik bootstrap, aby uzyskać miary wsparcia dla drzewa.
   4. Kliknij "Oblicz", aby uruchomić analizę; MEGA posiada "Eksploratora drzewa" do wizualizacji drzewa.
4. Uruchom analizę bayesowską w oprogramowaniu open source MrBayes²¹.
   UWAGA: Podręcznik MrBayes jest również dostępny na tej stronie. Ma to na celu przedstawienie podstawowych kroków i nie jest wyczerpującym przewodnikiem po przeprowadzaniu bayesowskiej analizy filogenetycznej.
   1. Wyeksportuj wyrównanie MEGA w formacie PAUP (Nexus) do tego samego folderu, co program MrBayes.
   2. Otwórz MrBayes i wpisz "exe Filename" (np. "exe Alignment.nex").
   3. Określ parametry modelu i analizy. Wybierz model określony w kroku 5.2 lub wybierz ustawienie "mieszane", które wypróbuje różne modele i podaje częstotliwość modelu na drzewach z najlepszymi prawdopodobieństwami a posteriori (prset aamodelpr=mixed). Wpisz "showmodel", aby zgłosić bieżące ustawienia modelu i "help mcmc", aby wyświetlić bieżące ustawienia parametrów wraz z krótkim wyjaśnieniem każdego z nich.
   4. Ustaw liczbę generacji za pomocą polecenia "mcmcp ngen=" (typowo 1 milion).
   5. Wpisz "mcmc", aby rozpocząć analizę.
   6. Gdy liczba pokoleń zostanie ukończona, program poprosi o dodanie kolejnych pokoleń. Jeśli średnie odchylenie standardowe częstotliwości podziału jest mniejsze niż 0,1, wpisz nr. Jeśli jest powyżej 0,1, należy pozwolić na kontynuowanie analizy lub zmienić niektóre parametry (patrz instrukcja).
   7. Użyj polecenia "sumt", aby wygenerować pliki drzewa.
   8. Po zakończeniu analizy i wygenerowaniu drzewa konsensusu, drzewo można wyświetlić w FigTree (dostępnym online).
5. Porównaj drzewa, aby sprawdzić, czy metody generują spójne wyniki.
   UWAGA: Niektóre sekwencje nie dostarczają zbyt wielu informacji: drzewa mogą nie być dobrze rozwinięte, a gałęzie mogą mieć minimalne wsparcie (Rysunek 10).
6. Porównaj drzewa z grupami zidentyfikowanymi za pomocą odniesienia, aby sprawdzić, czy analizy filogenetyczne potwierdzają te grupy.

Results

Grupy sekwencji w nadrodzinie CS-αβ opisane w literaturze są pokazane w Rysunek 4. Pary cysteiny oparte na numeracji dla każdej sekwencji sugerują pięć podstawowych grup (Tabela 1, środkowa kolumna). Grupa 1 ma sześć cystein, które pochodzą z trzech wiązań dwusiarczkowych i obejmują sekwencje owadów, pajęczaków,, nicieni i grzybów. Grupy 2, 3 i 4 mają 8 cystein, które tworzą cztery wiązania dwusiarczkowe. Grupa 2 obejmuje sekwencje owadów, pa...

Discussion

Kryteria nazewnictwa białka w grupie powinny być jasne, ale nie zawsze tak jest. Sekwencje, które mają fałd CS-αβ, były badane w wielu laboratoriach przy użyciu różnych organizmów, co zaowocowało różnymi systemami nomenklatury, a także różnymi poziomami charakterystyki. Próba narzucenia zupełnie nowej nomenklatury nie jest rozsądna i spowodowałaby duże zamieszanie przy przeglądaniu dotychczasowej literatury. Oprócz nazwy białka można zastosować system numeracji referencyjnej w celu wyjaśnienia jego cech charakterystyczny...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		internetowa BLAST	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (pakiet Lasergene)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
bazy danych
SCOP	http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/