Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56110

⸱

6 lipca 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Streszczenie

Często zachowanie komórek i odpowiedzi komórkowe są analizowane na poziomie populacji, gdzie odpowiedzi wielu komórek są sumowane razem jako średni wynik, maskujący bogate zachowanie pojedynczej komórki w złożonej populacji. Technologie wykrywania i kwantyfikacji białek jednokomórkowych wywarły w ostatnich latach niezwykły wpływ. W tym artykule opisujemy praktyczną i elastyczną platformę do analizy pojedynczych komórek opartą na adresowalnych mikromacierzach kropelkowych. Badanie to opisuje, w jaki sposób można zmierzyć bezwzględną liczbę kopii docelowych białek z rozdzielczością pojedynczej komórki. Supresor guza p53 jest najczęściej zmutowanym genem w ludzkim raku, przy czym ponad 50% wszystkich przypadków raka wykazuje niezdrowy wzorzec ekspresji p53. Protokół opisuje kroki tworzenia kropelek o długości 10 nL, w których izoluje się pojedyncze ludzkie komórki rakowe, a liczba kopii białka p53 jest mierzona z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki w celu precyzyjnego określenia zmienności ekspresji. Metodę tę można zastosować do dowolnego typu komórki, w tym materiału pierwotnego, w celu określenia bezwzględnej liczby kopii wszelkich białek docelowych będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest określenie zmienności obfitości docelowego białka w populacji komórek z rozdzielczością pojedynczej komórki. Analiza pojedynczych komórek zapewnia szereg korzyści, które nie są dostępne w przypadku tradycyjnych metod biochemicznych opartych na zespołach. 1,2,3,4,5 Po pierwsze, praca na poziomie pojedynczej komórki może uchwycić bogatą heterogeniczność populacji komórek, która w przeciwnym razie zostałaby utracona przez uśrednianie, które ma miejsce przy użyciu tradycyjnych technik biochemicznych. Większość metod biochemicznych typu "koń roboczy" działa z masą, wymagając, jak to często bywa, milionów komórek do wytworzenia wyniku. Oczywiście, konsekwencje oceny całych populacji komórek zależą od wielu czynników, na przykład niejednorodności ekspresji białek, gdzie niektóre ważne cechy rozkładu obfitości białek mogą zostać pominięte. Z praktycznego punktu widzenia czułość wymagana od technik jednokomórkowych sprawia, że są one zdolne do pracy z ilością materiału biologicznego, która jest niewystarczająca do działania nawet bardziej czułych technik masowych. Kluczowym tego przykładem jest badanie rzadkich typów komórek, takich jak krążące komórki nowotworowe (CTC), gdzie nawet u pacjentów ze złymi rokowaniami może być mniej niż 10 CTC w jednym pobraniu krwi o objętości 7,5 ml. 6 Tutaj prezentujemy metodologię wymaganą do wykonania pomiarów białek jednokomórkowych za pomocą testu opartego na przeciwciałach o zmniejszonej objętości, wykorzystującego kropelki pokryte olejem wydrukowane na mikromatrycy przeciwciał.

Platformy kropelkowe mikroprzepływowe są o wysokiej przepustowości, są w stanie generować tysiące kropel na sekundę i są zdolne do izolowania, a nawet hodowli, pojedynczych komórek w pojedynczych kropelkach w celu przeprowadzenia szerokiej gamy testów biochemicznych. Techniki oparte na kropelkach dobrze nadają się do analizy pojedynczych komórek,7,8,9 z godnymi uwagi niedawnymi przykładami, takimi jak DropSeq10 i inDrop11, które zostały znacznie wspomagane przez moc technik amplifikacji. Ograniczona ilość materiału i brak metod amplifikacji białek sprawiają, że proteomika pojedynczych komórek jest szczególnie trudna.

Kropelki mogą być analizowane wieloma metodami, a mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana. Techniki jednocząsteczkowe, takie jak mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), umożliwiają wizualizację cząsteczek fluorescencyjnych z niezrównanym stosunkiem sygnału do szumu. 12 Ze względu na wykładniczy rozpad pola ulotnego, tylko fluorofory znajdujące się w dużej odległości od powierzchni (rzędu 100nm) są wzbudzane, co sprawia, że TIRF jest dobrą strategią w wykrywaniu małych ilości cząsteczki docelowej w złożonej mieszaninie. Naturalna wytrzymałość przekroju optycznego TIRF pomaga również uniknąć etapów mycia oraz ogranicza czas i złożoność testu. Jednak TIRF wymaga płaskich powierzchni, a przykłady mikroskopii TIRF zastosowanej do kropel w przepływie obejmują tworzenie płaskiej powierzchni, którą należy zobrazować. 13 W tym celu, techniki proteomiczne pojedynczych komórek często projektują mikroprzepływowe chipy wokół unieruchomionych powierzchniowo agentów wychwytujących w formacie mikromacierzy. 4,14

Kropelki same w sobie mogą być formowane w tablice na płaskich powierzchniach, tak zwane mikrotablice kropelkowe. 15,16,17 Przestrzenne organizowanie kropel w tablice pozwala na ich wygodne indeksowanie, łatwe monitorowanie w czasie, indywidualne adresowanie i, w razie potrzeby, pobieranie. Mikromacierze kropelkowe mogą osiągnąć wysoką gęstość mikroreaktorów z tysiącami elementów na chip, które są albo wolnostojące, albo wsparte na strukturach mikrostudzienkowych. 18,19,20 Mogą być tworzone przez sekwencyjne osadzanie przez roboty obsługujące ciecze, skanery atramentowe, mikromacierze kontaktowe21,22,23,24,25,26 Mogą też samoorganizować się na powierzchniach, takich jak superhydrofilowe plamy wzorowane na powierzchni superhydrofobowej. 27,28,29

Mając na uwadze te rozważania, zaprojektowano Adresowalne Mikromacierze Kropelkowe (ADM), aby połączyć wszechstronność, adresowalność przestrzenną i zmniejszone objętości mikromacierzy kropel z czułością mikroskopii TIRF pojedynczej cząsteczki do ilościowego pomiaru obfitości białek. 5 ADM-ów umożliwia analizę pojedynczych komórek, tworząc mikromatrycę kropelkową zawierającą pojedyncze komórki nad mikromatrycą przeciwciał, która jest następnie pokrywana olejem, aby zapobiec parowaniu. Objętości kropel są dyskretne, aby zapobiec utracie próbki, która w przeciwnym razie zostałaby osiągnięta przez zawory wbudowane w mikroprzepływy w przepływie ciągłym. 30 Bezwzględna ilość docelowego białka z pojedynczej komórki jest bardzo mała; Jednak zmniejszona objętość kropelek pozwala na stosunkowo wysokie stężenie miejscowe, aby można je było wykryć za pomocą testu przeciwciał typu sandwich - przeciwciało jest unieruchomione w odrębnym regionie lub miejscu na powierzchni, która wychwytuje białko, które z kolei wiąże się z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem detekcyjnym obecnym w objętości kropli. Jako podejście bezznacznikowe (tj. cele białkowe nie muszą być znakowane bezpośrednio), ADM są ogólnie stosowane do analizy komórek ze źródeł pierwotnych, takich jak przetworzona krew, aspiraty drobnoziarniste i zdysocjowane biopsje guza, a także komórki z hodowli i ich lizaty.

Pomiar zmienności obfitości białek w populacji komórek jest ważny w określaniu niejednorodności w odpowiedzi, na przykład, na lek i pomoże w dostarczeniu wglądu w funkcje i szlaki komórkowe, ocenie subpopulacji i ich zachowania, a także w identyfikacji rzadkich zdarzeń, które w przeciwnym razie zostałyby zamaskowane metodami masowymi. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wytwarzać i wykorzystywać adresowalne mikromacierze kropelkowe do ilościowego określania obfitości czynnika transkrypcyjnego p53 w ludzkich komórkach nowotworowych i może być wykorzystany do zbadania roli p53 w odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne. Białko docelowe jest określane przez wybór przeciwciał wychwytujących i wykrywających i może być modyfikowane tak, aby zawierało więcej lub różne cele. Podano instrukcję, jak zbudować proste urządzenie zawierające koncentryczną dyszę z ogólnych materiałów eksploatacyjnych laboratoryjnych do ręcznego układania kropelek o pojemności 10 nl zakrytych olejem. Opisano pełny proces eksperymentalny, w którym każda kropla jest następnie ładowana pojedynczą komórką, która jest następnie poddawana lizie, a ekspresja białka określana z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii TIRF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Twórz chipy i drukuj mikromacierze przeciwciał
    1. Przymocuj samoprzylepny izolator silikonowy/akrylowy do szkiełka nakrywkowego funkcjonalizowanego w celu wsparcia mikromacierzy przeciwciał. Nazywa się to chipem.
      UWAGA: Różne substancje chemiczne powierzchni zostały przetestowane pod kątem ich przydatności do adresowalnych kropel. 5 Chemia powierzchni może wymagać optymalizacji pod kątem alternatywnych środków wychwytywania. Izolatory ADM są dostępne na rynku lub mogą być produkowane metodą laserowego cięcia akrylu (plik CAD dla izolatora użytego w tej pracy jest dostępny do pobrania; patrz Plik z kodem uzupełniającym).
    2. Włącz mikromacierz i ustaw wilgotność na 75%.
      UWAGA: Wilgotność względna zmniejsza parowanie roztworu drukującego z pinu mikromacierzy i zmniejsza zmienność wewnątrz i między punktami.
    3. Wyczyść pin mikromacierzy w roztworze do czyszczenia szpilek przez 5 minut za pomocą ultradźwięków. Opłucz szpilkę ultraczystą wodą za pomocą butelki do mycia i wysusz azotem.
      UWAGA: Zawieś kołek tak, aby zanurzyć tylko końcówkę kołka. Szkiełko mikroskopowe z odpowiednio wywierconym zestawem otworów pomoże, jeśli nie można uzyskać uchwytu na szpilki.
    4. Przygotować 5 ml buforu do wydruku składającego się z 3 × buforu soli fizjologiczno-cytrynianowej (SSC), 1,5 M betainy uzupełnionej 0,01% dodecylosiarczanem sodu (SDS). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
    5. Aby przygotować roztwór do drukowania, rozmrozić podwielokrotności przeciwciała anty-p53 (zestaw do testu ELISA p53/Mdm2; patrz tabela materiałów) przechowywane w temperaturze -80 °C. Wymieszać w stosunku 1:1 z buforem do wydruku do końcowego stężenia 0,5 mg/ml. Załadować 5-10 μl roztworu drukarskiego do płytki 384-dołkowej za pomocą mikropipety i umieścić w mikromacierzce.
    6. Załaduj chipy zmontowane w kroku 1.1.1 do mikromacierzy. Zaprogramuj mikromacierz tak, aby drukowała plamki we współrzędnych określonych przez środek każdej studzienki izolatora.
      UWAGA: Mikromacierze wykorzystują szereg zastrzeżonego oprogramowania, dlatego czytelnik jest zachęcany do zapoznania się z odpowiednią literaturą. Mikromacierz wymagana dla izolatora ADM przedstawionego w dołączonym pliku CAD w kroku 1.1.1 składa się z elementów prostokątnych; Podano odpowiednie odległości.
    7. Przechowuj frytki w hermetycznych pojemnikach i zawiń w folię. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 tygodni.
      UWAGA: Folia ma za zadanie zapobiec wszelkim uszkodzeniom fotograficznym. Przechowywanie w temperaturze 4 °C ogranicza szybkość degradacji biomolekuł i wszelkie szkodliwe reakcje, które mogą działać w celu zmniejszenia aktywności mikromacierzy. Hermetyczny pojemnik umożliwia zrównoważenie wiórów do temperatury pokojowej przed użyciem bez tworzenia się kondensatu na powierzchni wióra. Druk kontaktowy z mikromatrycami wykorzystuje napięcie powierzchniowe i przyczepność między roztworem druku a podłożem druku w celu uzyskania plam. Zwykle wymagane jest wstępne drukowanie lub blotting w celu usunięcia nadmiaru roztworu z pinu mikromacierzy w celu uzyskania plamek o jednolitej wielkości. Nie należy wyrzucać szkiełka nakrywkowego przed wydrukiem, ponieważ można go użyć do oceny jakości partii.
  2. Przygotuj strzykawki, rurki i koncentryczną dyszę do dozowania adresowalnych kropelek
    1. Zdemontuj 100 μl (dla kropli wodnej) i 1 ml (dla oleju do zamykania) szklane strzykawki Hamilton i opłucz części destylowanymH2O.
    2. Przeprowadź rurkę z topionej krzemionki o długości 100 mm 150 μm ID/360 μm OD przez rurkę PFA o długości 40 mm o średnicy 1.0 mm ID/1/16" OD, aż wystaje na 2 mm. Spowoduje to utworzenie koncentrycznej dyszy.
    3. Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na koniec końcówki pipety o pojemności 10 μl i włóż do 40-milimetrowego odcinka rurki PFA o średnicy wewnętrznej 1,0 mm ID/1/16" OD. W razie potrzeby zmień położenie rurki z topionej krzemionki, aby utrzymać 2-milimetrowy występ na dyszy, zanim klej stwardnieje.
    4. Włóż drugi koniec kapilary ze stopionej krzemionki do końca rurki PTFE o długości 200 mm 0,014" ID/0,062" OD i podłącz ją do 100 μl strzykawki Hamiltona wypełnionej 4% białkami surowicy bydlęcej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (PBSA).
      UWAGA: Białka i inne związki biochemiczne mogą niespecyficznie wiązać się z powierzchniami i mogą być tracone lub denaturowane. BSA służy do "blokowania" powierzchni w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania poprzez ofiarne wiązanie z tymi powierzchniami.
    5. Włóż rurkę FEP o długości 400 mm i średnicy wewnętrznej 1,0 mm / średnicy zewnętrznej 2,0 mm do końcówki pipety o pojemności 200 μl, aż utworzy uszczelkę. Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na kolejną końcówkę pipety o pojemności 200 μl i wepchnij ją w pierwszą końcówkę, aby zamocować rurkę na miejscu. Podłącz otwarty koniec rurki FEP o średnicy wewnętrznej 1.0 mm/średnicy zewnętrznej 2.0 mm do strzykawki Hamilton o pojemności 1 ml wypełnionej olejem mineralnym.
    6. Włóż zespół końcówki do pipety o pojemności 200 μl do końcówki pipety o pojemności 10 μl dyszy koncentrycznej. Umieścić strzykawki w oddzielnych pompach strzykawkowych, ponieważ będą one musiały być obsługiwane niezależnie.
    7. Napełnij strzykawkę o pojemności 100 μl 4% roztworem blokującym PBSA. Ponownie podłącz i przepłucz "wodny" przewód roztworem blokującym. Powtórz dwa razy, w sumie 3 rzuty.
    8. Napełnij strzykawkę o pojemności 100 μl przeciwciałem wykrywającym 0,125 μg mL-1 (przeciwciało anty-p53 (DO-1) znakowane Alexa 488) w 4% PBSA i ponownie podłącz rurkę. Zastąp roztwór blokujący w drengu, dozując 25 μl roztworu przeciwciał wykrywających.
    9. Przepłucz rurkę "olejową" olejem mineralnym, aż wszystkie rurki i dysza napełnią się olejem. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml olejem mineralnym i ponownie podłącz rurkę. Przymocuj zespół rurki i dyszy do manipulatora XYZ.
  3. Przygotować mikrowtryskiwacz i mikromanipulator
    UWAGA: Poniższe kroki odnoszą się konkretnie do elementów aparatu do mikroiniekcji i mikromanipulatorów określonych w Tabeli materiałów, ale mają one ogólne zastosowanie do każdego takiego urządzenia.
    1. Zmontuj mikrowtryskiwacz, podłączając rurkę ciśnieniową i uchwyt kapilary.
    2. Powoli obracaj pokrętłem tłoka, aż olej mineralny całkowicie wypełni przewód.
    3. Zamontuj uchwyt kapilarny w uchwycie głowicy translacyjnej.
    4. Zamocuj kapilar w uchwycie kapilary za pomocą głowicy uchwytu.
    5. Odpipetować roztwór 4% PBSA do jednego z dołków izolatora.
    6. Przełożyć za pomocą mikromanipulatora i zanurzyć końcówkę kapilary w roztworze.
    7. Powoli wypełnij kapilę 4% PBSA i pozostaw do zablokowania na 10 minut.
    8. Wysuń mikrokapilę i obróć moduł translacyjny tak, aby zespół był wolny od chipa.

2. Formuj adresowalne kropelki i ładuj za pomocą pojedynczych komórek

  1. Formuj adresowalne kropelki
    1. Zabezpiecz chip na stoliku mikroskopu.
      UWAGA: Mikroskop jest automatycznym mikroskopem z odwróconą fluorescencją zdolną do pojedynczej cząsteczki TIRF, wyposażonym w kodowany stolik XY i kamerę urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym zwielokrotniającym elektrony (EM-CCD).
    2. Zapisz współrzędne stolika mikroskopu każdego punktu w matrycy za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania sterującego mikroskopem.
    3. Ustaw manipulator XYZ na stoliku mikroskopu. Umieść dyszę pod kątem 50-60°. Upewnij się, że dysza ma wystarczającą długość i prześwit, aby dotrzeć do wióra. Ustawić pompy strzykawkowe "wodne" i "olejowe" tak, aby dozowały odpowiednio 10 ml przy 100 μl/min i 5 μl przy 100 μl/min.
      UWAGA: Podczas przygotowywania roztwór wodny na głowicy dyszy może wyschnąć.
    4. Dozuj roztwór wodny, aż na głowicy dyszy będzie widoczna kropla płynu. Przetrzyj chusteczką bezpyłową, aby go usunąć.
      UWAGA: W zależności od liczby badanych warunków należy zarezerwować pewną liczbę studni, które będą służyć jako zbiorniki na komórki. Dla pojedynczej linii/typu komórkowego wystarczy pojedynczy zbiornik
      5. .
    5. Korzystając z automatycznego oprogramowania sterującego mikroskopem, ustaw współrzędne stolika mikroskopu na miejsce przeciwciała w matrycy i skup się na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    6. Uważając, aby nie naruszyć miejsca, za pomocą manipulatora XYZ wyrównaj szklaną końcówkę kapilary koncentrycznej dyszy z boku plamki przeciwciał i dozuj 10 ml roztworu wodnego. Nie przesuwając stopni, nalej 5 μl oleju, aby zakorkować roztwór wodny. Powoli podnieś dyszę z dala od kropli i przejdź do następnej studzienki.
    7. Powtórz krok 2.1.6 dla wszystkich plamek przeciwciał w macierzy.
    8. Po 30 minutach zobrazuj wszystkie plamki w matrycy za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania sterującego mikroskopem, aby określić tło pojedynczych cząsteczek związanych z każdym punktem przeciwciała przed załadowaniem komórek.
  2. Załaduj adresowalne kropelki komórkami
    1. Wyjąć kolby do hodowli komórkowych z inkubatora i odłączyć komórki za pomocą roztworu trypsyny/EDTA.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano ludzką linię komórkową raka jelita grubego BE i wyhodowano ją przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagles Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% (v / v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w inkubatorze CO2 .
    2. W razie potrzeby fluorescencyjnie wybarwić komórki.
      1. Zawiesić komórki w roztworze przeciwciała wykrywającego 0,125 μg/ml (przeciwciało anty-p53 (DO-1) znakowane Alexa 488) w 10% FBS w pożywce L-15. Aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki, przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o wielkości 40 μm.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz lub zagęścić roztwór komórek do stężenia 25-400 × 103 komórek/ml. Gwarantuje to, że komórki osadzają się w wystarczających odstępach, aby wygodnie manipulować mikrokapilarą.
    4. Załaduj pojedyncze komórki do adresowalnych kropelek ze zbiornika komórkowego za pomocą mikromanipulatora i mikrokapilary.
      UWAGA: Nieprzylegające komórki można ładować luzem do mikropipety i dozować pojedynczo do adresowalnych kropelek. Pomimo obróbki blokującej powierzchnię, przylegające linie komórkowe będą miały tendencję do niespecyficznego przyklejania się do wewnętrznej ściany szklanej mikrokapilary i zostaną utracone.
    5. Używając obiektywu 10× do obserwacji, użyj mikrowstrzykiwacza, aby zassać pojedynczą komórkę do mikrokapilary ze zbiornika komórkowego.
    6. Zapisz współrzędne stopnia mikromanipulatora, jeśli używasz stolika manipulatora elektronicznego, lub ręcznie zanotuj pozycję z.
    7. Cofnij mikropipetę, przesuwając ją w górę, aby usunąć chip o wysokości 1 mm. Zrób to ręcznie za pomocą joysticka lub automatycznie za pomocą funkcji "Wysuwaj" stolika manipulatora elektronicznego.
    8. Ustawić współrzędne stolika na adresowalną kroplę za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania sterującego mikroskopem. "Wstrzyknąć" mikropipetę, przywracając ją do zapisanej (lub zanotowanej) pozycji z. Zrób to ręcznie za pomocą joysticka lub automatycznie, jeśli używasz elektronicznego manipulatora stage.
      UWAGA: Mikrokapilara przebije olej zamykający i będzie zlokalizowana w wodnej części adresowalnej kropli.
    9. Dozować komórkę w adresowalnej kropli za pomocą mikroiniektora. Objętość adresowalnej kropli o stężeniu 10 nl zwiększy się o mniej niż 1%.
    10. Powtórzyć 2.2.5-2.2.9 dla pozostałych adresowalnych kropel, pozostawiając trochę wolnego dla kontroli eksperymentalnej, w której adresowalne kropelki nie zawierają komórki.
      UWAGA: Prostszą alternatywą dla ładowania pojedynczych komórek do adresowalnych kropelek za pomocą mikrokapilary i mikromanipulatora jest zastąpienie roztworu w kroku 1.2.8 roztworem przeciwciała detekcyjnego w 4% komórkach zawierających PBSA w stężeniu rzędu 105 komórek/ml, co odpowiada 1 komórce/10 nL. Zajętość pojedynczej komórki będzie poissonowska, a stężenie komórek będzie musiało zostać zoptymalizowane.
  3. Lizuj komórki i tablicę obrazów
    1. Obrazowanie komórek w kropelkach za pomocą mikroskopii jasnego pola, w tym dowolnego obrazowania fluorescencyjnego.
      UWAGA: Obrazowanie zajmuje około 3 minut, aby zobrazować ~100 kropel za pomocą automatycznego mikroskopu. Wykonaj obrazowanie za pomocą obiektywu zanurzeniowego 60 NA = 1,49. Do obrazowania w jasnym polu nie są wymagane żadne filtry, podczas gdy standardowe zestawy filtrów są używane do obrazowania fluorescencyjnego.
    2. Zobrazuj wszystkie plamki w matrycy za pomocą mikroskopii pojedynczej cząsteczki TIRF.
      UWAGA: Ustawienia są używane jak w kroku 2.3.1 ze specjalistycznym zestawem filtrów TIRF. Obrazy te zostaną następnie przeanalizowane w sekcji 3 w celu określenia tła pojedynczych cząsteczek związanych z każdym miejscem przeciwciała przed lizą. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) zajmuje około 5 minut, aby zobrazować ~100 plamek.
    3. Skoncentruj się na komórce w adresowalnej kropli. Osiągnij pełną lizę optyczną, skupiając pojedynczy impuls laserowy 6 ns (długość fali 1064 nm, energie impulsu 14,1 ± 0,3 μJ na impuls) w pobliżu lokalizacji ogniwa.
      UWAGA: Impuls laserowy tworzy rozszerzający się pęcherzyk kawitacyjny, który ścina komórkę i uwalnia składniki komórkowe do objętości kropli. 4,31 Procesy mechaniczne spowodowane lizą indukowaną laserem nie zakłócają interfejsu olej-woda przy niskich energiach impulsów. Liza optyczna trwa zwykle około 20-30 minut, aby liza 100 komórek. Jak omówiono w sekcji Dyskusja, istnieje wiele alternatywnych metod lizy pojedynczych komórek, jeśli konfiguracja lizy optycznej nie jest możliwa.
    4. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich adresowalnych kropel zawierających komórki, pozostawiając 5 wolnych dla kontroli eksperymentalnej, w której adresowalne kropelki zawierają niezlizowaną komórkę.
    5. Zwróć uwagę na czas, w którym każda komórka jest poddawana lizie.
      UWAGA: Czasy te zostaną wykorzystane do skorygowania indywidualnych krzywych wiązania dla każdego miejsca w kroku 3.1.9. Często wystarczy zanotować czasy, w których pierwsza i ostatnia komórka są poddawane lizie, i oszacować resztę, zakładając odpowiednio spójny czas między zdarzeniami lizy.
    6. Uzyskuj obrazy pojedynczych cząsteczek za pomocą mikroskopii TIRF wszystkich plamek co 10 minut przez pierwsze 30 minut, a następnie co 20 minut przez kolejne 60 minut. Jeśli interesuje Cię tylko ilość białka związanego w równowadze, zobrazuj wszystkie miejsca po inkubacji chipa przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Czas do osiągnięcia równowagi będzie zależał od objętości kropli i powinowactwa przeciwciał użytych w teście. Mikroskopia TIRF jest wykonywana przy użyciu laserowego źródła wzbudzenia o długości fali = 488 nm i mocy 1,5 mW, mierzonej na tylnej aperturze za pomocą miernika mocy optycznej. Obrazy pojedynczych cząsteczek są pozyskiwane poprzez ustawienie ustawień akwizycji w kamerze EM-CCD na czas akwizycji 900 ms, 16-bitową digitalizację z szybkością odczytu 1 MHz i współczynnik wzmocnienia EM 10. Izolator może być ponownie użyty po ostrożnym usunięciu szkiełka nakrywkowego.

3. Analiza danych

  1. Zliczanie pojedynczych cząsteczek (reżim nieprzeciążony/cyfrowy)
    1. Korzystając z Fiji (lub Matlab), dla każdej niezatłoczonej plamki przeciwciał, załaduj obraz uzyskany przed lizą (tło, BKD).
      UWAGA: Operacje w poniższych krokach są proste do wykonania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu Fidżi. Instrukcję obsługi można znaleźć pod następującym linkiem https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
    2. Na Fidżi wybierz obraz BKD. W menu "Obraz" wybierz "Duplikuj", aby zduplikować BKD. Wybierz zduplikowany obraz i w sekcji "Przetwarzaj filtry >" wybierz "Rozmycie gaussowskie" i określ promień 50 pikseli.
    3. Spłaszcz obraz BKD tak, aby zapewnić efektywny równomierny rozkład intensywności źródła światła wzbudzenia, dzieląc obraz BKD przez rozmyty obraz BKD, tworząc BKD_FLAT.
      1. W sekcji "Proces" wybierz "Kalkulator obrazów...", określając operację "Podziel", wymagane obrazy i zaznaczając pola "Utwórz nowe okno" i "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".
    4. Odejmij każdy piksel na obrazie przez 1 ("Przetwarzaj > matematykę", wybierz "Odejmij..." i określ wartość 1). Średnia intensywność pikseli powinna wynosić 0,
      UWAGA: Spłaszczanie pól i spłaszczone obrazy tła można łatwo sprawdzić, ponieważ suma wszystkich pikseli powinna wynosić 0, a wszelkie pozostałe przesunięcia można łatwiej skompensować.
    5. Zaznacz obszar o wymiarach od 50 do 50 pikseli × 50 pikseli w dowolnym z 4 rogów obrazu BKD_FLAT. Zmierz odchylenie standardowe intensywności piksela (σ), wybierając "Analizuj" i "Zmierz".
      UWAGA: Statystyki podsumowujące selekcję zostaną przedstawione w oknie Wyniki. Określa to tło poza miejscem, w którym jest mało prawdopodobne, aby było duże zagęszczenie pojedynczych cząsteczek. Obszar, który ma być mierzony, można wybrać ręcznie za pomocą domyślnych narzędzi wyboru menu lub uruchamiając kod makra "makeRectangle(x, y, width, height)"; Spowoduje to utworzenie zaznaczenia prostokątnego, w którym argumenty x i y są współrzędnymi (w pikselach) lewego górnego rogu.
    6. Ustaw próg obrazu na 3σ i utwórz obraz binarny SM_MASK.
      1. W sekcji "Image > Adjust" wybierz "Próg..." i ustaw dolny poziom progu na 3σ.
        UWAGA: Piksele, których wartość jest niższa od progu, są ustawiane na zero, a piksele przekraczające próg są ustawiane na 1. Próg określi pewność, z jaką piksele progowe należą do pojedynczej cząsteczki.
    7. W SM_MASK obrazu podzielonego na segmenty ustaw wartości intensywności pikseli na zero dla wszystkich obiektów, które nie mają rozmiaru 4-9 pikseli2 i okrągłości 0,5 - 1, wybierając "Analizuj", a następnie "Analizuj cząstki" i określając rozmiar i okrągłość.
      UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie rozmiaru piksela pod kątem innych fluoroforów i konfiguracji mikroskopu. Ze względu na rodzaj szumu aparatu, pojedyncze piksele mogą znajdować się powyżej tego progu i nie mogą zostać odrzucone, mimo że nie są pojedynczymi cząsteczkami. Kryterium rozmiaru piksela poprawnie odrzuci takie piksele. Pojedyncze cząsteczki mają na ogół okrągły kształt. Wartość kołowości równa 1 wskazuje na idealne koło, podczas gdy wartość zbliżająca się do 0 wskazuje na coraz bardziej wydłużony kształt. Pozostałe obiekty są pojedynczymi cząsteczkami i mogą być policzone. Maska może być ustawiona w celu wyznaczenia obszaru plamki w celu rozróżnienia liczby punktów na miejscu i poza nim na klatce. Jest to łatwiejsze w przypadku klatek pozyskanych w późniejszym czasie, gdy na miejscu jest wystarczający sygnał, który można następnie zastosować do wcześniejszych klatek.
    8. Dla tej samej nieprzekrwionej plamki przeciwciała, załaduj i powtórz kroki 3.1.1 - 3.1.7 dla wszystkich klatek obrazu uchwyconych jako seria rozdzielcza w czasie uzyskana po lizie. Stosować czasy lizy podane w kroku 2.3.5. , aby skorygować wszelkie krzywe wiązania.
  2. Zliczanie pojedynczych cząsteczek (reżim przekrwiony/analogowy)
    1. Aby obliczyć średnią intensywność pojedynczej cząsteczki, przed kontynuowaniem powtórz kroki 3.1.1 - 3.1.8.
    2. Pomnóż obrazy BKD_FLAT i SM_MASK, aby uzyskać obraz, w którym niezerowe wartości pikseli są powiązane z pojedynczymi cząsteczkami.
      1. Aby to zrobić, w menu "Proces" wybierz "Kalkulator obrazów...", określ operację "Mnożenie" i wymagane obrazy, a następnie zaznacz pola "Utwórz nowe okno" i "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".
    3. Zsumuj wszystkie wartości intensywności pikseli, wybierając "Analizuj", a następnie "Zmierz"; statystyki podsumowujące wybór zostaną przedstawione w oknie Wyniki. Podzielić przez liczbę zliczonych pojedynczych cząsteczek zgodnie z krokiem 3.1.8, aby obliczyć średnią intensywność na pojedynczą cząsteczkę.
    4. W przypadku dowolnego przekrwionego miejsca przeciwciała załaduj obraz uzyskany po lizie i spłaszcz go rozmytym obrazem tła, jak opisano w krokach 3.1.2 i 3.1.3.
    5. Odejmij każdy piksel na spłaszczonym obrazie o 1 ("Przetwarzaj > matematykę", wybierz "Odejmij..." i określ wartość 1)
    6. Wybierz obszar o wymiarach 50 pikseli × 50 pikseli w dowolnym z 4 rogów obrazu i zmierz odchylenie standardowe intensywności pikseli (σ). Szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 3.1.5.
    7. Utwórz binarną maskę obrazu, ustawiając próg obrazu na 3σ i ustaw wartości intensywności pikseli na zero dla wszystkich obiektów o rozmiarze mniejszym niż 4 piksele2. Aby to zrobić, w menu "Analizuj" wybierz "Analizuj cząstki" i określ rozmiar oraz okrągłość.
    8. Pomnóż spłaszczony obraz przekrwionego miejsca przeciwciała przez binarną maskę obrazu.
      1. Aby to zrobić, w menu "Proces" wybierz "Kalkulator obrazów...", określ operację "Mnożenie" i wymagane obrazy, a następnie zaznacz pola "Utwórz nowe okno" i "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".
    9. Suma pozostałych intensywności pikseli, wybierając "Analizuj", a następnie "Zmierz"; statystyki podsumowujące wybór zostaną przedstawione w oknie Wyniki.
    10. Podziel sumę intensywności pikseli przez średnią intensywność pojedynczej cząsteczki, aby obliczyć liczbę pojedynczych cząsteczek związanych z zatłoczonym miejscem.
  3. Krzywa kalibracyjna do bezwzględnego oznaczania ilościowego
    1. Powtórz sekcje 1 i 2, aby utworzyć adresowalne kropelki o długości 10 ml z przeciwciałem wykrywającym w 4% roztworze PBSA wzbogaconym rekombinowanym białkiem o znanym stężeniu.
    2. Wykonać serię stężeń 102-10 7 rekombinowanych białek na kroplę, zmieniając znane stężenie rekombinowanego białka dodanego do roztworu. Zaleca się pracę pod kątem liczby białek w kropli, aby ułatwić kalibrację danych z pojedynczej komórki.
    3. Korzystając z danych serii stężeń w kroku 3.3.2, skalibruj dowolną liczbę pojedynczych cząsteczek na plamkę do obfitości białka na kroplę, a co za tym idzie, obfitości białka na pojedynczą komórkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bezwzględną liczbę kopii białka podstawowego p53 określono z rozdzielczością pojedynczej komórki w linii komórkowej raka jelita grubego u człowieka, komórkach BE. Pokazano, jak ekspresja p53 może się różnić o kilka rzędów wielkości oraz wykazano słabo pozytywną korelację między rozmiarem komórki a liczbą kopii białka w spoczywającej populacji komórek BE.

Adresowalne mikromacierze kroplowe powstają, gdy krople wodne są dozowane w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Adresowalne mikromacierze kropelkowe to czuła i rozszerzalna metoda ilościowego określania bezwzględnej liczby kopii białka w pojedynczej komórce.

Ograniczenie poziomu wiązania nieswoistego (NSB) ma kluczowe znaczenie w protokole dla osiągnięcia jak najniższego limitu wykrywalności. Białka i inne związki biochemiczne mogą niespecyficznie wiązać się z wieloma interfejsami obecnymi w kropelkach - powierzchnią szkiełka nakrywkowego, plamką przeciwciała i granicą faz olej/woda. Białka mogą zostać ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

ASR zaprojektował eksperymenty, opracował protokoły i przeanalizował dane. SC i PS przeprowadziły eksperymenty dotyczące wielkości komórek. ASR i OC napisali rękopis. Autorzy pragną wyrazić wdzięczność za wsparcie prof. Davida R. Kluga w udostępnieniu sprzętu. Autorzy pragną podziękować Imperial College Advanced Hackspace za dostęp do zakładów produkcyjnych i prototypowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla komórkowa
sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Life Technologies10010015
DMEM o wysokiej sile glukozySigmaD6429
Surowica bydlęca płodu (FBS)KolbyS0115
CorningSIAL0639
Trypsyna/EDTABiochromL2153
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, Wielka BrytaniaOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Szkiełka nakrywkowe (Nexterion)Schott, Europa1098523Rozmiar (mm): 65.0 x 25.0; Grubość (mm) 0,17
przeciwciało wychwytujące p53Przeciwciało wykrywające EnzoADI-960-070
p53, Alexa Fluor 488 oznaczoneSanta Cruzsc-126stężenie zapasowe 200μ g/ml
Bufor solno-cytrynianu soduGibco15557-044
BetainaSigma61962
Dodecylosiarczan soduSigmaL3771
384 dołek (mała objętość)SigmaCLS4511
Butla gazowa z azotemBOCKlasa przemysłowa, beztlenowa
NazwaFirma<strong>Numer katalogowyKomentarze
Kropelki
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Ręczny mikrowtryskiwaczEppendorfCellTram Vario
Origio, DaniaMBB-FP-L-0
Pompy strzykawkoweKD ScientificKDS-210
100 μ Strzykawka LHamilton81020Gazoszczelna, PTFE Luer lock
Strzykawka 1 mlHamilton81327Gazoszczelna, PTFE Luer lock
Izolator silikonowyGrace Bio-LabsJTR24R-A-0,56x4 well izolator silikonowy z klejem
Wycinarka laserowaVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wdo laserowego cięcia niestandardowych izolatorów
Arkuszakrylowy o grubości 1mmWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001do cięcia laserowego niestandardowych izolatorów
Arkusz samoprzylepny3Msłuży do przyklejania niestandardowych izolatorów do mikromacierzowanych szkiełek nakrywkowych
Super klejLoctiteLOCPFG3T
150 μ m ID/360 μ m Rurka z topionej krzemionki o średnicy zewnętrznejIDEXFS-115
1,0 mm ID/1/16" Rurki OD PFAIDEX1503
0,014" Identyfikator/0,062" Rurka PTFE ODKinesis008T16-100
1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP rurkaIDEX1673
Białko surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Olej mineralnySigmaM5904
Ultraczysta wodaMillipore, NiemcyMilliQ
Nazwa FirmaNumer katalogowyKomentarze
>Mikroskopia i Optyka
mikroskop TIRF z kodowanym stolikiem XYNikon, JaponiaNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IrlandiaIXON DU-897E
Źródło wzbudzenia laserowegoVortran, USAStradus 488-50
Optyczne źródło lasera do lizyContinuum, USAMikroskop Surelite SLI-10
kostka filtra do TIRFChroma, USAz488bp
Kostka filtra mikroskopowego do optycznego lasera lizycznego2000, Wielka BrytaniaLPD01-532R-25
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
FidżiOpen SourceOprogramowanie do analizy obrazów
MatlabMathworksw wersji 7.14 lub nowszejOprogramowanie do analizy obrazu
do hodowli komórkowych Biochrom

Bibliografia

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28(2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046(2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551(2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie bia ek w pojedynczych kom rkachbezwzgl dna liczba kopii bia karozdzielczo pojedynczej kom rkioznaczanie ilo ci bia ka p53mikroskopia TIRF pojedynczych cz steczekprotok tworzenia kropelekprocedura lizy kom rekfluorescencyjne przeciwcia o detekcyjneanaliza kom rek nowotworowych
Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.