Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Metody określania subkomórkowej lokalizacji białek i ich związku z różnymi przedziałami komórki są niezbędnymi narzędziami do zrozumienia ich funkcji i możliwych interakcji. Mikroskopia superrozdzielcza w połączeniu z mikroskopią elektronową dostarcza takich informacji¹. Mikroskopia zubożenia stanu podstawowego, po której następuje powrót pojedynczej cząsteczki (GSDIM) to technologia mikroskopii superrozdzielczej, kompatybilna z szeroką gamą organicznych i genetycznie kodowanych fluoroforów² i osiąga rozdzielczość boczną do 20 nm³. Zastosowanie metod o wyższej rozdzielczości niż standardowa mikroskopia z ograniczoną dyfrakcją poprawia dokładność korelacji^4,5,6. W celu osiągnięcia najlepszej korelacji ekspresji białka ze specyficznym przedziałem subkomórkowym i zmniejszenia objętości niepewności⁷ zaleca się użycie tego samego ultracienkiego przekroju do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Wśród różnych metod sekcji, protokół kriosekcji Tokuyasu nie wymaga odwodnienia ani zatapiania żywicy, a ponadto zachowuje antygenowość wielu epitopów i zapewnia dobrą ultrastrukturę tkanek⁸. Kilka metod wykazało możliwość zastosowania tych sekcji w korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)^4,5,9,10.

Siatkówka danio pręgowanego jest cennym modelem do badania rozwoju wzrokowego i mechanizmów chorobowych u ludzi, biorąc pod uwagę jej wysoce zachowaną strukturę i funkcję u kręgowców. W szczególności fotoreceptory siatkówki wykazują taką samą architekturę jak fotoreceptory ssaków, z synapsą podstawną, wydłużonym jądrem wierzchołkowo-podstawnym, skupiskiem mitochondriów w bardziej wierzchołkowym segmencie wewnętrznym i zewnętrznym segmentem złożonym z krążków błony w najbardziej wierzchołkowej pozycji¹¹. Lokalizacja białek w różnych przedziałach komórkowych jest zachowana między danio pręgowanym a człowiekiem, co pozwala na badanie biologicznej funkcji białek istotnych dla chorób u ludzi^12,13.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek siatkówki larw danio pręgowanego do rozwiązania lokalizacji mitochondrialnego białka błony zewnętrznej Tom20 za pomocą korelacyjnego światła superrozdzielczego i mikroskopii elektronowej. Metoda opiera się na pobraniu kriosekcji na płytkach krzemowych i uzyskaniu kontrastu na podstawie informacji topograficznych powstałych po nałożeniu cienkiej warstwy platyny. Te kroki są wyraźnymi ulepszeniami technicznymi pod względem łatwości użycia, odtwarzalności i czasu do ukończenia eksperymentów. Niedawno wykazaliśmy możliwość zastosowania tej metody do wykrywania porów jądrowych i białek mitochondrialnych w tkance myszy¹⁴.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez lokalne władze.

1. Przygotowanie ultracienkich przekrojów na płytkach krzemowych

1. Utrwalanie próbki
   1. Przygotować roztwór utrwalający zawierający 0,1% aldehydu glutarowego, 4% formaldehydu w 0,1 M buforze kakodylowym.
      UWAGA: UWAGA! Należy zachować ostrożność podczas pracy z aldehydem glutarowym, formaldehydem i buforem kakodylowym, nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
   2. Poddaj eutanazji 5 dni po zapłodnieniu (5 dpf) larw danio pręgowanego trikainą (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu, 0,4% w/v w PBS (sól fizjologiczna buforu fosforanowego, pH 7)) zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁵.
   3. Utrwalić larwy przez zanurzenie we wstępnie schłodzonym roztworze utrwalającym na lodzie. Zdjąć głowę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
   4. Wypreparuj oczy, przycinając tkankę wokół oka za pomocą cienkich kleszczy i skalpela do mikrodysekcji (pod lornetką) w schłodzonym roztworze utrwalającym na 1% płytce pokrytej agarozą. Przenieś oczy do tubki ze świeżym, wstępnie schłodzonym utrwalaczem.
   5. Płukać dwukrotnie w PBS (bufor fosforanowy, sól fizjologiczna, pH 7,4) przez 5 minut każde płukanie w temperaturze pokojowej (RT).
2. Infiltracja i montaż żelatyny
   1. Rozgrzej 15 ml lokalnej marki spożywczej żelatyny 12% w/v w PB (bufor fosforanowy, 0,1 M pH 7,4) w temperaturze 40 °C. Usuń PBS i dodaj roztwór żelatyny do probówek zawierających oczy. Delikatnie postukać w probówkę, aby upewnić się, że żelatyna infiltruje próbkę i inkubować przez 10-30 minut w temperaturze 40 °C w termobloku z delikatnym wstrząsem lub w łaźni wodnej.
   2. Płaskie formy do zatapiania o wymiarach 12 mm x 5 mm x 3 mm z silikonu lub polietylenu napełnić ciepłą żelatyną w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. Dodać dwa oczka do formy za pomocą pipety, wyrównać je odpowiednio pod lornetką za pomocą igły do wypreparowania i pozostawić żelatynę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i stwardnieć w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   3. Ponownie przytnij blok żelatyny pod lornetką, aby dopasować jedno oko na blok za pomocą żyletki.
   4. Przenieść oczka zatopione w żelatynie do 2,3 M sacharozy w PB na lodzie. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   5. Wymienić na nowy 2,3 M roztwór sacharozy i przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C; po tym etapie próbki są gotowe do podziału lub mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni lub miesięcy.
   6. Ponownie przytnij blok żelatyny do wielkości prawie oka przed przeniesieniem do krioszpilki. Zamrozić w ciekłym azocie i przenieść do krio-ultramikrotomu.
3. Kriosekcja
   1. Ciąć odcinki o grubości 110 nm w temperaturze -120 °C za pomocą noża diamentowego w krio-ultramikrotomie.
   2. Wybierz sekcje z przewodową pętlą zawierającą kroplę 2% metylocelulozy (w wodzie) i 2,3 M roztworu sacharozy (1:1). Przenieś sekcje na płytkę krzemową o wymiarach 7 mm x 7 mm. Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.

2. Znakowanie immunologiczne

1. Myć wafle PBS w temperaturze 0 °C przez 20 minut na czterech kroplach, kładąc wafle do góry nogami na kroplach. Prać w PBS 2x 2 min w temperaturze pokojowej.
2. Inkubować 3 razy w 0,15% glicynie w PBS, po 1 minutę każdy. Prać 3x po 1 min/pranie z PBS. Wstępną inkubację z PBG (PBS z 0,5% albuminą BSA w surowicy bydlęcej i 0,2% żelatyny typu B) przez 5 minut.
3. Inkubować z króliczym anty-Tom20 (patrz tabela materiałów) w PBG (4 μg/ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Prać 6x po 1 min/pranie w PBG. Wstępną inkubację z PBG przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubację z anty-króliczą Alexa 647 F(ab')₂ (patrz Tabela Materiałów) w PBG (7,5 μg/ml) przez 30 minut.
5. Prać 6x po 1 min/pranie w PBG. Prać 3x 2 min w PBS. Inkubować z DAPI (4 μg/ml) w PBS przez 10 s. Prać 2x 2 min w PBS.

3. Mikroskopia superrozdzielcza

1. Krótko inkubować płytkę (10 s), umieszczając ją na kropli roztworu glicerolu w stosunku 1:1 (80%) i buforze obrazowania zawierającym system oczyszczania tlenu (200 mM bufor fosforanowy zawierający 10% glukozy, 0,5 mg/ml oksydazy glukozowej, 40 μg/ml katalazy, 15 mM chlorowodorek beta-merkaptoetyloaminy (MEA HCL), pH 8,0).
2. Przenieść płytki (sekcja skierowana w dół) na szklane dno (grubość 170 ± 5 μm) na szalkę Petriego na świeżą kroplę mieszaniny glicerolu (80%) i buforu do obrazowania w stosunku 1:1 (jak w kroku 3.1).
3. Usuń ze wszystkich stron pipetą większość płynu znajdującego się pod wafelkiem. Użyj silikonowych pasków, aby przymocować wafel do dna szalki Petriego.
   UWAGA: Paski silikonowe wykonane są z dwuskładnikowego kleju silikonowego (3 mm x 12 mm).
4. Wycinki obrazu na mikroskopie odwróconym przy użyciu wysokiej apertury numerycznej (np. 160X / NA 1,43; patrz tabela materiałów), immersji olejkiem, super rozdzielczości, dedykowanego obiektywu. Przed obrazowaniem należy pozwolić, aby próbka zrównoważyła się z temperaturą mikroskopu, aby zminimalizować/zmniejszyć dryf poprzeczny i osiowy.
5. Wyśrodkuj obszar zainteresowania i uzyskaj pierwsze szerokokątne obrazy referencyjne epifluorescencji. Zmień na tryb pracy w super rozdzielczości. Dostosuj czas naświetlania aparatu na 15 ms i ustaw wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów (EM) na maksimum 300.
6. Oświetlić próbkę laserem o fali ciągłej 642 nm przy maksymalnej mocy lasera (odpowiadającej ~2,8 kW/^cm2) w trybie epifluorescencji. Gdy tylko pojedyncze cząsteczki mrugnięcia zostaną dobrze oddzielone w każdej klatce, tak aby prawdopodobieństwo nałożenia się poszczególnych sygnałów było niskie, ustaw moc lasera na ~0,7 kW/cm². Zapisz surowy obraz w trybie epifluorescencji, rejestrując co najmniej 30 000 klatek.
   UWAGA: Wszystkie te parametry mogą się różnić w zależności od różnych próbek i gęstości etykietowania.
7. Na podstawie surowych danych wygeneruj listę zdarzeń rekonstrukcji (lokalizacje każdej pojedynczej cząsteczki na surowym obrazie) przy użyciu progu detekcji wynoszącego 30 fotonów (należy go dostosować zgodnie z próbką), klikając "Oceń" w "analizie serii t" w sekcji "Narzędzia".
8. Wizualizuj obraz w super rozdzielczości za pomocą Gaussian fitting¹⁶, stosując rozmiar piksela renderowania 4 nm, klikając "Utwórz obraz" w "panelu przetwarzania listy zdarzeń" w sekcji "Narzędzia".
   UWAGA: Do wygenerowania obrazu o wysokiej rozdzielczości wykorzystano zintegrowane narzędzia programowe systemu wykorzystane w tym badaniu. Jednak opisane obrazowanie w super rozdzielczości można przeprowadzić w dowolnym innym systemie opartym na lokalizacji pojedynczej cząsteczki, a dane mogą być przetwarzane za pomocą narzędzi oprogramowania open source, takich jak thunderSTORM¹⁷.

4. Platynowe cienie

1. Usuń silikonowe paski i dodaj kroplę PBS blisko krawędzi wafla, aby podnieść go z szalki Petriego. Umyj wafel 2x 2 minuty w PBS, a następnie utrwal go 0,1% aldehydem glutarowym w PBS przez 5 minut. Prać 2x po 2 min/pranie w PBS.
2. Inkubować płytkę dwukrotnie przez 5 minut/inkubację w 1 kropli metylocelulozy 2 % w wodzie na lodzie. Włóż wafel do probówki wirówkowej i wiruj przy 14 100 x g przez 90 s. Zamontuj go na króćcu aluminiowym SEM z przewodzącym cementem węglowym.
3. Dodać warstwę od 2 do 10 nm platyny/węgla na próbkę przez obrotowe cieniowanie pod kątem 8° przy użyciu urządzenia do odparowywania wiązką elektronów ustawienia: 1,55 kV, 55 mA, przy 0,3 nm/s i kącie 8°, poziom obrotu 4.

5. Skaningowa mikroskopia elektronowa

1. Wycinki obrazu za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego pod napięciem 1,5 kV, odległości roboczej 2 mm oraz z detektorem elektronów wtórnych w soczewce.

6. Wyrównanie obrazów z mikroskopii świetlnej i elektronowej

1. Otwórz oba typy obrazów za pomocą Fiji¹⁸, klikając "Plik|Otwórz". Dostosuj rozmiar płótna, klikając "Obraz| Dostosuj| Rozmiar płótna" i umieść oba obrazy w stosie, klikając "Obraz| Stosy| Obrazy do stosu". Zapisz stos jako typ pliku tiff.
2. Na Fidżi otwórz nowy interfejs TrackEM2¹⁹, klikając "File|new|TrackEM2 (nowy)". Zaimportuj stos z obydwoma obrazami, klikając prawym przyciskiem myszy czarne okno i wybierając "Importuj stos".
3. Ręcznie dopasuj obraz mikroskopii świetlnej do obrazu mikroskopii elektronowej z punktami orientacyjnymi, klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając "Wyrównaj|Ręczne wyrównanie warstwy ze znakami orientacyjnymi".
   1. Wybierz narzędzie do zaznaczania (strzałka), aby dodać punkty orientacyjne. Użyj kształtu jąder jako odniesienia, aby zaznaczyć te same krawędzie na obu obrazach (rysunek uzupełniający 1). Dodaj kilka punktów (należy wybrać minimum trzy punkty). Zastosuj wyrównanie do modelu afinicznego, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając "Zastosuj transformację| Model afiniczny".
4. Zmień przezroczystość warstwy (patrz rysunek uzupełniający 1), aby ocenić jakość wyrównania.

Ekspresja białka Tom20, podjednostki translokazowego kompleksu mitochondrialnej błony zewnętrznej20, została określona, w cienkich przekrojach siatkówki larw danio pręgowanego, za pomocą superrozdzielczej mikroskopii świetlnej (Rysunek 1) i informacja ta została uzupełniona sygnałem topograficznym uzyskanym przez skaningową mikroskopię elektronową po platynowym zacienieniu tych samych sekcji. Te dane korelacyjne potwierdzają lokalizację białka w związku z określonym przedziałem, zewnętrzną błoną mitochondrialną, a ponadto dostarczają informacji o związku białka z innymi organellami komórki.

Rycina 1: CLEM na siatkówce danio pręgowanego. ZA. Małoogniskowy obraz szerokokątny przekroju siatkówki danio pręgowanego o wartości 5 dpf, jądra barwione DAPI (cyjan). Ur. Skaningowa mikroskopia elektronowa tego samego obszaru. C. Szerokokątny obraz klatki w B. Jądra barwione DAPI (cyjan) i barwienie mitochondrialne Tom20 w większym powiększeniu są wyświetlane na czerwono. D. Szerokokątny obraz tego samego przekroju przy większym powiększeniu. Wzorzec ekspresji Tom20 znajduje się w klastrach mitochondriów. E. Ekspresja Tom20 (czerwone kropki) wykryta przez mikroskopię GSDIM. Jądra barwione DAPI (cyjan). Fot. Ten sam przekrój co E łączący korelacyjną superrozdzielczość i skaningową mikroskopię elektronową. Barwienie Tom20 (czerwone kropki) pojawia się w klastrze mitochondrialnym (M) na zewnętrznych błonach mitochondriów. Fluorescencyjny sygnał DAPI w jądrach (N) odpowiada topografii obrazu SEM. G. Obraz ramki w dużym powiększeniu w F. Obraz ze skaningowej mikroskopii elektronowej nadaje kontekst obrazowi GSDIM (czerwone kropki). Grzebienie mitochondrialne jest wyraźnie widoczne, a barwienie Tom20 jest zlokalizowane na zewnętrznych błonach mitochondriów. Błony zewnętrznego segmentu, fotoreceptory (OS) są wyraźnie rozdzielone. Rozmiar piksela obrazu: 5 nm. Podziałki liniowe: A, B i C: 10 μm; D: 2 μm; E i F: 1 μm i G: 0,2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wyrównanie obrazów z mikroskopii świetlnej i elektronowej. A. Zrzut ekranu z interfejsu TrackEM2 z obrazem SEM i ponumerowanymi punktami orientacyjnymi (żółtymi) wzdłuż różnych jąder. B. Zrzut ekranu z interfejsu TrackEM2 z obrazem fluorescencyjnym i ponumerowanymi punktami orientacyjnymi (żółtymi) wzdłuż różnych jąder barwionych DAPI. Aby zmienić przezroczystość warstwy, można użyć suwaków w lewej górnej części menu. Podziałka: 1 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.