Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i długotrwałe utrzymywanie hydry wolnej od nerwów

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56115

⸱

7 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, UC San Diego, 2Physics Department, UC San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Poprzez podwójne leczenie kolchicyną, toksyną pochodzenia roślinnego, która zabija dzielące się komórki, można wytworzyć wolną od nerwów Hydrę pospolitą. Te Hydry nie mogą się same odżywiać ani egzystować. W artykule opisano ulepszoną metodę długoterminowego utrzymania wolnej od nerwów Hydra vulgaris w laboratorium.

Streszczenie

Linia komórek śródmiąższowych Hydry obejmuje multipotencjalne komórki macierzyste i ich pochodne: komórki gruczołowe, nematocyty, komórki rozrodcze i komórki nerwowe. Komórki śródmiąższowe można wyeliminować poprzez dwie kolejne terapie kolchicyną, toksyną pochodzenia roślinnego, która zabija dzielące się komórki, eliminując w ten sposób potencjał odnowy zróżnicowanych komórek pochodzących ze śródmiąższowych komórek macierzystych. Pozwala to na wytwarzanie Hydry, która nie ma komórek nerwowych. Polip pozbawiony nerwów nie może otworzyć ust, aby się odżywiać, wydychać lub regulować ciśnienie osmotyczne. Takie zwierzęta mogą jednak przetrwać i być hodowane w laboratorium w nieskończoność, jeśli są regularnie karmione na siłę i odbijane. Brak komórek nerwowych pozwala na badania nad rolą układu nerwowego w regulacji zachowania i regeneracji zwierząt. Wcześniej opublikowane protokoły konserwacji Hydry bez nerwów obejmują przestarzałe techniki, takie jak pipetowanie ust za pomocą ręcznie ciągniętych końcówek mikropipet w celu karmienia i czyszczenia Hydry. Tutaj wprowadzono ulepszony protokół utrzymania Hydry wolnej od nerwów. Kleszcze z cienką końcówką służą do wymuszenia otwarcia ust i włożenia świeżo zabitej artemii. Po karmieniu na siłę, jama ciała zwierzęcia jest przepłukiwana świeżą pożywką za pomocą strzykawki i igły podskórnej w celu usunięcia niestrawionego materiału, co określa się tutaj jako "odbijanie". Ta nowa metoda wymuszonego karmienia i odbijania bez nerwów Hydry za pomocą kleszczy i strzykawek eliminuje potrzebę pipetowania przez usta za pomocą ręcznie ciągniętych końcówek mikropipet. Dzięki temu proces jest bezpieczniejszy i znacznie bardziej efektywny czasowo. Aby upewnić się, że komórki nerwowe w hypostomie zostały wyeliminowane, przeprowadza się immunohistochemię z użyciem tubuliny anty-tyrozyny.

Wprowadzenie

Układ nerwowy Hydry składa się z sieci nerwowej, z neuronami powiązanymi z obiema warstwami tkanki nabłonkowej1. Sieć nerwowa jest gęstsza w hypostomie i szypułce, a mniej gęsta w kolumnie ciała2. Komórki nerwowe pochodzą ze śródmiąższowych komórek macierzystych, które są multipotencjalnymi komórkami macierzystymi, które dają początek komórkom wydzielniczym, nematocytom, komórkom rozrodczym i neuronom1. Możliwe jest wyeliminowanie komórek śródmiąższowych Hydra vulgaris poprzez leczenie kolchicyną3,4, toksyną pochodzenia roślinnego, która zabija dzielące się komórki. Chociaż stwierdzono, że kolchicyna hamuje polimeryzację mikrotubul w innych organizmach, poprzednie badanie wykazało, że mikrotubule są obecne w Hydrze przez cały okres leczenia, co sugeruje, że kolchicyna nie działa w ten sposób w Hydra3. Inne badanie sugeruje, że kolchicyna nie wiąże się skutecznie z tubuliną w niektórych organizmach, w tym Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas i Schizosaccharomyces pombe, co może wyjaśniać tę różnicę5. Leczenie kolchicyną indukuje fagocytozę komórek śródmiąższowych przez komórki nabłonka endodermalnego3, a tym samym pozwala na tworzenie zwierząt, które są pozbawione komórek nerwowych, komórek gruczołowych i nematocytów. Nie jest jasne, dlaczego komórki śródmiąższowe są szczególnie podatne na leczenie kolchicyną. Biorąc pod uwagę, że zarówno postmitotyczne komórki śródmiąższowe, jak i linia śródmiąższowych komórek macierzystych są uszkodzone i fagocytozowane, Campbell doszedł do wniosku, że kolchicyna nie wpływa bezpośrednio na aktywność mitotyczną3. Warto zauważyć, że leczenie kolchicyną działa dobrze w przypadku Hydra vulgaris, ale wykazano, że nie działa tak dobrze u innych gatunków, takich jak Hydra oligactis6. Zmodyfikowana kuracja kolchicyną i hydroksymocznikiem może być użyta do wytworzenia pozbawionej nerwów Hydra viridis7. Hydra wolna od nerwów (czasami określana również jako "hydra nabłonkowa"8) jest zatem użytecznym narzędziem do badania roli tych wyspecjalizowanych typów komórek z linii komórek śródmiąższowych w homeostazie i regeneracji tkanek.

Hydra może być jedynym znanym przykładem zwierzęcia zdolnego do życia bez układu nerwowego. Hydra wolna od nerwów służy jako szczególnie użyteczny model do analizy roli sieci nerwowej w regulacji regeneracji, homeostazy i zachowania Hydry. Na przykład, wprowadzenie komórek śródmiąższowych do beznerwowej Hydry poprzez szczepienie pozwoliło na scharakteryzowanie różnicowania komórek nerwowych jako wysoce specyficznego dla regionu9. Ponadto, ponieważ beznerwowe Hydry mogą się regenerować, umożliwiają badanie alternatywnych, niezależnych od układu nerwowego ścieżek regeneracji. Jednym z takich przykładów jest neurogeneza wierzchołkowa i formowanie się głowy, które, jak wykazano, zależą od funkcji cnox-2 w układzie nerwowym u Hydry typu dzikiego, ale wydają się być zbędne u Hydry pozbawionej nerwów, co sugeruje, że może istnieć alternatywny proces regeneracji głowy10.

Hydra bez nerwów była również używana do badania ekspresji komórek nabłonkowych i regulacji genów neurogennych i neurotransmisyjnych po utracie neurogenezy11. Hydry pozbawione nerwów nie wykazują spontanicznych wybuchów skurczów12, co wskazuje, że te wybuchy są regulowane przez układ nerwowy. Pozbawiona nerwów Hydra kurczy się jednak w odpowiedzi na ściskanie kolumny ciała kleszczami, co sugeruje, że skurcz w odpowiedzi na bodźce mechaniczne jest pośredniczony przez sprzężenie przez połączenia szczelinowe w komórkach nabłonkowych, podczas gdy spontaniczne zachowanie skurczowe jest pośredniczone przez sprzężenie przez połączenia szczelinowe w komórkach nerwowych13.

Pozbawione nerwów Hydry nie otwierają ust, gdy otrzymują jedzenie lub zredukowany glutation3, co sugeruje, że neurony czuciowe są niezbędne do wykrywania obecności jedzenia i sygnalizowania otwarciu ust. Ponadto sieć nerwowa wydaje się odgrywać rolę w wyczuwaniu ciśnienia osmotycznego, ponieważ zwierzęta pozbawione nerwów nie są w stanie autonomicznie regulować swojego wewnętrznego ciśnienia hydrostatycznego poprzez otwarcie ust, co powoduje ich charakterystyczny wygląd przypominający balon3,4 (Rysunek 1B). Regulacja ciśnienia hydrostatycznego w beznerwowej Hydrze poprzez częste ręczne opróżnianie doprowadziła do utraty części nieprawidłowej morfologii w hypostomie i kolumnie ciała. Jednak chroniczna deflacja prowadziła do zakłóceń we wzroście, wydłużaniu, pączkowaniu i organizacji tkanek8.

Chociaż pozbawione nerwów Hydry nie są w stanie samodzielnie się odżywiać i egzekwować, możliwe jest utrzymanie ich w laboratorium w nieskończoność, ręcznie zmuszając je do karmienia i odbijania każdego zwierzęcia. Poprzednie publikacje opisywały metody siłowego karmienia i odbijania Hydry bez nerwów, jednak te protokoły obejmowały użycie końcówek mikropipet, które muszą być ręcznie ostrożnie pociągnięte do odpowiedniego rozmiaru, a także użycie ustnika połączonego z pipetą za pomocą rurki14. Tutaj opisano prostszą, bezpieczniejszą i bardziej efektywną czasowo metodę karmienia i odbijania.

Ponadto, poprzednie badania obejmowały sprawdzenie braku komórek nerwowych poprzez dysocjację stałych zwierząt na pojedyncze komórki i badanie morfologii komórek3,4,15. W tym przypadku immunohistochemia z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko tyrozynowanemu końcowi karboksylowemu alfa-tubuliny została użyta jako metoda uzupełniająca do maceracji w celu sprawdzenia wyczerpania neuronów w hypostomie13,16. Wcześniejsze badania wykazały, że neurony w szypułce mogą być również wizualizowane za pomocą tego przeciwciała13, jednak te neurony, jak również te w kolumnie ciała, są trudniejsze do rozpoznania. Chociaż immunohistochemia jest wystarczająca do potwierdzenia braku komórek nerwowych w hypostomie i nie wymaga specjalistycznej wiedzy na temat morfologii typu komórki, nie może być wykorzystana do sprawdzenia braku śródmiąższowych komórek macierzystych i innych pochodnych tych komórek. Badania dysocjacji i morfologii komórek są bardziej rygorystyczne i mogą dostarczyć ilościowego opisu liczby komórek każdego typu pozostałych po każdym etapie leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Leczenie podwójną kolchicyną

  1. Przygotuj 0,4% roztwór kolchicyny (waga/objętość) w Hydra medium3,4,17.
    ostrożność: Kolchicyna jest bardzo toksyczna, śmiertelna w przypadku połknięcia, może powodować wady genetyczne i może powodować uszkodzenie oczu. Z proszkiem należy obchodzić się pod wyciągiem i nosić pełne środki ochrony osobistej (PPE).
  2. Inkubuj Hydra vulgaris (użyto tutaj szczepu AEP), które były głodzone przez 24 godziny w 0,4% kolchicynie w proporcji 5 Hydra na ml roztworu kolchicyny na szalce Petriego przez 8 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności.
    Uwaga: 5 Hydra/ml kolchicyny jest wskazówką dotyczącą określania, ile roztworu należy użyć, aby uniknąć przepełnienia naczynia Hydrą. Użyj tej samej objętości roztworu do kolejnych czyszczeń i zmian roztworu.
  3. Usuń roztwór kolchicyny i zastąp go czystym podłożem Hydra bez kolchicyny. Przemyć Hydrę 5 razy przez transfer szeregowy szklaną pipetą Pasteura do czystej pożywki Hydra przed przeniesieniem do 50 μg/ml ryfampicyny w pożywce Hydra. Trzymaj Hydrę w inkubatorze o temperaturze 18 °C.
    nuta: Wystarczająca ilość 1000 razy więcej ryfampicyny (50 mg / ml) w dimetylosulfotlenku (DMSO) na 1-2 tygodnie leczenia może być przechowywana w temperaturze 4 °C. Dokładna ilość może być określona na podstawie całkowitej objętości roztworu używanego każdego dnia. Na przykład, jeśli są 2 szalki, z których każda zawiera 10 ml roztworu, który należy zmieniać dwa razy dziennie, w ciągu jednego dnia zużyje się łącznie 40 ml roztworu, co odpowiada 40 μl 1000X zapasu dziennie lub 560 μl w ciągu dwóch tygodni. Po użyciu bulion rozcieńcza się w stosunku 1:1000 w podłożu Hydra.
    ostrożność: DMSO jest łatwopalną cieczą i łatwo przenika przez skórę, wpuszczając inne rozpuszczone substancje chemiczne do organizmu. Z rozpuszczalnikiem należy obchodzić się w dygestorium i nosić pełne środki ochrony osobistej. Warto zauważyć, że DMSO zamraża się w temperaturze 4 °C
  4. Zmieniaj pożywkę Hydra zawierającą ryfampicynę dwa razy dziennie, aż Hydra przestanie wydalać komórki do pożywki, co zwykle następuje po 1 tygodniu od zabiegu. W tym momencie podłoże można zmieniać raz dziennie. W ciągu kilku dni po zabiegu Hydra całkowicie straci swoje macki. Unikaj kontaktu Hydry ze sobą, ponieważ mogą one łączyć się ze sobą i skutkować dziwnie ukształtowaną Hydrą (Rysunek 2A).
    1. Aby zapobiec kontaktowi, unikaj obracania naczynia okrężnymi ruchami. Zamiast tego delikatnie mieszaj naczynie w kierunku pionowym i poziomym, aż Hydra się rozsunie. Po umieszczeniu Hydry w inkubatorze o temperaturze 18 °C należy sprawdzić naczynie i w razie potrzeby wyregulować.
      nuta: W dniach, w których podłoże jest zmieniane dwukrotnie, należy je zmienić raz rano i ponownie po południu/wieczorem.
  5. Gdy macki zaczną się formować, zacznij karmić Hydrę na siłę i odbijać ją 3 do 4 razy w tygodniu (patrz sekcje 2 i 3). Około 8-9 dni po leczeniu kolchicyną Hydra zacznie odrastać z macek.
    nuta: Odrastanie macek różni się u poszczególnych osób. Niektóre mogą potrzebować więcej niż 8-9 dni, zanim pojawią się oznaki wzrostu macek. Te, które nie odrastają z mackami, a także zwierzęta o dziwnych kształtach (Rysunek 2B) lub zwierzęta zbyt małe, aby je karmić, powinny zostać usunięte. Te Hydry prawdopodobnie nie przeżyją drugiego zabiegu. Hydra może również pączkować. Jednak niektóre pąki mogą nadal mieć komórki śródmiąższowe i być w stanie samodzielnie jeść.
    1. Usuń wszelkie pąki, które mogą jeść bez pomocy i odłącz się od zwierzęcia rodzicielskiego. Zidentyfikuj te zwierzęta, dodając żywą artemię do naczynia do karmienia i obserwując, czy zwierzęta same łapią i zjadają artemię. 1 lub 2 Hydra mogą być również w stanie jeść samodzielnie. Te również należy wyrzucić.
      nuta: Pozbawione nerwów Hydry mają charakterystyczną morfologię przypominającą balon i macki, które są krótsze i cieńsze niż normalnie (z powodu utraty nematocytów), dzięki czemu można je łatwo odróżnić od normalnie wyglądających zwierząt (Rysunek 1A, 1B).
  6. Trzy tygodnie po pierwszym podaniu kolchicyny należy powtórzyć leczenie kolchicyną (kroki 1,1 - 1,5). Druga terapia kolchicyną jest konieczna w celu wyeliminowania pozostałych komórek śródmiąższowych i komórek nerwowych3.

2. Karmienie na siłę

  1. Dodaj cysty artemii do wąskiego i wysokiego szklanego pojemnika, który zwęża się na dole. Napełnij pojemnik wodą z artemii (6,72 M NaCl). Unikaj przekraczania 1 g cyst na 1 l wody, aby uzyskać wyższą wydajność wylęgu.
    1. Przykryć górną część pojemnika parafilmem i wprowadzić pipetę serologiczną o pojemności 10 ml przez parafilm do pojemnika. Zapewnij napowietrzanie, podłączając rurkę do pompy powietrza w akwarium i zakładając rurkę wokół pipety. Upewnij się, że końcówka pipety sięga dna pojemnika i że na dnie nie osadzają się torbiele. Artemia wykluje się po 48 godz.
      nuta: Istnieje wiele różnych sposobów wykluwania się artemii, które mogą działać równie dobrze.
  2. Odcedź artemię z wody Artemia w siatce Artemia (dostępnej w firmach akwarystycznych) i myj ją przez około 20 sekund w wodzie DI przed umieszczeniem jej w naczyniu z podłożem Hydra. Zasolenie wody Artemii jest zbyt wysokie dla Hydry, dlatego Artemia musi zostać umyta przed użyciem.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym poddaj artemię eutanazji, lekko ściskając ją parą cienkich kleszczy. Unikaj ściskania wystarczająco mocno, aby wydalić wnętrzności, ponieważ przyklei się to do kleszczy i utrudni karmienie. Lekkie ściskanie Artemii przed podaniem jej Hydrze pomoże w procesie trawienia14. Umieść świeżo zabitą artemię blisko Hydry w naczyniu, aby ułatwić szybkie karmienie.
    nuta: Wszystkie kolejne kroki wykonywane są pod mikroskopem preparacyjnym.
  4. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać Hydrę za szypułkę. Kontynuuj trzymanie szypułki podczas karmienia Hydry. Używając drugiej pary kleszczy, uszczypnij kolumnę ciała, aby Hydra się skurczyła.
  5. Trzymając razem końcówki drugiej pary kleszczy, postukaj w środek hypostemu (kopulasta struktura na ustnym końcu zwierzęcia). To czasami powoduje otwarcie ust. Jeśli usta nie otwierają się przez stukanie, nakłuj usta, wkładając kleszcze do środka hypostomu, a następnie lekko zwolnij nacisk na końcówki kleszczy. Powinno to rozciągnąć otwór ustny wykonany przez nakłucie.
    nuta: Hydra może opróżnić się i zapadnąć, gdy usta są otwarte (Rysunek 2C). Jeśli tak się stanie, Artemia może być nadal wprowadzona do Hydry. Jeśli jest to zbyt trudne, przejdź do następnej Hydry i wróć do oryginalnej Hydry jakiś czas później i spróbuj ponownie. Hydra ma tendencję do nieopróżniania się tak bardzo podczas kolejnych otwierania ust.
  6. Szybko podnieś Artemię za pomocą kleszczy i włóż je do jamy żołądkowej Hydry. Włóż jak najwięcej Artemii, aż jama żołądkowa zostanie wypełniona i nie będzie można wprowadzić więcej Artemii bez uszkodzenia Hydry, przypadkowego wyciągnięcia Artemii ze środka lub uniemożliwienia zamknięcia ust. Średnio jest to 5 - 6 artemii, jednak do 12 zostało nakarmionych większymi zwierzętami.
    1. Jeśli pysk zacznie się zamykać, rozciągnij go ponownie kleszczami, jak opisano powyżej; należy jednak zachować ostrożność, ponieważ artemia znajdująca się już wewnątrz zwierzęcia może zacząć wydostawać się po ponownym otwarciu pyska.
    2. Jeśli Hydra jest za mała na całą Artemię, pokrój Artemię za pomocą skalpela i nakarm Hydrę mniejszymi kawałkami. Jeśli Artemia nie pozostanie w Hydrze, może być konieczne przyciśnięcie kleszczy do Artemii, aby utrzymać ją w Hydrze, dopóki jej usta się nie zamkną.
  7. Przenieść podawaną Hydrę za pomocą szklanej pipety Pasteura, ostrożnie, aby uniknąć przypadkowego odbijania, do naczynia ze świeżą 50 μg/ml ryfampicyny w pożywce Hydra. Jeśli Artemia została wydalona z Hydry podczas przenoszenia, włóż ją ponownie w nowym naczyniu.
    nuta: Do przenoszenia Hydry używa się szklanej pipety, ponieważ stwierdzono, że Hydra mniej przylega do szkła w porównaniu z plastikiem. Długość pipety nie ma znaczenia, ale korzystanie z pipet 5-calowych może być nieco łatwiejsze.

3. Odbijanie

  1. Odbijaj Hydrę, aby usunąć niestrawiony materiał w dowolnym momencie od 8 do 20 godzin po karmieniu.
  2. Przeszlifuj czubek igły podskórnej 30G papierem ściernym P320 lub podobnym ziarnistym, aż końcówka będzie płaska.
    nuta: Igła podskórna 27G również by się sprawdziła, ale preferowana jest mniejsza końcówka o wyższej grubości.
  3. Przymocować igłę do jednorazowej plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i napełnić strzykawkę świeżą 50 μg/ml ryfampicyną w pożywce Hydra.
    nuta: Odbijanie pojedynczej Hydry zajmuje około 0,05 ml do 0,1 ml roztworu. Preferowana jest strzykawka o pojemności 1 ml, ponieważ kontrolowanie siły i objętości wypływającego roztworu jest trudniejsze w przypadku strzykawki o większej objętości.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj szypułkę Hydry cienkimi kleszczami punktowymi i postukaj igłą w środek hypostomu. Jeśli usta się nie otwierają, włóż kleszcze do hypostomu i otwórz usta zgodnie z powyższym opisem do karmienia.
    nuta: Wszystkie kolejne kroki wykonywane są pod mikroskopem preparacyjnym.
  5. Za pomocą strzykawki bardzo delikatnie przepłukać jamę żołądkową całego zwierzęcia roztworem ryfampicyny o stężeniu 50 μg/ml, aż wszystkie zanieczyszczenia zostaną usunięte. Igła niekoniecznie musi być wkładana do Hydry, jeśli rozmiar Hydry na to nie pozwala. Igła może być trzymana blisko otworu ust i skierowana bezpośrednio w stronę ust.
  6. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś odbitą Hydrę do naczynia ze świeżą 50 μg/ml ryfampicyny w pożywce Hydra.

4. Kontrola jakości za pomocą immunohistochemii

UWAGA: Poniższy protokół jest zaadaptowany z protokołów Shenk, M. A, i wsp.18, oraz Böttger, A19. Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT), chyba że zaznaczono inaczej. Do etapów inkubacji można użyć nutatora, który może poprawić jakość barwienia. Jeśli jednak Hydra zaplącze się ze sobą, wszystkie kroki można również wykonać bez.

  1. Przygotuj roztwór blokujący: 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% DMSO w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać ten roztwór w temperaturze 4 °C do czasu użycia (kroki 4.6 i 4.11). Roztwór można przechowywać przez 1 - 2 dni.
    nuta: Wszystkie rozwiązania zastosowane w tym protokole muszą być prawidłowo zebrane jako odpady niebezpieczne.
  2. Relax Hydra w 200 μl 2% uretanu w podłożu Hydra przez 1 minutę w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Użyj 5 Hydra na probówkę dla każdego z 4 stanów: bez nerwów, nieleczony, nieleczony bez przeciwciał pierwszorzędowych i nieleczony bez przeciwciał drugorzędowych.
    nuta: Nie przekraczać 1 minuty. Czas ma tutaj kluczowe znaczenie, ponieważ zwierzęta będą w złej kondycji po spędzeniu zbyt dużo czasu w uretanie.
  3. Usuń uretan i utrwal Hydrę w 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w podłożu Hydra przez 15 minut.
  4. Umyj próbki 3 razy 1x PBS przez 10 minut każda.
    nuta: Wszystkie mycia PBS i PBSTx wykonuje się przy użyciu 500 μl roztworu.
  5. Przepuszczać 500 μl 0,5% Triton X-100 w PBS przez 15 min.
  6. Usuń 0,5% Triton X-100 i dodaj 500 μl roztworu blokującego. Zablokować próbki na co najmniej 1 godzinę.
  7. Rozcieńczyć przeciwciało anty-tyrozynowo-tubulinowe w stosunku 1:200 w roztworze blokującym.
    nuta: Stężenie to oznaczono doświadczalnie. Jeśli okaże się, że sygnał w kontrolkach jest zbyt słaby, może być konieczne zwiększenie stężenia. W przypadku niespecyficznego wiązania może być konieczne zmniejszenie stężenia. Wstępna inkubacja przeciwciała może również pomóc w zmniejszeniu niespecyficznego wiązania.
  8. Usunąć roztwór blokujący z próbek i dodać 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego do beznerwowej Hydry, nieleczonych kontrolek i nieleczonych kontroli bez wtórnego. W przypadku nieleczonych prób kontrolnych bez przeciwciała pierwszorzędowego należy dodać tylko 200 μl roztworu blokującego bez przeciwciała.
  9. Próbki inkubować przez noc (>12 h) w temperaturze 4 °C.
    >nuta: Alternatywnie, inkubować 5 - 6 godzin w temperaturze pokojowej.
  10. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i dokładnie przemyć próbki 0,3% Triton X-100 w 1x PBS (PBSTx).
    nuta: Zachowaj przeciwciało pierwotne i przechowuj je w temperaturze 4 °C, ponieważ może być ponownie użyte co najmniej 2 - 3 razy.
  11. Rozcieńczyć kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszemu hP w stosunku 1:500 w roztworze blokującym. Dodaj 200 μl do beznerwowej Hydry, nieleczonych kontroli i nieleczonych kontroli bez podstawowej. W przypadku nieleczonych prób kontrolnych bez wtórnika należy dodać tylko 200 μl roztworu blokującego bez przeciwciała.
    nuta: Alternatywnie można zastosować fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe, dla którego kroki 4,13 - 4,17 nie są potrzebne. Użycie wtórnego fluorescencyjnego oszczędza czas i jest na ogół wystarczające, ale wtórny hP zapewnia zwiększoną czułość. Stężenie wtórne oznaczono doświadczalnie. Jeśli sygnały w kontrolach okażą się zbyt słabe, może być konieczne zwiększenie stężenia. W przypadku niespecyficznego wiązania może być konieczne zmniejszenie stężenia.
  12. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  13. Usunąć przeciwciało drugorzędowe i dokładnie przemyć próbki PBSTx.
  14. Przygotuj 1x PBT: 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (waga/objętość) i 0,05% Tween20 w 1x PBS. Inkubować próbki w 1x PBT przez 30 minut.
  15. Usunąć 1x PBT i inkubować próbki w 1:1,000 NHS-fluoresceina i 1:10,000 H2O2 w 1x PBT przez 15 minut w ciemności. Od tego momentu należy utrzymywać próbki w ciemności tak długo, jak to możliwe, ponieważ sygnał fluorescencyjny będzie się zmniejszał, gdy będą wystawione na działanie światła.
    nuta: NHS-fluoresceina została przygotowana zgodnie ze szczegółowym protokołem FISH przez King, R. S. i Newmark, P. A.20
  16. Szybko przemyć próbki 3 razy PBSTx, a następnie 2 razy przez 30 minut.
  17. Pozostawić próbki w PBSTx na noc w temperaturze 4 °C, aby kontynuować mycie.
  18. Wykonaj jeszcze kilka prań z 1x PBSTx. Aby uwidocznić jądra komórkowe, należy wykonać następujące opcjonalne kroki barwienia przeciwstawnego DNA za pomocą dichlorowodorku 4', 6-diamindino-2-fenyloindolu (DAPI). W przeciwnym razie próbki mogą być teraz obrazowane.
  19. Rozcieńczyć 5 mg/ml preparatu DAPI do stężenia roboczego 1:500 w PBSTx i dodać 200 μl do każdej probówki. Inkubować próbki przez 30 min.
    ostrożność: DAPI jest znanym czynnikiem rakotwórczym. Nosić pełne środki ochrony osobistej.
  20. Usuń DAPI i umyj próbki 2-3 razy PBSTx przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bezpośrednio po początkowej 8 h kuracji kolchicyną wszystkie Hydra przeżywają. U niektórych z tych Hydra pozostaną jedynie pozostałości czułków (Rycina 3A), podczas gdy inne całkowicie stracą czułki (Rycina 3B). W ciągu kolejnych 1 lub 2 dni czułki będą nadal zanikać, aż wszystkie Hydra je utracą. Około 1 tygodnia po zabiegu u Hydra pojawią się oznaki odrastani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki śródmiąższowe Hydra mogą być eliminowane poprzez podwójne leczenie kolchicyną 3,4. W ciągu kilku dni po pierwszym zabiegu bardzo ważne jest, aby zapobiec kontaktowi między poszczególnymi Hydrami, aby uniknąć fuzji kawałków Hydry w zdeformowaną Hydrę. Również zwierzęta, które mogą jeść samodzielnie po pierwszym podaniu, muszą zostać usunięte, ponieważ drugie leczenie kolchicyną może nie być wystarczające do wyeliminowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Dickowi Campbellowi (UC Irvine) za dyskusję na temat oryginalnego protokołu generowania i utrzymywania zwierząt pozbawionych nerwów, Pani Rui Wang za pomoc w adaptacji techniki strzykawki i igły, oraz Pani Danielle Hagstrom i Dr. Robowi Steele'owi (UC Irvine) za komentarze do manuskryptu. Prace te były wspierane przez RCSA i grant NSF CMMI-1463572.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ColchicineAcros Organics227120010
1 ml StrzykawkaBD301025
Solanka JajaKrewetki Solankowe BezpośrednieNie dotyczyMożna kupić lokalnie
Solanka Naczynie wylęgowe dla krewetekSolanka Krewetki BezpośrednieNie dotyczy
60 mm x 15 mm Szalka PetriegoCelltreat229663
30 G x 3/4" Igła podskórnaCovidien1188830340Można również użyć igły 27G
2 x pęseta z cienką końcówkąDumont0109-5-PO
RyfampicynaEMD Milipore557303
Koza anty-mysia lgG, Pab (koniugat HRP)EnzoADI-SAB-100-J
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)FisherBP9703-100
SkalpelFisher08-920A
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10437028
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Tabletki InvitrogenD1306
PBSMP Bio2810305
Monoklonalna antytubulina, TyrozynaSigmaT9028
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Nadtlenek wodoruSigma216763
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148
Triton X - 100SigmaT9284
Tween 20SigmaP1379
UretanowaSigmaU2500
Tetra77846-00
Szklana pipeta PasteuraVWR53283-916Długość pipety nie ma znaczenia
Rurka 15 ml PapierVWR89039-670
P3203MIBGABBV00397Można kupić w lokalnym sklepie dla majsterkowiczów
pompa powietrza ścierny

Bibliografia

  1. Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
  2. Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
  3. Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
  4. Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
  5. Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
  6. Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
  7. Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
  8. Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
  9. Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
  10. Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
  11. Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
  12. Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
  13. Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
  14. Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
  15. David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
  16. Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
  17. Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
  18. Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
  19. Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
  20. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Karmienie przymusowetechnika odbijanialinia komórek śródmiąższowychleczenie kolchicynąimmunohistochemiabarwienie tyrozyną-tubulinąkarmienie Artemiamanipulacja hypostomiumsuplementacja ryfampicyną
Wytwarzanie i długotrwałe utrzymywanie hydry wolnej od nerwów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.