Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwyrodnienie neuronów występuje podczas normalnego rozwoju oraz w odpowiedzi na urazy, stres i choroby. Komórkowe cechy zwyrodnienia neuronów są niezwykle podobne u ludzi i bezkręgowców, podobnie jak mechanizmy molekularne, które napędzają te procesy. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, stanowi potężny, ale prosty model genetyczny organizmu do badania złożoności komórkowej chorób neurodegeneracyjnych. W rzeczywistości około 70% ludzkich genów związanych z chorobą ma homolog Drosophila, a mnóstwo narzędzi i testów zostało opisanych przy użyciu much do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. Mówiąc dokładniej, połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) u Drosophila okazało się skutecznym systemem do badania chorób nerwowo-mięśniowych ze względu na możliwość analizy połączeń strukturalnych między neuronem a mięśniem. W tym miejscu informujemy o teście uszkodzenia neuronu ruchowego in vivo u Drosophila, który w powtarzalny sposób indukuje neurodegenerację w NMJ przez 24 godziny. Korzystając z tej metodologii, opisaliśmy czasową sekwencję zdarzeń komórkowych powodujących zwyrodnienie neuronów ruchowych. Metoda urazów ma różnorodne zastosowania i została również wykorzystana do identyfikacji określonych genów wymaganych do neurodegeneracji oraz do analizy odpowiedzi transkrypcyjnych na uszkodzenie neuronów.
Wprowadzenie
Zwyrodnienie neuronów występuje podczas normalnego rozwoju i może być spowodowane naturalnym procesem starzenia, urazami, stresem lub stanami chorobowymi. Drosophila melanogaster, pospolita muszka owocowa, stanowi prosty i potężny organizm modelowy do badania neurodegeneracji ze względu na niezwykłe podobieństwa w mechanizmach molekularnych, które napędzają degenerację neuronów. Podobieństwa te podkreśla fakt, że około 70% ludzkich genów związanych z chorobą ma homolog Drosophila. 1 Dodatkowo, liczne testy i narzędzia technologiczne do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych zostały opracowane i wykorzystane w Drosophila. 2,3 U Drosophila, połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) pozwala na analizę zarówno właściwości komórkowych, jak i elektrofizjologicznych i okazało się ważnym systemem do badania chorób nerwowo-mięśniowych ze względu na widoczne połączenia neuron-mięśnie. 2 W tym badaniu opisujemy test in vivo na uszkodzenia neuronów u larw Drosophila, który pozwala na powtarzalne uszkodzenie nerwów segmentowych. To uszkodzenie neuronu ruchowego powoduje czasową sekwencję zdarzeń komórkowych powodujących neurodegenerację w NMJ 24 godziny po urazie. Zdolność do powtarzalnego uszkadzania motoneuronów powodujących neurodegenerację ma różnorodne zastosowania, takie jak identyfikacja określonych genów wymaganych w procesie zwyrodnieniowym, analiza odpowiedzi transkrypcyjnych na uszkodzenie neuronów oraz analiza ochronnych kaskad sygnałowych. 4,5,6 Metoda ta była również stosowana w połączeniu z mikrofluidyką do badania degeneracji i regeneracji neuronów u żywych zwierząt. 7
Używamy sprawdzonego testu ilościowego do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych u Drosophila NMJ po urazie mechanicznym. Test ten opiera się na fakcie, że utrata błony presynaptycznej i białek poprzedza demontaż retikulum subsynaptycznego (SSR) charakteryzującego się postsynaptycznym fałdowaniem błony mięśniowej. 8,9,10,11,12,13 Ten test pozwala na ilościowe określenie "śladów synaptycznych", w których neuron presynaptyczny utracił połączenie z sąsiednim mięśniem postsynaptycznym. Wykazano, że proces zwyrodnieniowy postępuje przez cały okres rozwoju larw12 i nie można go wytłumaczyć zmienionym rozwojem synaps lub kiełkowaniem. 8,9,10,11,12 Przewaga stosowania urazów mechanicznych nad wcześniej istniejącymi mutacjami polega na tym, że pozwala na rozbiór sekwencji czasowej zdarzeń komórkowych prowadzących do neurodegeneracji w NMJ. 13
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników i sprzętu
- Przygotować 1x bufor preparacyjny (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sacharozy, 5 mM trehalozy, 5 mM HEPES; pH 7,2).
- Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Przygotuj 1x PBT za pomocą 1x PBS z 0,01% Triton X-100.
- Przygotuj talerze agarowe z sokiem owocowym. 14 Krótko wymieszaj 30 g agaru w 700 ml H2O i przeprowadź autoklaw. Rozpuścić 0,5 g metyloparabena w 10 ml etanolu i dodać roztwór do 300 ml koncentratu soku owocowego (winogronowego lub jabłkowego). Wymieszać koncentrat z autoklawowanym roztworem agaru i wlać do pokrywek szalek Petriego o wymiarach 10 mm x 35 mm.
UWAGA: Premiks mocy agaru winogronowego można również kupić w różnych firmach (patrz Tabele materiałów). - Zaopatrz się w kleszcze w rozmiarze 5, które pozwolą na mechaniczne zranienie larw.
- Używaj standardowego aparatu anestezjologicznego opartego na Drosophila CO2.
2. Wybór larw Drosophila
- Pobrać fiolkę lub butelkę Drosophila zawierającą wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego, które zostały wyhodowane w temperaturze 25 °C.
- Wybierz dziesięć pojedynczych larw w 2. lub 3. stadium na podstawie wyglądu. Larwy w trzecim stadium rozwojowym można rozpoznać po wyglądzie przednich rozgałęzionych przetchlin, podczas gdy larwy w drugim stadium są mniejsze i mają bardziej maczugowate przetchlinki przednie.
UWAGA: Stadia larwalne można również zidentyfikować na podstawie czasu. W temperaturze 25 °C larwy drugiego stadium rozwojowego pojawiają się około 48 godzin po wykluciu, a larwy trzeciego stadium linieją około 24 godziny później. Jeśli jesteś zainteresowany badaniem neurodegeneracji w NMJ, larwy drugiego stadium muszą zostać zranione.
3. Przygotowanie larw Drosophila do urazów mechanicznych
- Ostrożnie zbieraj pojedyncze larwy kleszczami lub pędzlem, uważając, aby w żaden sposób ich nie ścisnąć.
- Bezpośrednio umieść dziesięć larw w szklanym naczyniu zawierającym zimny 1X PBS lub bufor do preparacji, aby usunąć wszelkie resztki jedzenia i spowolnić ruchliwość larw.
4. Mechaniczne urazy i leczenie larw Drosophila
- Umieść każdą pojedynczą larwę na aparacie znieczulającym CO2 .
- Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przetocz każdą larwę na stronę grzbietową, aby uwidocznić nerwy segmentowe przez naskórek.
- Pozycja rozmiar 5 kleszcze około 1/2 do 2/3 długości larwy, zaczynając od haczyków gębowych. Po ustawieniu ściśnij około 1/3 naskórka brzusznego zawierającego nerwy segmentowe za pomocą kleszczyków o rozmiarze 5.
- Aby upewnić się, że nerwy segmentowe larw są uszkodzone, należy zastosować wystarczającą siłę, aby zmiażdżyć nerwy segmentowe, ale pozostawić naskórek nienaruszony. Aby określić prawidłową siłę działania, zmiażdż 10 larw i upewnij się, że śmiertelność po 5 godzinach wynosi poniżej 50%.
- Po urazie ostrożnie przenieś larwy na talerz agarowy z sokiem owocowym zawierający około 0,5 g pasty drożdżowej. Umieść każdą larwę tak, aby jej przedni koniec znajdował się na paście drożdżowej, aby kontynuować karmienie pomimo zakłóconej ruchliwości.
UWAGA: Aby upewnić się, że nerwy segmentowe larw zostały uszkodzone, po przeniesieniu na płytkę agarową można zaobserwować zakłóconą ruchliwość larw. Zranione larwy są skutecznie sparaliżowane z tyłu w stosunku do miejsca urazu, ale nadal mogą poruszać haczykami do ust i żerować. Wysoka śmiertelność zwierząt po zranieniu jest powszechna, dlatego najlepiej jest zranić 20-50% więcej zwierząt, niż jest to konieczne do przeprowadzenia eksperymentu. - Umieść płytki agarowe zawierające pastę drożdżową i 10 zranionych larw na dnie pustej szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm. Przykryj tę płytkę Petriego, teraz zawierającą zranione larwy na płytce agarowej, wilgotnym ręcznikiem papierowym, upewniając się, że ręcznik papierowy nie dotyka larw ani płytek agarowych. Umieść tę szalkę Petriego w większym, hermetycznym pojemniku, w temperaturze RT.
- Pobrać larwy do sekcji po określonych okresach (6, 12 lub 24 godzin) po urazie.
UWAGA: Aby zbadać natychmiastowy wpływ urazu na cytoszkielet aksonalny, larwy można wypreparować bezpośrednio po urazie. W celu zbadania wad transportu aksonalnego larwy można wypreparować około 6 godzin po urazie. Po około 12 godzinach od urazu można zaobserwować nagromadzenie ubikwitynowanych białek, a po 24 godzinach od urazu można zaobserwować zwyrodnienie neuronów ruchowych w NMJ.
5. Analiza neurodegeneracji w NMJ
- Wypreparuj larwy Drosophila NMJ, jak opisano wcześniej. 15,16 Krótko mówiąc, przypnij larwy do płytki Sylgarda, przetnij wzdłuż powierzchni grzbietowej i zafiletuj szpilkami w kropli bufora preparacyjnego, aby odsłonić muskulaturę ściany ciała. Utrwal larwy w 4% paraformaldehydzie (PFA) lub roztworze Bouina, w zależności od przeciwciał używanych do wizualizacji neuronów i mięśni.
UWAGA: Utrwalanie PFA powinno być stosowane, jeśli fluorescencyjne znaczniki białkowe, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), mają być uwidocznione, ponieważ utrwalacz Bouina może być zbyt ostry. - Wykonaj immunofluorescencję, która została opisana wcześniej11,13,16, aby jednocześnie oznaczyć presynaptyczne neurony ruchowe i sąsiednie postsynaptyczne (SSR) fałdy mięśniowe. Wizualizacja błon presynaptycznych i aksonów za pomocą fluorescencyjnie sprzężonej peroksydazy chrzanowej (HRP) (1:300)17 i strefy aktywne można wybarwić za pomocą przeciwciała anty-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1:100; Studia Rozwojowe Hybridoma Bank). Jednocześnie oznacz mięśnie postsynaptyczne przeciwciałem anty-Dics Large (Dlg) (1:10 000). 18
- Wykonaj ustalony test do ilościowego określenia neurodegeneracji w NMJ, jak opisano wcześniej. 8,9,10,11,12,13,14 Krótko mówiąc, jednocześnie wizualizuj poszczególne NMJ zarówno dla przedziałów pre-, jak i post-synaptycznych. Wszystkie butony oznaczone markerami postsynaptycznymi, ale nie markerami presynaptycznymi, wskazują na miejsca neurodegeneracji (Ryc. 1). Można określić ilościowo średnią liczbę bulionów na NMJ, jak również średnią liczbę NMJ na zwierzę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując przedstawioną tutaj procedurę, wykazaliśmy, że mechaniczne uszkodzenie neuronów pozwala na czasową analizę zdarzeń neurodegeneracyjnych.14,18 Sekwencja tych zdarzeń została wcześniej scharakteryzowana i rozpoczyna się od natychmiastowej dezintegracji cytoszkieletu, po której następują defekty transportu aksonalnego, gromadzenie się ubikwitynowanych białek oraz późniejsza neurodegeneracja 24 h po urazie. Przed uszkodzeniem...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mechaniczne uszkodzenie neuronów opisane wcześniej i zademonstrowane tutaj może być wykorzystane do wywołania urazu/stresu w nerwach segmentowych larw Drosophila. 4,5,6,14 Ta eksperymentalna technika była wcześniej stosowana do analizy czasowej sekwencji zdarzeń prowadzących do neurodegeneracji, a także do badania zmian transkrypcyjnych w ciałach komórek neuronów ruchowych po urazie. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Keller and Magie Labs na Uniwersytecie Quinnipiac za pomocne sugestie. W szczególności chcielibyśmy podziękować Barronowi L. Lincolnowi II za opracowanie tego testu na uszkodzenia w Keller Lab. Chcielibyśmy również podziękować Quinnipiac University College of Arts and Science Grant-In-Aid przyznanemu L.C. Keller.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nożyczki do mikropreparowania | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Kleszcze | Fine Science Tools | 11231-30 | Niektórzy wolą rozmiar 3, podczas gdy inni wolą rozmiar 5 |
| Dumont #5 Kleszcze | Fine Science Tools | 11251-30 | Niektórzy wolą rozmiar 3, podczas gdy inni wolą rozmiar 5 |
| CO2 Zbiornik powietrza | Tech Air | UN 1013 | Można kupić zbiorniki o różnych rozmiarach |
| CO2 Aparatura anestezjologiczna | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Kołki ze stali nierdzewnej, rozmiar 0,1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Elastomer silikonowy, baza i utwardzacz | Dow Corning | 3097358-1004 | Do nalewania płytek preparacyjnych |
| Roztwór Bouina | Sigma | HT 10132-1L | Przeciwciała powinny być badane pod kątem ich skuteczności w Bouin's i PFA |
| 4% paraformaldehyd (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Przeciwciała powinny być testowane pod kątem ich skuteczności w |
| stereoskopowym mikroskopie | AmScope | SM-1BZ | |
| Źródło światła | Przeciwciało anty-nc82 AmScope | HL150-AY-220V | |
| Badania rozwojowe Hybridoma Bank | nc82-s | ||
| anty-dyski duże przeciwciało | Badania rozwojowe Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor peroksydaza antychrzanowa | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | Można Alexa Fluor® 488, 594 lub 647 |
| Flystuff Sok winogronowy Premiks agarowy | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Skrzynka narzędziowa | Fisher Scientific | 03-484C | Służy do tworzenia wilgotnej komory do odzyskiwania larw |
Bibliografia
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998(2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
