Artykuł metodologiczny

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

DOI:

10.3791/56132

⸱

5 października 2017

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza sieci pokarmowych jest niezbędna do lepszego zrozumienia ekosystemów. Na przykład interakcje w sieci troficznej mogą ulegać poważnym zmianom spowodowanym inwazją gatunków obcych. Jednak dokładna identyfikacja interakcji drapieżnik-ofiara w terenie jest w wielu przypadkach trudna. Analizy te często opierają się na wizualnej ocenie zawartości jelit lub analizie proporcji izotopów stabilnych (δ15N i δ13C). Takie metody wymagają wszechstronnej wiedzy na temat, odpowiednio, różnorodności morfologicznej lub sygnatury izotopowej poszczególnych organizmów drapieżnych, co prowadzi do przeszkód w dokładnej identyfikacji organizmów drapieżnych. Wizualne analizy zawartości jelit szczególnie zaniżają znaczenie miękkich organizmów drapieżnych, ponieważ maceracja, spożycie i trawienie organizmów drapieżnych utrudnia identyfikację konkretnych gatunków. W związku z tym strategie oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), na przykład stosowanie zestawów starterów specyficznych dla danej grupy, stanowią potężne narzędzie do badania interakcji w sieci pokarmowej. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły badania zawartości jelit konsumentów makrobezkręgowców w terenie przy użyciu specyficznych dla grupy zestawów starterów dla jądrowego kwasu rybosynukleinowego (rDNA). DNA można ekstrahować albo z całych próbek (w przypadku małych taksonów), albo z treści jelitowej próbek zebranych w terenie. Obecność i sprawność funkcjonalną matryc DNA należy potwierdzić bezpośrednio od badanej osoby za pomocą uniwersalnych zestawów starterów ukierunkowanych na odpowiednią podjednostkę DNA. Wykazaliśmy również, że spożytą zdobycz można określić dalej aż do poziomu gatunku za pomocą PCR z niezmodyfikowanymi starterami specyficznymi dla grupy w połączeniu z późniejszymi analizami polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP) przy użyciu żeli poliakrylamidowych. Ponadto wykazaliśmy, że zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych jako znaczników umożliwia równoległe badania przesiewowe fragmentów DNA różnych grup ofiar z wielu próbek zawartości jelit za pomocą automatycznej analizy fragmentów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje drapieżnik-ofiara, które stanowią większość interakcji troficznych i dynamiki sieci pokarmowej, są kluczowymi aspektami do scharakteryzowania przepływów materii i energii w sieciach pokarmowych wewnątrz i pomiędzy ekosystemami, co jest jednym z głównych celów ekologii1. Określenie źródła i przepływu węgla i składników odżywczych pogłębia wiedzę na temat ekologicznych połączeń między ekosystemami2. Jednak ekosystemy, takie jak rzeki i ich zlewnie, są połączone nie tylko przez przepływy materii organicznej i składników odżywczych, ale także przez ruchy organizmów3. Tak więc zmiany siedlisk przerywające przepływ zasobów łączących te systemy mogą silnie zmienić sieci pokarmowe obu ekosystemów, nie tylko bezpośrednio, ale także pośrednio, zmieniając odpowiedni skład społeczności drapieżników i ofiar. Na przykład wykazano, że zmiany w sieciach pokarmowych są związane z przemieszczaniem się pojedynczych gatunków drapieżników (np. pstrąga tęczowego)4. Takie zmiany mogą zagrażać różnorodności biologicznej i funkcjonowaniu ekosystemów wodnych. Dlatego analiza interakcji drapieżnik-ofiara w terenie jest niezbędna do określenia wpływu zmian środowiskowych wywołanych przez człowieka, takich jak praktyki gospodarki wodnej, na rodzimą różnorodność biologiczną ekosystemów wodnych.

Ponieważ śledzenie powiązań troficznych jest trudne w złożonych systemach, ustalono kilka podejść, które umożliwiają ocenę interakcji żywieniowych w terenie5. Tradycyjnie, badania interakcji żywieniowych w terenie opierają się na wizualnej identyfikacji szczątków ofiar w wypreparowanych jelitach i wymagają rozległej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej ofiar. Wizualne analizy zawartości jelit dostarczyły informacji na temat wykorzystania zasobów przez kilka grup konsumentów (np. sezonowe różnice w diecie homarów6 i fish7,8 lub preferencje żywieniowe widłonogów). Jednak fizyczny proces trawienia sprawia, że wizualna analiza treści jelitowej jest trudna i zwykle pomija miękkie ciała ofiary9. W przypadku gatunków żywiących się płynem lub niektórych bezkręgowców, które intensywnie rozdrabniają pokarm przed spożyciem, takich jak obunogi, wizualna identyfikacja gatunków ofiar w treści jelit jest niemożliwa10. Ze względu na te ograniczenia analiza molekularna stanowi obiecującą alternatywę.

Analizy molekularne stały się teraz powszechnym narzędziem umożliwiającym szybkie i precyzyjne wykrywanie zdobyczy w zawartości jelit. Zakres takich technik jest różnorodny: często stosuje się strategie oparte na przeciwciałach monoklonalnych lub reakcjach łańcuchowych polimerazy (PCR), ze względu na ich wysoką swoistość i czułość11. Opracowanie nowych przeciwciał monoklonalnych jest czasochłonne i kosztowne, dlatego zastosowanie innych technik molekularnych jest bardziej przydatne, gdy przeciwciała jeszcze nie istnieją11. Innym powszechnym podejściem jest amplifikacja regionów kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), takich jak geny rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (RNA) obecne u większości gatunków, przy użyciu uniwersalnych zestawów starterów12,13. Podczas korzystania z tej techniki często nie jest możliwe zidentyfikowanie całego zakresu organizmów drapieżnych w mieszanych źródłach DNA14. Skutecznym podejściem do uniknięcia takiej wady jest stosowanie specyficznych dla grupy zestawów starterów do analiz genetycznych treści jelitowych. Zaprojektowane tak, aby amplifikować tylko regiony DNA określonych grup docelowych i wykluczać wszystkie inne gatunki15,16, startery specyficzne dla grupy umożliwiają identyfikację organizmów drapieżnych na poziomie taksonomicznym określonych grup bez czasochłonnych i kosztownych analiz wtórnych. Jednak, podobnie jak wszystkie analizy zawartości jelit, takie analizy dostarczają tylko migawki zachowań żywieniowych. Dlatego połączenie molekularnych analiz zawartości jelit z analizami naturalnych znaczników integrujących czas (np. stabilnych izotopów) jest uważane za korzystne1,2.

Tutaj opisujemy szczegółową metodę badań interakcji drapieżnik-ofiara opartej na PCR, przy użyciu specyficznych dla grupy zestawów starterów dla regionów jądrowego rybosomalnego DNA (rDNA), które mają być połączone z analizami stabilnych izotopów tego samego próbki. Opisujemy wykrywanie DNA pojedynczych grup ofiar za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Dodatkowo stwarzamy możliwość dalszych analiz produktów PCR takich starterów specyficznych dla grupy, mających zastosowanie wszędzie tam, gdzie wymagana jest wyższa rozdzielczość taksonomiczna niż swoistość starterów. Ponieważ jednoniciowe fragmenty DNA (ssDNA) tworzą trzeciorzędowe konformacje, które są determinowane przez ich pierwotną sekwencję17, niewielkie różnice we fragmentach amplifikowanych przez takie specyficzne dla grupy startery prowadzą do zmian konformacyjnych. Takie zmiany można wykryć za pomocą analiz polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP) z żelami poliakrylamidowymi17,18, co umożliwia bardziej precyzyjną identyfikację organizmów drapieżnych (aż do poziomu gatunku).

Podczas gdy elektroforeza w żelu agarozowym jest powszechnym i niedrogim narzędziem do wizualizacji fragmentów DNA i określenia ich przybliżonej długości19, rozdzielczość zależy od ilości DNA i użytego barwnika barwiącego20. Zazwyczaj wizualizacja jest prosta podczas pracy z czystymi próbkami DNA, ale potencjalnie niewielkie ilości DNA ofiary w treści jelitowej konsumentów mogą skomplikować ocenę wyników elektroforezy w żelu agarozowym. Mimo to ta metoda wykrywania jest wykonalna do badania przesiewowego niewielkiej liczby osobników konsumenckich z terenu pod kątem jednej lub kilku grup ofiar, ale komplikacje w punktacji sprawiają, że badanie przesiewowe dużej liczby próbek pod kątem wielu taksonów ofiar jest niezwykle czasochłonne, a zatem niewykonalne. Bardziej czułą metodą detekcji jest automatyczna analiza fragmentów za pomocą elektroforezy kapilarnej, która dodatkowo pozwala na określenie dokładnej długości fragmentów21. Kilka badań mikrosatelitarnych wykazało, że przy użyciu różnych barwników fluorescencyjnych jako etykiet, możliwe jest wykrycie i określenie różnych fragmentów o porównywalnej długości za pomocą automatycznej analizy fragmentów22,23,24. Dlatego przedstawiamy również szczegółowy protokół równoległego wykrywania DNA z wielu grup ofiar za pomocą PCR z znakowanymi zestawami starterów specyficznych dla grupy oraz wykrywania poprzez automatyczną analizę fragmentów za pomocą automatycznego sekwenatora. Dodatkowo przedstawiamy wyniki studium przypadku pokazujące, że wykrywanie DNA ofiary za pomocą automatycznej analizy fragmentów jest podejściem, które umożliwia również względną kwantyfikację spożytej ofiary.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbierz makrobezkręgowce z pola i przygotuj próbki do analizy genetycznej zawartości jelit

.
  1. Zbierz makrobezkręgowce w każdym miejscu, posortuj osobniki gatunków konsumenckich w pojedynczych probówkach i bezpośrednio zamroź je w ciekłym azocie lub suchym lodzie, aby zapobiec klirensowi jelitowemu i degradacji DNA.
    UWAGA: Unikaj przechowywania próbek w alkoholu, ponieważ niektóre makrobezkręgowce mają tendencję do zwracania pokarmu, zanim alkohol je zabije.
  2. Do analiz genetycznych zawartości jelit należy używać wyłącznie przewodu pokarmowego średnich i dużych (około >3 mm) gatunków makrobezkręgowców, aby pozostała materia próbki mogła być wykorzystana do innych procedur (np. analizy stabilnych izotopów). Należy zauważyć, że nie ma to zastosowania w przypadku badania bardzo małych taksonów, takich jak roztocza wodne. W związku z tym kroki 1.2.1 i 1.2.2 można pominąć.
    1. Lekko rozmrozić osobę i ostrożnie wypreparować jej przewód pokarmowy pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą drobnych kleszczyków ze stali nierdzewnej. Upewnij się, że nie przekłuwasz przewodu pokarmowego, aby uniknąć utraty materii.
    2. Oczyść kleszcze za pomocą roztworu odkażającego w celu usunięcia zanieczyszczeń DNA i RNA po przygotowaniu każdego przewodu pokarmowego. Dlatego inkubuj kleszcze przez 10 minut w roztworze odkażającym. Następnie spłucz je sterylną wodą, aby usunąć resztki śladów i wytrzyj je niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym.
    3. Przenieść wypreparowany przewód pokarmowy do probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 ml zawierającej 440 μl (450 μl możliwe przy użyciu pipety) buforu do ekstrakcji soli [SEB; 0,4 M chlorku sodu (NaCl), 10 mM chlorowodorku tris(hydroksymetylo)-aminometanu (Tris-HCl) pH 8,0 i 2 mM odwodnionej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) pH 8,0]. Przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C natychmiast do czasu ekstrakcji DNA. Upewnij się, że DNA zostanie wyekstrahowane w ciągu kilku dni.
  3. Użyj zmodyfikowanego protokołu ekstrakcji o wysokiej zawartości soli25, aby wyodrębnić DNA.
    1. Wyjmij próbki z zamrażarki. Za pomocą kleszczyków dodaj jeden koralik ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm do każdej probówki z próbką i pozostaw zamrożone próbki na stole w temperaturze pokojowej (RT) do rozmrożenia. Za pomocą młynka perełkowego homogenizować próbki przez 1 minutę przy 15 Hz.
    2. Odwirować próbki za pomocą krótkiego cyklu wirówki. Za pomocą pipet mikrolitrowych dodaj 90 μl (możliwe 100 μl w przypadku użycia pipety powtarzalnej) 10% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 5 μl 10 mg/ml proteinazy K.
    3. Dokładnie zagłuszić próbki i inkubować mieszaniny przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C ze stałym wytrząsaniem przy 400 obr./min na termomieszalniku. Dodatkowo dokładnie wiruj próbki co 10 minut, aby jeszcze bardziej przyspieszyć lizę.
    4. Odwirować próbki za pomocą wirówki w krótkim przebiegu, dodać 350 μl 5 M NaCl za pomocą pipety mikrolitrowej i dokładnie wirować przez około 0,5 - 1 minutę. Odwirować próbki przez 40 minut przy 16 200 x g w temperaturze 5 °C.
      UWAGA: Jeśli konieczne jest wykonanie wielu serii z rzędu, ustawienie temperatury wirówki należy nieznacznie podnieść (nie wyżej niż 10 °C), ponieważ SDS ma tendencję do flokulacji, jeśli temperatura jest zbyt niska.
    5. Za pomocą pipet mikrolitrowych przenieś około 600 μl supernatantu do nowej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby niczego nie usunąć z granulki.
    6. Kulki ze stali nierdzewnej wyjąć z probówek reakcyjnych do sitka do herbaty ze stali nierdzewnej, oczyścić je bieżącą wodą i inkubować na szalce Petriego z roztworem odkażającym przez 10 minut. Dokładnie spłucz roztwór odkażający sterylną wodą i przechowuj oczyszczone kulki w etanolu (>99%, klasa rocznie) lub suchym do ponownego użycia.
      UWAGA: Czyszczenie koralików nie musi być wykonywane bezpośrednio na tym etapie, ale można je wykonać, gdy w kolejnych krokach jest czas oczekiwania.
    7. Dodać 600 μl lodowatego izopropanolu (klasy PA) do supernatantu za pomocą pipety mikrolitrowej i ostrożnie odwrócić probówkę kilka razy. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.
    8. Próbki należy wyjąć z zamrażarki i odwirować je przez 20 minut w temperaturze 16 200 × g, temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ostrożnie osuszyć probówkę niestrzępiącą się bibułą. Należy pamiętać, że jeżeli temperatura otoczenia jest wysoka (powyżej 25 °C), należy odwirować w temperaturze 5 °C, aby uniknąć ślizgania się granulek podczas wyrzucania supernatantu.
    9. Umyj granulki zawierające DNA 70% etanolem. W tym celu należy dodać 200 μl lodowatego etanolu (70% rocznie) za pomocą pipety mikrolitrowej i odwirowywać próbki przez 10 minut przy 16 200 x g i temperaturze pokojowej (lub 5 °C, jeśli to konieczne). Ostrożnie wyrzucić supernatant i ostrożnie osuszyć probówkę niestrzępiącą się bibułą. Użyć pipety o pojemności 10 μl dostosowanej do około 8 μl, aby ostrożnie odpipetować pozostały supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
    10. Suszyć granulki przez około 5-20 minut w temperaturze 60 °C lub w temperaturze pokojowej na stole, aż cały etanol zostanie odparowany.
    11. Rozpuść osad w 50-100 μl wody wolnej od nukleaz (sterylizowanej parą wodną i poddanej działaniu DEPC) (ddH2O), odczekaj co najmniej 1 godzinę (choć lepsze wyniki uzyskamy przez noc w temperaturze 4 °C).
    12. Zmierz ilość DNA zawartego w każdej próbce za pomocą spektrofotometru do mikroobjętości, zgodnie z instrukcjami producenta. Każdą próbkę zawierającą około 2-10 ng DNA/μl należy rozcieńczyć robocze. Roztwór podstawowy należy przechowywać w zamrażarce. Roztwór roboczy należy przechowywać w lodówce i upewnić się, że wkrótce zostanie przeprowadzone dalsze przetwarzanie próbki.

2. Sprawdź funkcjonalność ekstraktów DNA do późniejszego wykrywania niedawno połkniętej zdobyczy.

  1. Aby zapewnić obecność i wydajność funkcjonalną szablonów, przetestuj każdy ekstrakt DNA (kroki od 1.1 do 1.3.11) przy użyciu uniwersalnych zestawów starterów odpowiednich dla danego źródła pożywienia (np. bezkręgowców16,26), które są ukierunkowane na tę samą podjednostkę jądrową, co starter specyficzny dla grupy, używany do późniejszego wykrywania zdobyczy25,27. Poniższe kroki odnoszą się do użycia uniwersalnych zestawów podkładów NSF1419/20 i NSR1642/1616 oraz LSU D1,D2 fw1 i LSU D1,D2 rev2 lub LSU D1,D2 rev426. Aby udowodnić, że reakcja PCR zakończyła się sukcesem i że nie doszło do zanieczyszczenia, należy użyć kontroli pozytywnej zawierającej DNA, które zostało już pomyślnie amplifikowane, oraz jednej próbki kontrolnej zawierającej ddH2O zamiast DNA w każdym przebiegu PCR.
    1. Aby przygotować roztwory robocze startera, które zawierają końcowe stężenie 10 μM startera, należy odpipetować odpowiednią ilość odpowiedniego roztworu podstawowego startera i ddH2O (w zależności od stężenia roztworu podstawowego) do świeżej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipet.
    2. Dodać startery, mieszaninę deoksynukleotydów (dNTP), bufor reakcyjny, polimerazę DNA Taq i ddH2O w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 lub 2,0 ml (w zależności od liczby próbek do przetworzenia), a następnie zawirować tę mieszaninę. Szczegółowe objętości wzorcowej mieszaniny reakcyjnej dla 10 μl reakcji PCR podano w tabeli 1 (szczegółowe informacje na temat zastosowanych substancji chemicznych znajdują się w tabeli materiałów).
    3. Za pomocą pipet mikrolitrowych przenieś każdy 1 μl ekstraktu DNA do 9 μl wzorcowej mieszaniny reakcyjnej w probówce do PCR (lub w studzience płytki PCR). Zamknąć probówkę reakcyjną lub studzienki reakcyjne płytki (z paskami nasadki).
    4. Zaprogramuj termocykler: Standardowy protokół dla zestawu starterów NSF1419/20 i NSR1642/1616 to: 94 °C przez 4 minuty (denaturacja), następnie 30 cykli po 94 °C przez 30 s, 50 °C (temperatura wyżarzania) przez 30 s, 72 °C przez 90 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Dla zestawów starterów LSU 26 użyj następujących elementów: 94 °C przez 4 min, następnie 45 cykli po 94 °C przez 20 s, 52,5 °C przez 20 s, 72 °C przez 90 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 8 min.
    5. Umieść probówki lub płytki PCR w termocyklerze, zamknij pokrywę cyklera i uruchom odpowiedni program.
    6. Przygotuj 1,5% żel agarozowy, używając roztworu buforowego zawierającego zasadę Tris, kwas borowy i EDTA (bufor TBE) oraz agarozę. Do przygotowania 1,5% żelu agarozowego, przy użyciu tacki do odlewania żelu o wymiarach całkowitych 10 cm × 7,5 cm × 3 cm, odważyć 0,45 g agarozy do kolby stożkowej, użyć cylindra miarowego do zmierzenia 30 ml 1x buforu TBE (89 mM Tris, pH 7,6, 89 mM kwasu borowego i 2 mM EDTA, pH 8,0) i wlać do kolby stożkowej. Podgrzej mieszaninę za pomocą kuchenki mikrofalowej. Zatrzymaj kuchenkę mikrofalową, gdy pojawią się duże pęcherzyki powietrza i ostrożnie obracaj kolbą, aż roztwór będzie miał tylko jedną fazę.
    7. Aby schłodzić roztwór do temperatury około 60 °C, zamieszać kolbę w łaźni wodnej. Szybko wlej roztwór do tacki do odlewania żelu, usuń pęcherzyki powietrza i włóż grzebienie. Odczekaj około 20 minut, aż żel stwardnieje.
    8. Napełnij urządzenie do elektroforezy 0,5x TBE i włóż tackę do odlewania żelu zawierającą żel agarozowy. Upewnij się, że szczeliny na żel są wolne od pęcherzyków powietrza.
    9. Odwiruj produkty PCR za pomocą opcji krótkoseryjnej mini wirówki (płytki). Za pomocą pipety mikrolitrowej wymieszaj każde 3 μl produktu PCR z 1 μl 6-krotnie obciążającego barwnika (40% sacharozy i 0,25% błękitu bromofenolowego) i załaduj go do szczelin żelu agarozowego. Odpipetować 1,5 μl drabinki DNA o gęstości 100 pz do jednej szczeliny każdej linii za pomocą pipety mikrolitrowej jako standardowej wielkości. Załóż prawidłowo pokrywę urządzenia do elektroforezy i podłącz przewody do zasilania. Uruchom żel pod napięciem 100 V/cm przez 35 minut.
    10. Aby przygotować kąpiel barwiącą, wlej 1,000 ml 1x TBE do kwadratowego plastikowego pudełka nieprzepuszczalnego dla światła. Dodać 50 μl bromku etydyny za pomocą pipety mikrolitrowej, zamknąć pokrywę plastikowego pudełka i wstrząsnąć nim, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie bromku etydyny.
    11. Usuń żel z urządzenia do elektroforezy i umieść go w kąpieli barwiącej na około 10 minut. Następnie wyjmij żel z kąpieli barwiącej i umieść go w systemie dokumentacji żelu i zwizualizuj zgodnie z instrukcją.
    12. Analizuj tylko próbki, które wykazały pozytywne wyniki (fragmenty o odpowiedniej wielkości wizualne w żelu agarozowym) pod względem obecności i sprawności funkcjonalnej szablonów do późniejszego wykrywania niedawno połkniętej zdobyczy.
Mieszanka PCRRoztwór roboczy o stężeniuMieszanina do 10 μl reakcji PCRKońcowe stężenie w PCR
Podkład FW10 μM0,5 μl0,5 μM
Podkład RW10 μM0,5 μl0,5 μM
Bufor reakcyjny (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4)2SO4 i 2 mM MgCl2 stężenia końcowe)1 μM1 μl1 μM
Protokół dNTP10 mM0,25 μl0,25 mM
Polimeraza Taq5 U0,1 μl0,05 U
ddH206,65 μl
Całkowita ilość mieszaniny reakcyjnej9 μl
DNA1 μl

Tabela 1: Szczegółowy protokół przygotowania wzorcowej mieszaniny reakcyjnej dla reakcji PCR 10 μL.

3. Wykrywaj ostatnio spożyte zdobycze/produkty spożywcze za pomocą zestawów starterów specyficznych dla grupy za pomocą elektroforezy żelowej.

  1. Przeprowadzić PCR przy użyciu roztworu roboczego ekstraktów DNA (przygotowanego zgodnie z etapami od 1.1 do 1.3.11) i specyficznego dla grupy zestawu starterów (nieznakowanego, tj. bez modyfikacji) odpowiedniego dla docelowej grupy ofiar, jak opisano w krokach 2.1.1 do 2.1.3 (różnice w mieszaninie reakcyjnej dla odpowiedniego zestawu starterów, patrz tabela 2). Przeprowadzić PCR przy użyciu standardowego protokołu podanego w kroku 2.1.4 (temperatury wyżarzania dla odpowiedniego zestawu starterów, patrz Tabela 2).
    1. W każdej serii PCR należy stosować jedną kontrolę z czystym DNA z próbki należącej do odpowiedniej grupy docelowej (kontrola dodatnia) i jedną kontrolę ujemną z czystym DNA pochodzącym od gatunku konsumenta.
  2. Sprawdź powodzenie reakcji PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym opisanej w krokach od 2.1.6 do 2.1.11. Reakcja PCR zakończyła się sukcesem, jeśli fragment o odpowiedniej długości (patrz tabela 2) jest widoczny dla kontroli dodatniej, ale nie dla kontroli ujemnej. Jeśli jedno lub oba te kryteria nie są spełnione, powtórz PCR.
  3. Zastosować elektroforezę w żelu agarozowym, jak opisano w krokach od 2.1.6 do 2.1.11, aby wykryć, czy docelowa grupa ofiar została skonsumowana przez różne badane próbki konsumenckie (poprzez ocenę, czy fragment o odpowiedniej długości jest widoczny, czy nie). Upewnij się, że nie przegapisz fragmentów o niskiej rozdzielczości wizualnej.
  4. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli dalsze analizy będą wykonywane w ciągu najbliższych 24 godzin, lub w temperaturze -20 °C, jeśli analizy mają być przeprowadzone później.

4. Następnie określ spożytą zdobycz dalej za pomocą analizy SSCP za pomocą żelu poliakrylamidowego.

  1. Przygotuj 9% żel akrylowy do elektroforezy SSCP. Przygotuj roztwory robocze w okapie laboratoryjnym.
    1. Aby przygotować 200 ml roztworu roboczego akrylamidu, napełnij cylinder miarowy 20 ml 10x TBE (109 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego i 40 ml 0,50 M EDTA, pH 8,0 rozpuszczonego w 1000 ml ddH2O), a drugi 45 ml 40% (29:1) mieszanki akryloamidu. Wlać mieszaninę KZM i akrylamidu do kolby miarowej (odpowiednia jest również szklana butelka z podziałką z oznaczeniem 200 ml) i dodać ddH2O do oznaczenia 200 ml. Roztwór roboczy przechowywać w lodówce (4°C) do czasu, aż będzie potrzebny. Nie stosować roztworu roboczego starszego niż tydzień.
    2. Odważyć 0,1 g nadsiarczanu amonu (APS; użyć wagi o dokładności co najmniej 0,01 g) do kolby miarowej o pojemności 1 ml i rozpuścić ją, dodając ddH2O do kreski podziałki, aby przygotować 10% roztwór podstawowy APS. Przenieść podwielokrotności (około 350 μl) do świeżych probówek reakcyjnych.
      UWAGA: Na każdy żel poliakryloamidowy potrzebna jest jedna porcja. Pozostałe porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać je tylko na krótko przed ich potrzebowaniem.
    3. Zmontuj kasetę żelową składającą się z dwóch szklanych płytek, jednej półfabrykowanej i jednej szklanej płytki z karbem (każda o wymiarach 20 cm x 20 cm), z przekładkami (o grubości 1,5 mm) między nimi biegnącymi po bokach szkła. Użyj każdych trzech składanych klipsów (32 mm) po prawej i lewej stronie, aby zamocować kasetę żelową (Rysunek 1).
    4. Wymieszaj 5 g agarozy i 250 ml 1x buforu TBE w kolbie stożkowej, aby przygotować roztwór na 2% żel agarozowy. Podgrzać, a następnie schłodzić mieszaninę zgodnie z opisem w krokach 2.1.6 i 2.1.7. Szybko przelej roztwór do plastikowego pudełka w kształcie kwadratu (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) i umieść dolny koniec kasety z żelem (krok 4.1.3) w roztworze agarozy. Ustaw składane klipsy na dolnym końcu kasety żelowej na wysokość tak, aby znajdowały się na krawędzi plastikowego pudełka w kształcie kwadratu (Rysunek 1). Odczekaj około 20-30 minut, aż korek agarozowy całkowicie stwardnieje.
    5. Napełnić cylinder miarowy o pojemności 100 ml roztworem roboczym akryloamidu (krok 4.1.1) do kreski 60 ml i wlać roztwór do zlewki. Za pomocą mikropipety dodać 300 μl jednej podwielokrotności roztworu podstawowego APS (etap 4.1.2), a następnie dodać 37,5 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Szybko wlej roztwór między szklane płytki kasety żelowej. Alternatywnie, należy wstrzyknąć roztwór między szklane płytki za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 100 ml z końcówką pipety o pojemności 1 000 μl dostosowaną do głowicy iniekcyjnej strzykawki.
    6. Ostrożnie włóż standardowy grzebień o grubości 1.5 mm na górnym końcu między szklane płytki. Grzebień musi być otoczony roztworem poliakrylamidu. Odczekać około 1 godziny, aż żel poliakryloamidowy zostanie spolimeryzowany. W miarę możliwości należy unikać wentylacji podczas polimeryzacji, ponieważ wydłuża to czas potrzebny do polimeryzacji żelu.
      UWAGA: Żele w odlewie można przechowywać w szczelnie zamkniętych torebkach foliowych z mokrą chusteczką w lodówce do 3 dni.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Rysunek ilustrujący konstrukcję do nalewania żeli poliakrylamidowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Umieść kasetę z żelem, zawierającą przygotowany żel poliakrylamidowy, w pionowym urządzeniu do elektroforezy. Napełnij jednostkę do elektroforezy odpowiednią ilością (w zależności od typu jednostki elektroforezy) 0,5x TBE i schłodzić jednostkę do 10 °C za pomocą cyrkulatora chłodniczego.
  2. W celu denaturacji DNA podgrzej blok termiczny/cykler do temperatury 96 °C. Przygotuj bufor denaturacyjny z 95% formamidu (99,5% rocznie) i 5% roztworu wodnego zawierającego 0,25% błękitu bromofenolowego i 40% (w/v) sacharozy.
  3. Wyjmij produkty PCR z lodówki lub zamrażarki i rozmroź je. Odwiruj produkty PCR za pomocą opcji krótkoseryjnej mini wirówki (płytki). Następnie wymieszaj każde 4 μl produktu PCR z 4 μl buforu denaturacyjnego. Podgrzewać mieszaniny przez 5 minut w temperaturze 96 °C, a następnie schładzać w lodowatej wodzie przez 10 min.
    UWAGA: Próbki należy natychmiast po tym załadować do żelu poliakryloamidowego (krok 4.5).
  4. Usunąć grzebień z żelu poliakryloamidowego (krok 4.1.6) i za pomocą mikropipety całkowicie załadować każdą próbkę do szczeliny żelu. Uruchomić elektroforezę z mocą 8 W na żel, stale schładzając jednostkę do elektroforezy do 10 °C. Wymagany czas pracy zależy od wielkości fragmentu, który ma zostać oddzielony. W przypadku fragmentów o wielkości około 210 pz za odpowiedni uznaje się czas trwania wynoszący około 3,5 godziny.
  5. Aby przygotować kąpiel barwiącą, wlej 1,000 ml 1x TBE do kwadratowego plastikowego pudełka nieprzepuszczalnego dla światła i dodaj 30 μl barwnika barwiącego (odpowiedniego do barwienia jednoniciowego DNA) za pomocą mikrolitrowej pipety. Zamknij pokrywę plastikowego pudełka i potrząśnij nim, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie barwnika barwiącego.
  6. Wyjmij kasetę z żelem z komory elektroforezy i ostrożnie oddziel karbowaną szklaną płytkę od żelu. Wsunąć żel poliakryloamidowy z pustej płytki szklanej do kąpieli barwiącej. Umieść kąpiel barwiącą na platformie do wytrząsania i zaplamij żel na 20 do 30 minut, ciągle wstrząsając.
  7. Ostrożnie wyjmij żel z kąpieli barwiącej i umieść go na stole UV systemu dokumentacji.
    UWAGA: Ze względu na niestabilność żelu zaleca się wykonanie poprzedniego kroku w dwie osoby. Jedna osoba powinna trzymać kąpiel barwiącą obok stołu UV, a druga powinna sięgnąć obiema rękami pod żel, wyjąć go i wsunąć na stół UV.
  8. Zamknij pokrywę lub drzwi systemu dokumentacji i zrób zdjęcie zgodnie z instrukcją obsługi producenta.

5. Wykrywaj wiele ostatnio połkniętych grup ofiar równolegle, korzystając z automatycznych analiz fragmentów.

  1. Przeanalizować ekstrakty DNA z zawartością jelit przy użyciu 16 specyficznych dla grupy zestawów starterów podanych w Tabeli 2, z jednym starterem zestawu znakowanym ze względu na modyfikację barwnikiem barwiącym (patrz Tabela 2 kolumna zatytułowana Modyfikacja) i zastosować równoległe metody wykrywania automatycznego sekwenatora.
    1. Użyć roztworu roboczego ekstraktów DNA (przygotowanego zgodnie z etapami od 1.1 do 1.3.11) i przeprowadzić oddzielne PCR dla każdego zestawu starterów, jak opisano w krokach 2.1.1 do 2.1.5 (różnice w mieszaninie podano w tabeli 2). W każdej serii PCR należy zastosować co najmniej jedną kontrolę z czystym DNA z próbki należącej do odpowiedniej grupy docelowej (kontrola dodatnia) i jedną kontrolę ujemną z czystym DNA pochodzącym od gatunku konsumenckiego.
    2. Przeprowadzić PCR w termocyklerze przy użyciu standardowego protokołu PCR podanego w kroku 2.1.4, dostosowanego do odpowiedniej temperatury wyżarzania (i liczby cykli) dla każdego zestawu starterów podanego w tabeli 2.
      UWAGA: Użyj tego samego przydziału DNA dołków reakcyjnych do PCR z każdym z 16 różnych zestawów starterów, aby uprościć późniejsze łączenie produktów PCR do partiowych automatycznych analiz fragmentów.
    3. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu zakończenia wszystkich testów PCR należących do jednej partii do zautomatyzowanych analiz fragmentów (zob. tabela 2). Produkty PCR należy przechowywać w ciemności i nie przechowywać ich dłużej niż 1 tydzień przed analizą fragmentów.

figure-protocol-2
Tabela 2: Szczegóły dotyczące 2 partii 15 par starterów specyficznych dla grupy, ustalonych przez Koestera i wsp. (2013) i nowo zaprojektowany starter Jae28S paruje amplifikacje regionów 18S lub 28S rDNA z 16 grup docelowych makrobezkręgowców wodnych. f, startery do przodu; r, startery odwrotne; 18S, starter jest ukierunkowany na podjednostkę 18S rDNA; 28S, starter celuje w podjednostkę 28S rDNA. "Hydrobiologia, Czy Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) jest 'zabójczą krewetką' w systemie rzeki Ren?, 768, 2016, Tabela S1, Materiał uzupełniający strona 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, ( © Springer International Publishing Switzerland 2015)" Za zgodą Springera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

  1. W celu wykrycia amplifikowanych fragmentów wszystkich 16 zestawów starterów należy przeprowadzić zautomatyzowane analizy fragmentów w 2 partiach podanych w tabeli 2. Użyj wewnętrznego wzorca rozmiaru (zestaw do wzorca rozmiaru DNA - odpowiednio 400 [partia B] i - 600 [partia A]), aby określić długość fragmentu. Przygotuj płytkę sekwencjonującą i automatyczny sekwencer zgodnie z opisem w poniższych krokach. Należy pamiętać, że ta procedura może wymagać dostosowania w przypadku korzystania z innej platformy niż podana w tabeli materiałów.
    1. Aby uruchomić każdą próbkę wsadową, należy przygotować mieszaninę zawierającą roztwór do ładowania próbki (SLS) i odpowiedni wzorzec wielkości. Pipeta 21,6 μl SLS i 0,4 μl zestawu DNA Size Standard Kit - 600 na próbkę z partii A oraz odpowiednio 21,7 μl SLS i 0,3 μl z zestawu DNA Size Standard Kit - 400 na próbkę z partii B.
    2. Wyjąć z zamrażarki produkty PCR z 8 PCR należących do odpowiedniej partii i rozmrozić je. Upewnij się, że są nadal trzymane w ciemności.
    3. Za pomocą pipety mikrolitrowej naładować liczbę dołków potrzebnej płytki sekwencjonującej (liczbę próbek do analizy) na każde 22 μl odpowiedniej mieszaniny opisanej w kroku 5.2.1. Odkręć produkty PCR z każdego z 8 PCR, korzystając z opcji krótkiego cyklu mini wirówki (płytki). Przenieść każdy 1 μl na produkt PCR z każdego z 8 PCR do odpowiednich dołków płytki sekwencyjnej za pomocą pipety mikrolitrowej.
    4. Ostrożnie odwirować tę mieszaninę na płytce sekwencyjnej za pomocą krótkiego przebiegu wirówki na mini płytce i pokryć każdą z użytych studzienek jedną kroplą oleju mineralnego. Napełnić odpowiednie studzienki reakcyjne płytki buforowej 250-300 μl buforu do separacji DNA.
    5. Użyj oprogramowania do sekwencera kapilarnego, aby utworzyć konfigurację próbki zgodnie z instrukcjami producenta. Przypisać metody do kontroli zestawów próbek i określić kolejność metod, które mają być użyte do przetwarzania danych (zob. tabela 3 w celu zapoznania się z warunkami pracy odpowiednimi do stosowania z normą wielkości podaną w tabeli materiałów). Należy zauważyć, że kluczowe znaczenie ma to, aby przydział próbek w konfiguracji próbki odpowiadał przydziałowi próbek na płytce sekwencjonowania (w tym kontrole dodatnie i ujemne, zob. krok 5.1.1) oraz aby wybrano metodę odpowiednią dla analiz fragmentów z odpowiednim wzorcem wielkości.
    6. Napełnij tackę zwilżającą wodą dejonizowaną i włóż płytkę sekwencjonującą, płytkę buforową i tackę zwilżającą do sekwencera kapilarnego. Włożyć wkład z żelem zawierający wystarczającą ilość świeżego żelu do separacji DNA, która jest potrzebna do pobrania próbki. Uruchom płytkę sekwencjonowania, korzystając z przygotowanej konfiguracji próbki.
DenaturacjaOddzielnyKapilarnejWstrzyknąć
temperaturaGodzinanapięcieGodzinanapięcieGodzina
Rozmiar standard 60090 °C120 sekund4,8 kVCzas trwania: 60 min50 °C Poczekaj na temperaturę: TAK2,0 kV30 sekund
Rozmiar Standardowy 40090 °C120 sekund6 kVCzas trwania: 45 min50 °C Poczekaj na temperaturę: TAK2,0 kV30 sekund

Tabela 3: Szczegółowe warunki analizy fragmentów na automatycznym sekwenserze przy użyciu standardów wielkości podanych w Tabeli Materiałów.

  1. Aby przeanalizować wyniki, wyeksportuj nieprzetworzone dane i prześlij je do programu do analizy fragmentów. Wybierz standardowe zamówienia kolorów barwników odpowiedniego producenta, aby ustawić kanały kolorów barwnika.
    1. Utwórz panel przedstawiający oczekiwany zakres długości fragmentów wzmocnionych przez pojedyncze zestawy starterów specyficzne dla grupy w partii, zgodnie z instrukcją obsługi programu.
    2. Aby przetworzyć dane, wybierz odpowiedni Panel, odpowiedni standard rozmiaru, standardowy kolor oraz typ analizy i procedury uruchamiania. Wybierz opcję elektroferogramu, aby wyświetlić intensywność sygnału fluorescencyjnego z przyrządów do elektroforezy kapilarnej jako pojedynczy ślad liniowy dla każdego koloru barwnika. Zostaną wyświetlone zestawy markerów/starterów wskazujące odpowiedni zakres fragmentów, a dokładna długość wykrytego fragmentu powiązanego ze środkiem każdego wywołanego piku zostanie automatycznie podświetlona (w większości programów przez zabarwienie lub przypisaną nazwę).
    3. Dla każdej próbki oblicz, jak bardzo wewnętrzny wzorzec rozmiaru próbki jest zgodny z wybranym wzorcem rozmiaru, aby zapewnić powodzenie wywołania rozmiaru. Większość programów do analizy fragmentów ma opcję automatycznego obliczania i wizualizacji tego dopasowania. Jeśli wywołanie rozmiaru nie powiodło się, powtórz analizy fragmentów dla tych próbek.
    4. Ponownie sprawdź wzrokowo elektroferogram każdej próbki i potwierdź/odtwierdź każdy pik wywołany dla każdego zestawu markerów/starterów osobno. Ręcznie wstaw niewywołane szczyty, które spełniają kryteria zestawu markerów/podkładów lub usuń błędne zgodnie z instrukcją obsługi używanego programu. Zastosuj rozmiar pary podstawowej lub nazwę pojemnika w polu "Etykieta allelu". Obliczyć i wyświetlić specyfikacje pików w "Tabeli pików".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z powodzeniem wykorzystaliśmy kroki opisane w tym protokole do analiz diety w ramach różnych badań. W tej sekcji przedstawiamy przykłady opisujące możliwość zastosowania różnych sekcji protokołu.

Na przykład, aby zademonstrować skuteczność zestawów starterów specyficznych dla grupy, ustalonych przez autorów28 oraz potencjał dalszych analiz produktów PCR za pomocą analiz SSCP, przeprowadzono eksperyment ży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy łatwą i opłacalną metodę określania interakcji drapieżnik-ofiara na podstawie PCR na podstawie próbek terenowych za pomocą starterów specyficznych dla grupy dla regionów rDNA, które można łączyć z innymi niemolekularnymi analizami tych samych próbek. W protokole istnieje jednak kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, niezbędne jest zapewnienie specyfiki stosowanych podkładów. Po drugie, kluczowe jest uniknięcie zanieczyszczenia i utraty materiału jelitowego podczas przygotowania przewodu pokarm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Silke Classen z Instytutu Badawczego Analizy i Oceny Ekosystemów (gaiac), RWTH Aachen za pomoc w ustanowieniu specyficznych dla grupy zestawów starterów używanych w tym protokole. Dziękujemy również Peterowi Martinowi i Laurze Schynawa z Uniwersytetu w Kilonii za współpracę przy eksperymentach z roztoczami wodnymi. Dziękujemy również asystentom laboratoriów technicznych za dbanie o sprawne działanie laboratorium oraz przygotowanie rejestru firm i numerów katalogowych. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; projekt GE 2219/3-1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ciekły azotDowolnanie b.n.k. Do transportu próbek terenowych makrobezkręgowców do laboratorium.
Probówki reakcyjne 1,5 ml - SafelockAnyNAW przypadku pobierania próbek konsumenckich w terenie i późniejszej konserwacji w ciekłym azocie probówki reakcyjne z ciekłym azotem niekoniecznie muszą być czyste metodą PCR. Aby uniknąć wybuchu rurek, wieczko probówek należy przekłuć igłą.
Mikroskop stereoskopowyDowolnyNAUpewnij się, że powiększenie jest odpowiednie do przygotowania przewodu pokarmowego o wielkości interesującego konsumenta.
Szalki PetriegoDowolnaNADo preparowania przewodu pokarmowego próbek konsumenckich pod stereomikroskopem.
Ogniska ze stali nierdzewnej: Kleszcze Dumont nr 7BioformB40dTe zakrzywione kleszczyki ze stali nierdzewnej mogą czasami być bardzo elastyczne, aby utrzymać próbkę zamocowaną między zakrzywioną częścią bez nakłuwania przewodu pokarmowego.
Ogniska ze stali nierdzewnej: Kleszcze Dumont Electronic No. 5BioformB40bTe drobne kleszczyki ze stali nierdzewnej idealnie nadają się do przygotowania przewodu pokarmowego próbek konsumenckich.
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409,1000RFRoztwór do dekontaminacji do usuwania zanieczyszczeń DNA i RNA
Ręcznik papierowy bez kłaczkówDowolnalaboratoryjna NA
DowolnaprecyzjaNAmusi wynosić co najmniej 0,01 g.
Pipety mikrolitrowe (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)DowolneNA
Safe-Lock 2,0 mlVWR211-2165Bardzo ważne jest, aby te probówki trakcyjne były wolne od inhibitorów DNA, DNazy, RNazy i PCR (PCR clean)!
Probówki Safe-Lock 1,5 mlVWR211-2164Bardzo ważne jest, aby te probówki trakcyjne były wolne od inhibitorów DNA, DNazy, RNazy i PCR (PCR clean)!
Chlorek sodu ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISOcarlroth3957.3Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i 5M roztworu NaCl wymaganego do ekstrakcji DNA.
Tris(hydroksymetylo)-aminometan Triscarlroth4855.2Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i buforu TBE Pipety
mikrolitrowe (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)carlroth8043.1Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i buforu TBE Kwas
borowy ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISOcarlroth6943.2Do bufora TBE. Nie jest wymagane, jeżeli uzyskuje się dostępny na rynku bufor TBE.
Dodecylosiarczan sodu (SDS)carlroth4360.1Do ekstrakcji
liofilu proteinazy K.carlroth7528.1Przygotować roztwór roboczy zawierający 10 mg/ml.
TissueLyser IIQuiagen85300Młyn perełkowy do homogenizacji próbek.
Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mmQuiagen69989Do homogenizacji próbek.
Ogrzewanie WytrząsarkaDowolnaNA
Mieszalnik wirowyDowolnaNA
Wirówka z chłodzeniem: himac CT 15 REHitachiNAWirówka z chłodzeniem używana do wirowania podczas ekstrakcji DNA (Protokół 1).
Izopropanolcarlroth6752.5
Etanol 99,8 %, rocznieDowolnawoda NA
Biologia molekularna klasy (ddH2O)AppliChemA7398,1000wolna od nukleaz (sterylizowana strumieniowo i traktowana DEPC) woda używana do ponownego zawieszania DNA i zawsze, gdy jest mowa o ddH2O w manuskrypcie
Niemodyfikowane OlegonukleotydyEurofins MWG OperonNAStartery nieoznakowane
Zmodyfikowane olegonukleotydyMetabion International AGNAPodkłady z oznaczeniem
peqGOLD Taq all inclusiveVWR Peqlab01-1000Taq all inclusive do mieszanin reakcyjnych PCR (bufor reakcyjny Y i S, dNTPs i MgCl2)
Zaawansowany termocykler gradientowy Primus 96 lub peqStar96x Uniwersalny gradientPeqlabNAZestawy podkładów zostały pierwotnie opracowane na zaawansowanym termocyklerze gradientowym Primus 96. Ponieważ ten cykler był dość stary, sprawdziliśmy, czy nasze zestawy starterów są wydajne i specyficzne w tych samych warunkach, używając peqSta96x (który również mógł symulować starszy model). Testy wykazały jednak, że nasze startery działają dobrze i nadal są specyficzne (patrz Koester i in. 2013) bez korzystania z symulacji starej maszyny.
Standardowe 96-dołkowe płytki do PCRVWR Peqlab732-2879Używane do reakcji PCR.
Niskoprofilowe paski do tub 0,15 ml z płaskimi paskamiVWR Peqlab732-3223Paski do zamykania płytek PCR.
AgarozaPeqlab35-1020Służy do elektroforezy żelowej.
Kuchenka mikrofalowaDowolnaNA
Kolba stożkowaDowolnaNA
Cylinder miarowyDowolnaNA
Pozioma jednostka elektroforezy i odpowiednie grzebienie z zębamiDowolnaNADo elektroforezy w żelu agarozowym.
Zasilacz do elektroforezy PS3002Life TechnologiesNA
Roztwór bromku etydyny 1 %carlroth2218.1Służy do przygotowania kąpieli barwiącej do żeli agarozowych.
Formamidcarlroth6749.1Wymagany do bufora denaturacyjnego do analiz SSCP.
Błękit bromfenolowyAppliChemA3640.0010Potrzebny do ładowania barwnika do elektroforezy w żelu agarozowym.
Sacharozacarlroth4621.1Potrzebna do ładowania barwnika do elektroforezy w żelu agarozowym.
100 bp-DNA-Ladder extendedcarlrothT835.1Jako standard rozmiaru do elektroforezy w żelu agarozowym.
System dokumentacji UVDowolnaNADo wizualizacji wyników elektroforezy żelowej.
Rotiphorese NF-Akrylamid/Bis-roztwór 40 % (29:1)carlrothA121.1Do sporządzania żeli poliakryloamidowych.
Peroksydisiarczan amonucarlroth9592.2Do sporządzania żeli poliakryloamidowych.
Składane klipsy (32 mm)DowolnaNIE DOTYCZYDo przygotowania żeli poliakrylomidowych.
plastikowe pudełko w kształcie kwadratu (21 &x; 6,5 &x; 5 cm)DowolnaNA Doprzygotowania żeli poliakrylomidowych.
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)karłówka23.67.1Do sporządzania żeli poliakryloamidowych.
ZlewkaDowolnaNA
RC 10 Cyfrowy agregat chłodniczyVWR462-0138Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.
Pionowe urządzenie do elektroforezy P10DS (OWL Separation Systems)VWR700-2361Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.
Płyta szklana z karbemVWR730-0261Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.
Czysta płyta szklanaVWR730-0260Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.
Podkładki dystansoweVWR730-0262Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.
Grzebień z 25 zębamiVWR730-0294Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.
Platforma wytrząsającaDowolnaNADo ciągłego potrząsania wanną barwiącą.
Barwienie kwasami nukleinowymi GelStar (Lonza Rockland, Inc.)Biozym850535 (50535)Do barwienia żeli poliakrylamidowych.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bpAB Sciex608098Do automatycznych analiz fragmentów. Norma rozmiaru dla partii B.
Zestaw GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bpAB Sciex608095Do automatycznych analiz fragmentów. Norma wielkości dla partii A.
Sample Loading Solution (SLS)AB Sciex608082Do zautomatyzowanych analiz fragmentów.
Płytka sekwencyjna - 96-dołkowa mikropłytka polipropylenowa do PCRCostar6551Do automatycznej analizy fragmentów.
Wirówka płytkowa, PerfectSpin PVWR PeqlabNAmini wirówka płytkowa służąca do odkręcania produktów PCR.
Płyta buforowa - 96 Well EIA/RIA Przezroczysty polistyren płaski bez obróbki MikropłytkaCorning9017Do automatycznych analiz fragmentów.
GenomeLab Seperation BufferAB Sciex608012Do automatycznych analiz fragmentów.
Żel separacyjny - LPAIAB Sciex608010Do automatycznej analizy fragmentów.
Sequenzer - System Analizy Genetycznej CEQ8000Beckman CoulterNADo zautomatyzowanych analiz fragmentów.
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNADo analizy wyników automatycznych analiz fragmentów.
waga probówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
  2. Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
  3. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
  4. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
  5. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
  6. Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
  7. Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
  8. Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
  9. Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
  10. Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
  11. Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
  12. Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
  13. Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
  14. Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
  15. Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
  16. Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
  17. Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
  18. Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
  19. Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
  20. Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
  21. Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
  22. Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
  23. Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
  24. Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
  25. Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
  26. Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6(2007).
  27. Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
  28. Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
  29. Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
  30. Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831(2007).
  31. Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501(2014).
  32. Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
  33. Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12(2008).
  34. Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza zawarto ci jelitstartery specyficzne dla grupekstrakcja DNAamplifikacja PCRanaliza SSCPzautomatyzowana analiza fragment wekologia troficznainterakcje w sieciach pokarmowychspecyficzno starter w

Powiązane artykuły