Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza sieci pokarmowych jest niezbędna do lepszego zrozumienia ekosystemów. Na przykład interakcje w sieci troficznej mogą ulegać poważnym zmianom spowodowanym inwazją gatunków obcych. Jednak dokładna identyfikacja interakcji drapieżnik-ofiara w terenie jest w wielu przypadkach trudna. Analizy te często opierają się na wizualnej ocenie zawartości jelit lub analizie proporcji izotopów stabilnych (δ15N i δ13C). Takie metody wymagają wszechstronnej wiedzy na temat, odpowiednio, różnorodności morfologicznej lub sygnatury izotopowej poszczególnych organizmów drapieżnych, co prowadzi do przeszkód w dokładnej identyfikacji organizmów drapieżnych. Wizualne analizy zawartości jelit szczególnie zaniżają znaczenie miękkich organizmów drapieżnych, ponieważ maceracja, spożycie i trawienie organizmów drapieżnych utrudnia identyfikację konkretnych gatunków. W związku z tym strategie oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), na przykład stosowanie zestawów starterów specyficznych dla danej grupy, stanowią potężne narzędzie do badania interakcji w sieci pokarmowej. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły badania zawartości jelit konsumentów makrobezkręgowców w terenie przy użyciu specyficznych dla grupy zestawów starterów dla jądrowego kwasu rybosynukleinowego (rDNA). DNA można ekstrahować albo z całych próbek (w przypadku małych taksonów), albo z treści jelitowej próbek zebranych w terenie. Obecność i sprawność funkcjonalną matryc DNA należy potwierdzić bezpośrednio od badanej osoby za pomocą uniwersalnych zestawów starterów ukierunkowanych na odpowiednią podjednostkę DNA. Wykazaliśmy również, że spożytą zdobycz można określić dalej aż do poziomu gatunku za pomocą PCR z niezmodyfikowanymi starterami specyficznymi dla grupy w połączeniu z późniejszymi analizami polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP) przy użyciu żeli poliakrylamidowych. Ponadto wykazaliśmy, że zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych jako znaczników umożliwia równoległe badania przesiewowe fragmentów DNA różnych grup ofiar z wielu próbek zawartości jelit za pomocą automatycznej analizy fragmentów.
Wprowadzenie
Interakcje drapieżnik-ofiara, które stanowią większość interakcji troficznych i dynamiki sieci pokarmowej, są kluczowymi aspektami do scharakteryzowania przepływów materii i energii w sieciach pokarmowych wewnątrz i pomiędzy ekosystemami, co jest jednym z głównych celów ekologii1. Określenie źródła i przepływu węgla i składników odżywczych pogłębia wiedzę na temat ekologicznych połączeń między ekosystemami2. Jednak ekosystemy, takie jak rzeki i ich zlewnie, są połączone nie tylko przez przepływy materii organicznej i składników odżywczych, ale także przez ruchy organizmów3. Tak więc zmiany siedlis....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie makrobezkręgowców z terenu i przygotowanie próbek do genetycznej analizy zawartości przewodu pokarmowego.
- Zbierz makrobezkręgowce z każdego stanowiska, posegreguj osobniki wybranych gatunków konsumentów do pojedynczych probówek i zamroź je bezpośrednio w ciekłym azocie lub suchym lodzie, aby zapobiec opróżnianiu jelit oraz degradacji DNA.
UWAGA: Należy unikać przechowywania próbek w alkoholu, ponieważ niektóre makrobezkręgowce mają tendencję do wymiotowania przed śmiercią wywołaną działaniem alkoholu. - Do genetycznych analiz zawartości jelit używaj wyłącznie przewodu pokarmowego średnich i dużych (około >3 mm) gatunków m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z powodzeniem zastosowaliśmy kroki opisane w niniejszym protokole do analizy diety w ramach różnych badań. W tej sekcji przedstawiamy przykłady opisujące zastosowanie poszczególnych części protokołu.
Przykładowo, aby zademonstrować skuteczność zestawów starterów specyficznych dla grup, opracowanych przez autorów28 oraz potencjału do dalszych analiz produktów PCR metodą SSCP, przeprowadzono eksperyment żyw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy łatwą i opłacalną metodę określania interakcji drapieżnik-ofiara na podstawie PCR na podstawie próbek terenowych za pomocą starterów specyficznych dla grupy dla regionów rDNA, które można łączyć z innymi niemolekularnymi analizami tych samych próbek. W protokole istnieje jednak kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, niezbędne jest zapewnienie specyfiki stosowanych podkładów. Po drugie, kluczowe jest uniknięcie zanieczyszczenia i utraty materiału jelitowego podczas przygotowania przewodu pokarm.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Silke Classen z Instytutu Badawczego Analizy i Oceny Ekosystemów (gaiac), RWTH Aachen za pomoc w ustanowieniu specyficznych dla grupy zestawów starterów używanych w tym protokole. Dziękujemy również Peterowi Martinowi i Laurze Schynawa z Uniwersytetu w Kilonii za współpracę przy eksperymentach z roztoczami wodnymi. Dziękujemy również asystentom laboratoriów technicznych za dbanie o sprawne działanie laboratorium oraz przygotowanie rejestru firm i numerów katalogowych. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; projekt GE 2219/3-1).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ciekły azot | Dowolna | nie b.n.k | . Do transportu próbek terenowych makrobezkręgowców do laboratorium. |
| Probówki reakcyjne 1,5 ml - Safelock | Any | NA | W przypadku pobierania próbek konsumenckich w terenie i późniejszej konserwacji w ciekłym azocie probówki reakcyjne z ciekłym azotem niekoniecznie muszą być czyste metodą PCR. Aby uniknąć wybuchu rurek, wieczko probówek należy przekłuć igłą. |
| Mikroskop stereoskopowy | Dowolny | NA | Upewnij się, że powiększenie jest odpowiednie do przygotowania przewodu pokarmowego o wielkości interesującego konsumenta. |
| Szalki Petriego | Dowolna | NA | Do preparowania przewodu pokarmowego próbek konsumenckich pod stereomikroskopem. |
| Ogniska ze stali nierdzewnej: Kleszcze Dumont nr 7 | Bioform | B40d | Te zakrzywione kleszczyki ze stali nierdzewnej mogą czasami być bardzo elastyczne, aby utrzymać próbkę zamocowaną między zakrzywioną częścią bez nakłuwania przewodu pokarmowego. |
| Ogniska ze stali nierdzewnej: Kleszcze Dumont Electronic No. 5 | Bioform | B40b | Te drobne kleszczyki ze stali nierdzewnej idealnie nadają się do przygotowania przewodu pokarmowego próbek konsumenckich. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Roztwór do dekontaminacji do usuwania zanieczyszczeń DNA i RNA |
| Ręcznik papierowy bez kłaczków | Dowolna | laboratoryjna NA | |
| Dowolna | precyzja | NA | musi wynosić co najmniej 0,01 g. |
| Pipety mikrolitrowe (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L) | Dowolne | NA | |
| Safe-Lock 2,0 ml | VWR | 211-2165 | Bardzo ważne jest, aby te probówki trakcyjne były wolne od inhibitorów DNA, DNazy, RNazy i PCR (PCR clean)! |
| Probówki Safe-Lock 1,5 ml | VWR | 211-2164 | Bardzo ważne jest, aby te probówki trakcyjne były wolne od inhibitorów DNA, DNazy, RNazy i PCR (PCR clean)! |
| Chlorek sodu ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i 5M roztworu NaCl wymaganego do ekstrakcji DNA. |
| Tris(hydroksymetylo)-aminometan Tris | carlroth | 4855.2 | Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i buforu TBE Pipety |
| mikrolitrowe (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L) | carlroth | 8043.1 | Do buforu do ekstrakcji soli (SEB) i buforu TBE Kwas |
| borowy ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | Do bufora TBE. Nie jest wymagane, jeżeli uzyskuje się dostępny na rynku bufor TBE. |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | carlroth | 4360.1 | Do ekstrakcji |
| liofilu proteinazy K. | carlroth | 7528.1 | Przygotować roztwór roboczy zawierający 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Młyn perełkowy do homogenizacji próbek. |
| Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mm | Quiagen | 69989 | Do homogenizacji próbek. |
| Ogrzewanie Wytrząsarka | Dowolna | NA | |
| Mieszalnik wirowy | Dowolna | NA | |
| Wirówka z chłodzeniem: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Wirówka z chłodzeniem używana do wirowania podczas ekstrakcji DNA (Protokół 1). |
| Izopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Etanol 99,8 %, rocznie | Dowolna | woda NA | |
| Biologia molekularna klasy (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | wolna od nukleaz (sterylizowana strumieniowo i traktowana DEPC) woda używana do ponownego zawieszania DNA i zawsze, gdy jest mowa o ddH2O w manuskrypcie |
| Niemodyfikowane Olegonukleotydy | Eurofins MWG Operon | NA | Startery nieoznakowane |
| Zmodyfikowane olegonukleotydy | Metabion International AG | NA | Podkłady z oznaczeniem |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive do mieszanin reakcyjnych PCR (bufor reakcyjny Y i S, dNTPs i MgCl2) |
| Zaawansowany termocykler gradientowy Primus 96 lub peqStar96x Uniwersalny gradient | Peqlab | NA | Zestawy podkładów zostały pierwotnie opracowane na zaawansowanym termocyklerze gradientowym Primus 96. Ponieważ ten cykler był dość stary, sprawdziliśmy, czy nasze zestawy starterów są wydajne i specyficzne w tych samych warunkach, używając peqSta96x (który również mógł symulować starszy model). Testy wykazały jednak, że nasze startery działają dobrze i nadal są specyficzne (patrz Koester i in. 2013) bez korzystania z symulacji starej maszyny. |
| Standardowe 96-dołkowe płytki do PCR | VWR Peqlab | 732-2879 | Używane do reakcji PCR. |
| Niskoprofilowe paski do tub 0,15 ml z płaskimi paskami | VWR Peqlab | 732-3223 | Paski do zamykania płytek PCR. |
| Agaroza | Peqlab | 35-1020 | Służy do elektroforezy żelowej. |
| Kuchenka mikrofalowa | Dowolna | NA | |
| Kolba stożkowa | Dowolna | NA | |
| Cylinder miarowy | Dowolna | NA | |
| Pozioma jednostka elektroforezy i odpowiednie grzebienie z zębami | Dowolna | NA | Do elektroforezy w żelu agarozowym. |
| Zasilacz do elektroforezy PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Roztwór bromku etydyny 1 % | carlroth | 2218.1 | Służy do przygotowania kąpieli barwiącej do żeli agarozowych. |
| Formamid | carlroth | 6749.1 | Wymagany do bufora denaturacyjnego do analiz SSCP. |
| Błękit bromfenolowy | AppliChem | A3640.0010 | Potrzebny do ładowania barwnika do elektroforezy w żelu agarozowym. |
| Sacharoza | carlroth | 4621.1 | Potrzebna do ładowania barwnika do elektroforezy w żelu agarozowym. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | Jako standard rozmiaru do elektroforezy w żelu agarozowym. |
| System dokumentacji UV | Dowolna | NA | Do wizualizacji wyników elektroforezy żelowej. |
| Rotiphorese NF-Akrylamid/Bis-roztwór 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | Do sporządzania żeli poliakryloamidowych. |
| Peroksydisiarczan amonu | carlroth | 9592.2 | Do sporządzania żeli poliakryloamidowych. |
| Składane klipsy (32 mm) | Dowolna | NIE DOTYCZY | Do przygotowania żeli poliakrylomidowych. |
| plastikowe pudełko w kształcie kwadratu (21 &x; 6,5 &x; 5 cm) | Dowolna | NA Do | przygotowania żeli poliakrylomidowych. |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | karłówka | 23.67.1 | Do sporządzania żeli poliakryloamidowych. |
| Zlewka | Dowolna | NA | |
| RC 10 Cyfrowy agregat chłodniczy | VWR | 462-0138 | Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. |
| Pionowe urządzenie do elektroforezy P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. |
| Płyta szklana z karbem | VWR | 730-0261 | Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. |
| Czysta płyta szklana | VWR | 730-0260 | Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. |
| Podkładki dystansowe | VWR | 730-0262 | Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. |
| Grzebień z 25 zębami | VWR | 730-0294 | Do analiz SSCP z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. |
| Platforma wytrząsająca | Dowolna | NA | Do ciągłego potrząsania wanną barwiącą. |
| Barwienie kwasami nukleinowymi GelStar (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | Do barwienia żeli poliakrylamidowych. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | Do automatycznych analiz fragmentów. Norma rozmiaru dla partii B. |
| Zestaw GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | Do automatycznych analiz fragmentów. Norma wielkości dla partii A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | Do zautomatyzowanych analiz fragmentów. |
| Płytka sekwencyjna - 96-dołkowa mikropłytka polipropylenowa do PCR | Costar | 6551 | Do automatycznej analizy fragmentów. |
| Wirówka płytkowa, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini wirówka płytkowa służąca do odkręcania produktów PCR. |
| Płyta buforowa - 96 Well EIA/RIA Przezroczysty polistyren płaski bez obróbki Mikropłytka | Corning | 9017 | Do automatycznych analiz fragmentów. |
| GenomeLab Seperation Buffer | AB Sciex | 608012 | Do automatycznych analiz fragmentów. |
| Żel separacyjny - LPAI | AB Sciex | 608010 | Do automatycznej analizy fragmentów. |
| Sequenzer - System Analizy Genetycznej CEQ8000 | Beckman Coulter | NA | Do zautomatyzowanych analiz fragmentów. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | Do analizy wyników automatycznych analiz fragmentów. |
Bibliografia
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
