Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Streszczenie

Możliwość mierzenia uwalniania neuroprzekaźników w szybkiej skali czasowej pozwala na powiązanie wzorców neurotransmisji z określonymi zachowaniami lub manipulacjami; potężne narzędzie do wyjaśniania podstawowych mechanizmów i obwodów. Podczas gdy technika mikrodializy jest stosowana od dziesięcioleci do pomiaru prawie każdego analitu będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu, technika ta jest ograniczona pod względem rozdzielczości czasowej. Alternatywnie, woltamperometria cykliczna szybkiego skanowania jest zarówno czasowo precyzyjna, jak i niezwykle czuła; Ponieważ jednak ta trudna technicznie metoda opiera się na elektroaktywności badanego analitu, możliwość wykrycia substancji nieelektroaktywnych (np. neuroprzekaźnika glutaminianu) jest wyeliminowana. W tym artykule szczegółowo opisano zastosowanie systemu "pod klucz", który łączy amperometrię o stałym potencjale i biodetekcję enzymatyczną w celu pomiaru zarówno elektroaktywnych, jak i nieelektroaktywnych neuroprzekaźników z precyzją czasową. Połączenie tych dwóch potężnych technik pozwala na stosunkowo łatwy pomiar zarówno tonicznej, jak i fazowej neurotransmisji oraz pozwala na jednoczesne rejestrowanie wielu neuroprzekaźników. Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie procesu pomiaru neurotransmisji dopaminy i glutaminianu in vivo przy użyciu naturalnie nagradzającego zachowania (tj. zachowania seksualnego) u samic chomików, z ostatecznym celem wykazania technicznej wykonalności tego testu do badania innych zachowań i paradygmatów eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Możliwość pomiaru uwalniania neuroprzekaźników u zwierząt zachowujących się w stanie czuwania pozwala badaczom na powiązanie określonych zachowań z przestrzennymi i czasowymi wzorcami neurotransmisji - potężne narzędzie do badania mechanizmów i obwodów leżących u podstaw zarówno naturalnych, jak i funkcyjnych zachowań w czasie rzeczywistym. Historycznie rzecz biorąc, mikrodializa była stosowana do pomiaru zarówno substancji reaktywnych, jak i niereaktywnych w środowisku zewnątrzkomórkowym mózgu¹. Technika ta wykorzystuje ciągły przepływ wodnego roztworu o podobnym składzie jonowym do płynu zewnątrzkomórkowego, przez sondę mikrodializacyjną składającą się z małego trzonka z końcówką wykonaną z półprzepuszczalnej membrany z pustych włókien ². Po wprowadzeniu sondy, neuroprzekaźniki lub inne interesujące nas anality mogą przenikać przez półprzepuszczalną błonę przez pasywną dyfuzję, a następnie być zbierane w odstępach czasu w celu późniejszej analizy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), techniki chemii analitycznej powszechnie stosowanej do oddzielania, identyfikacji i ilościowego oznaczania składników w niejednorodnej mieszaninie³.

Chociaż mikrodializa jest czułą techniką, która może być użyta do pomiaru praktycznie każdego interesującego analitu, rozdzielczość czasowa jest niska, z maksymalnymi częstotliwościami próbkowania rzędu minut do dziesiątek minut^1,2. Wynalezienie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV), techniki, która opiera się na potencjale redoks form elektroaktywnych, może wyjaśnić niemal chwilowe stężenia analitu będącego przedmiotem zainteresowania w płynie zewnątrzkomórkowym. W skrócie (patrz Robinson et al.⁴ dla obszernego przeglądu), elektroda jest stosowana do podnoszenia i obniżania napięcia w sposób trójkątnej fali w szybkim tempie czasowym⁴. Gdy napięcie znajduje się w prawidłowym zakresie, interesujący go związek jest wielokrotnie utleniany i redukowany. To utlenianie i redukcja powoduje ruch elektronów, który wytwarza mały prąd przemienny. Szybkość skanowania odbywa się w skali subsekundowej, przy czym utlenianie i redukcja związków zachodzą w mikrosekundach. Odejmując prąd tła wytwarzany przez sondę od prądu wynikowego, można wygenerować wykres napięcia w funkcji prądu unikalny dla każdego związku. Ponieważ skala czasowa oscylacji napięcia jest znana, dane te można wykorzystać do obliczenia wykresu prądu w funkcji czasu. W ten sposób względne stężenia związku można określić, o ile znana jest liczba elektronów przenoszonych w każdej reakcji utleniania i redukcji⁴.

Ta specyfika chemiczna i wysoka rozdzielczość czasowa sprawiają, że FSCV jest potężną techniką wykrywania zmieniających się stężeń chemicznych in vivo. Jednak pomimo tych licznych zalet, technika ta wymaga rozległej wiedzy technicznej oraz drogiego sprzętu i konfiguracji. Co więcej, nieelektroaktywnych neuroprzekaźników (np. glutaminianu) nie można zmierzyć za pomocą tej techniki. Na szczęście postęp technologiczny w dziedzinie elektrochemii⁵, a także komercjalizacja tych wynalazków, wprowadziły stosunkowo proste podejście do pomiaru nieelektroaktywnych neuroprzekaźników u obudzonych zwierząt bez uszczerbku dla precyzji czasowej - technika znana jako technologia biosensorów enzymatycznych. Technika ta wykorzystuje enzymatyczną konwersję nieelektroaktywnego neuroprzekaźnika będącego przedmiotem zainteresowania na dwa substraty, z których jednym jest elektroaktywny nadtlenek wodoru, który jest wykrywany jako amperometryczny prąd utleniania generowany przez przyłożony potencjał⁵. Dostępne na rynku sondy biosensorów (patrz Rysunek 1) selektywnie mierzą interesujące nas anality, konkurencyjnie zmniejszając udział interferencji endogennych. W przypadku glutaminianu udział powszechnego interferencyjnego kwasu askorbinowego (AA) jest konkurencyjnie redukowany do mierzonego prądu poprzez kolokalizację oksydazy AA na aktywnej powierzchni enzymatycznej czujnika, przekształcając AA w nieelektroaktywną dihydroaskorbinian i wodę. Ponadto ujemnie naładowana warstwa polimeru Nafion obecna pod warstwą enzymatyczną wyklucza endogenne związki anionowe.

Ten sam eksperymentalny zestaw biosensorów może mierzyć elektroaktywne neuroprzekaźniki, jak w FSCV, ale zamiast tego wykorzystuje zapis o stałym potencjale⁶. W przeciwieństwie do napięcia oscylacyjnego stosowanego w FSCV, w nagraniu o stałym potencjale napięcie jest utrzymywane na poziomie potencjału redoks dla badanego analitu. Chociaż jest mniej selektywne chemicznie niż FSCV, ponieważ wiele neuroprzekaźników może mieć ten sam potencjał redoks, w obszarach mózgu, które w przeważającej mierze skłaniają się ku jednemu neuroprzekaźnikowi, charakter tego podejścia "pod klucz" przeważa nad brakiem specyficzności chemicznej.

Możliwość pomiaru uwalniania neuroprzekaźników zarówno elektrycznych, jak i nieelektroaktywnych w czasie zbliżonym do rzeczywistego i powiązania ich z konkretnymi zdarzeniami behawioralnymi daje możliwość zbadania zbieżnego uwalniania neuroprzekaźników. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zastosowanie tego systemu do badania neurotransmisji zarówno dopaminy, jak i glutaminianu w odpowiedzi na naturalną nagrodę u obudzonych chomików. Celem niniejszej pracy jest szczegółowe przedstawienie procesu pomiaru uwalniania tego neuroprzekaźnika podczas zachowań seksualnych u samic chomików, w celu wykazania jego wykonalności do badania innych zachowań i paradygmatów eksperymentalnych.

Chomiki są idealnym modelem do wykorzystania w nagraniach elektrochemicznych
Historycznie rzecz biorąc, modele szczurów i myszy były wykorzystywane w badaniu zachowań seksualnych. Te gatunki gryzoni angażują się w dynamiczną sekwencję kopulacyjną, obejmującą liczne zachowania samic, które obejmują skakanie, rzucanie się i poruszanie uszami, aby zwabić samca do pogoni i ostatecznie dosiąść samicy⁷. Dosiadanie przez samca (z penetracją pochwy lub bez) trwa tylko kilka sekund, podczas których samica angażuje się w swoją postawę zachowania seksualnego (określaną jako lordoza) również tylko przez kilka sekund, zanim wznowi aktywne zachowania nagabywania. Ten wzorzec zachowania, składający się z wysokiego poziomu aktywności przeplatanego krótkimi okresami bezruchu, jest problematyczny w pomiarze neurotransmisji u zachowujących się zwierząt. Po pierwsze, w nagraniach amperometrycznych mogą występować artefakty ruchowe, które nie są związane z aktywnością neuronalną. Po drugie, lokomocja jest związana z uwalnianiem określonych neuroprzekaźników w określonych obszarach mózgu. Na przykład, uwalnianie dopaminy zostało sprzężone z aktywnością lokomotoryczną w prążkowiu grzbietowym i brzusznym^8,9, odkrycie, które stanowiło podstawę do pomiarów dopaminy w mikrodializie po podaniu psychostymulantu¹⁰. Ponieważ typowe dla samic zachowania nagabywania u większości gryzoni obejmują wysoki poziom aktywności lokomotorycznej i są reprezentowane przez większość 10-minutowego testu zachowań seksualnych, utrudnia to przypisanie zmian w neurotransmisji wyraźnym składnikom zachowań seksualnych, które łącznie trwają tylko kilka minut.

Aby przeanalizować profil neurochemiczny kobiecych zachowań seksualnych, to laboratorium szukało gatunku, u którego występuje minimalna aktywność lokomotoryczna towarzysząca zachowaniom seksualnym. Sekwencja kopulacyjna u chomików syryjskich (Mesocricetus auratus) jest idealna do zapisów neurochemicznych ze względu na brak zachowań związanych z nagabą, które zwykle obserwuje się u szczurów i myszy¹¹. W konsekwencji samice chomików wejdą i utrzymają pozycję lordozy przez ponad 9 minut z 10-minutowej sesji testowej¹². Przy braku obcych ruchów lokomotorycznych samicy można uzyskać zapisy elektrochemiczne in vivo, które można powiązać ze składnikami interakcji seksualnych z samcem.

Napady kopulacyjne u chomików
Po wprowadzeniu samca zwierzęcia stymulacyjnego do komory testowej, samiec początkowo zaangażuje się w badanie odbytu i narządów płciowych (AI) samicy, zanim ją wsiądzie (Rysunek 2A). Aby samiec mógł dosiąść konia, samica musi przyjąć receptywną postawę seksualną znaną jako lordoza, w której wygina plecy w łuk i odchyla ogon, aby dosiadający samiec mógł uzyskać dostęp prącia do jej pochwy. Samiec dosiada samicy, chwytając ją za zad obiema łapami (Ryc. 2B) i zaczyna pchać, próbując uzyskać intromisję prącia (Ryc. 2C). Samiec dopadnie samicę (bez włożenia), a także wprowadzi się kilka razy, zanim ostatecznie osiągnie wytrysk. Ta sekwencja wierzchowców i intromisji prowadzących do wytrysku jest określana jako "atak kopulacyjny". Samce będą miały kilka napadów kopulacyjnych w ciągu jednej sesji.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Minnesoty i są zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych¹³.

1. Zwierzęta i chirurgia kaniulacji

1. Zaopatrz się w chomiki syryjskie od popularnego dostawcy zwierząt w wieku około 55 dni.
   UWAGA: Chociaż wiek zwierząt będzie się różnił ze względu na ograniczenia różnych paradygmatów eksperymentalnych, dla zachowań seksualnych ważne jest, aby uzyskać dojrzałe płciowo zwierzęta, które są w przybliżeniu w tym samym wieku.
2. Zwierzęta trzymane w pomieszczeniach o kontrolowanej temperaturze (22 °C) i oświetleniu (14 godzin światła, a następnie 10 godzin ciemności i zgaszone światło o godzinie 13:00), z jedzeniem i wodą dostępnymi ad libitum, z wyjątkiem okresów badań doświadczalnych.
   UWAGA: Ponieważ chomiki rozmnażają się sezonowo, ten cykl światła / ciemności 14:10 naśladuje ich naturalne warunki rozrodu.
3. Po 1-tygodniowej aklimatyzacji do laboratorium należy wykonać aseptyczną obustronną owariektomię i wewnątrzczaszkowe kaniulacje stereotaktyczne w znieczuleniu ogólnym (np. pentobarbital) oraz zastosować odpowiednie, zatwierdzone instytucjonalnie pooperacyjne leczenie przeciwbólowe i antybiotykowe, zgodnie z wcześniejszym opisem^14,15.
   UWAGA: Do badania zachowań seksualnych konieczne jest przeprowadzenie owariektomii w celu usunięcia głównego endogennego źródła hormonów płciowych, tak aby zwierzęta mogły być równomiernie indukowane do receptywności seksualnej za pomocą hormonu egzogennego zgodnie z harmonogramem eksperymentu.
   1. Zarówno do implantacji sondy dopaminergicznej, jak i glutaminergicznej, stereotaktycznie implantowane kaniule prowadzące (średnica 0,7 mm; Rysunek 3) w obszar zainteresowania (np. to laboratorium celowało w prawe jądro półleżące (NAc)) zgodnie z szczegółowym opisem w innym miejscu¹⁵.
      UWAGA: Chociaż przedstawione dane pochodzą z nagrań z jednego czujnika jednej sondy glutaminianu lub dopaminy na zwierzę, system ten pozwala na jednoczesne rejestrowanie do 4 czujników u jednego zwierzęcia; W ten sposób można wszczepić od 1 do 4 kaniul w zależności od pożądanego projektu eksperymentu i wyników.
      1. Określ współrzędne implantu w obszarze zainteresowania za pomocą atlasu stereotaktycznego (np. The Golden Hamster Brain firmy Morin & Wood), pamiętając, że czujnik rozciąga się 1 mm poniżej kaniuli w głąb tkanki mózgowej.
   2. Po stereotaktycznym obniżeniu kaniuli do pożądanego miejsca grzbietowo-brzusznego, przymocuj ją do czaszki za pomocą nasadki wykonanej z akrylu dentystycznego, zabezpieczonej kostnymi ze stali nierdzewnej i plastikowym mocowaniem na głowę (Rysunek 3; zobacz¹⁵, aby uzyskać więcej informacji).
   3. Do badania włókna węglowego należy włożyć elektrodę referencyjną (średnica 350 μm, długość całkowita 7,5 mm) do półkuli przeciwległej.
      UWAGA: Określone miejsce lub odległość od kaniuli nie jest wymagana; Elektrody referencyjne można umieścić w dowolnym miejscu półkuli przeciwległej, co jest wygodne.

2. Testowanie biosensorów i włókien węglowych

1. Po 1 tygodniu rekonwalescencji po operacji należy podać schemat pobudzania hormonalnego, aby wywołać otwartość seksualną.
   1. Wstrzyknąć 10 μg benzoesanu estradiolu w 0,1 ml oleju z nasion bawełny podskórnie (s.c.), około 48 godzin i 24 godziny przed badaniem zachowań seksualnych, aby wywołać receptywność seksualną w kierunku męskiego ¹¹.
   2. Wstrzyknij 500 μg progesteronu w 0,1 ml oleju z nasion bawełny, s.c., 4 godziny przed wprowadzeniem samca, aby wywołać receptywność seksualną¹¹.
2. Przetestuj wszystkie zwierzęta na początku ciemnej fazy ich cyklu dobowego, ponieważ zachowania społeczne gryzoni podlegają zmianom w warunkach testowania w świetle białym i czerwonym^16,17,18.
3. W przypadku badania glutaminianu biosensoru enzymatycznego należy skalibrować czujniki in vitro (Rysunek 4) przed użyciem, jak opisano wcześniej^15,19.
   1. Roztwory kalibracyjne należy przygotować na świeżo w dniu badania w szklanych probówkach wirówkowych o pojemności 20 ml. W przypadku roztworu analitu rozpuść 7,4 mg kwasu L-glutaminowego w 10 ml ultraczystego_H2O, delikatnie odwracając probówkę. Przygotować roztwór zakłócający, rozpuszczając 176,1 mg AA w 10 ml ultraczystego_H2O.
   2. Przygotuj się do kalibracji, umieszczając mieszadło magnetyczne na podstawie podstawowego statywu laboratoryjnego. Umieść zlewkę z płaszczem o pojemności 20 ml na mieszadle magnetycznym i clamp w miejscu za pomocą średniego 2-bolcowego zacisku.
      1. Dodać mieszadło magnetyczne i 20 ml 100 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zlewki z osłoną. Podłączyć zlewkę z płaszczem do łaźni wodnej z obiegiem w celu podgrzania roztworu buforowego do temperatury 37 °C.
         UWAGA: Kalibracje biosensorów enzymatycznych muszą być wykonywane w temperaturze ciała, ponieważ na aktywność enzymatyczną wpływa temperatura.
   3. Umieść uchwyt do kalibracji czujnika na górze zlewki z płaszczem i ustaw 4-kanałowy przedwzmacniacz kalibracyjny na górze, zabezpieczając na miejscu za pomocą kąta prostego clamp. Podłącz przedwzmacniacz do urządzenia do kondycjonowania i akwizycji danych, aby zarejestrować dane kalibracyjne.
   4. Przed zapisem doświadczalnym należy zbadać czułość każdego biosensora enzymatycznego na glutaminian (lub inne anality będące przedmiotem zainteresowania dla innych dostępnych na rynku sond biosensorów, np. glukozy), umieszczając sondę w uchwycie kalibracyjnym na zlewce z płaszczem, zanurzając wnękę czujnikową i pewną część przewodu odniesienia chlorku srebra (AgCl) w roztworze buforowym.
      1. Przed podłączeniem każdego testowanego czujnika (do 4) do portu w 4-kanałowym przedwzmacniaczu kalibracyjnym, zainicjuj nowe nagranie na interfejsie komputera, korzystając z bezpłatnego oprogramowania do akwizycji, które można pobrać. Pozwól, aby czujniki osiągnęły stabilną linię bazową.
   5. Rozpocznij dodawanie zastrzyków analitu, gdy czujniki osiągną stabilną linię podstawową. Użyj otworu w uchwycie kalibracyjnym, aby wprowadzić końcówkę pipety do roztworu buforowego. Użyj narzędzia do szybkiej adnotacji w oprogramowaniu do nagrywania, aby dodać adnotację, kiedy wykonane jest wstrzyknięcie.
      1. Dodać 10 μM glutaminianu, pipetując 40 μl roztworu analitu do roztworu buforowego. Poczekaj, aż czujnik ustabilizuje się między dodatkami. Dodać 3 wstrzyknięcia roztworu analitu przed dodaniem pojedynczego wstrzyknięcia z zakłócającego roztworu AA (objętość 50 μl do wstrzykiwania na 250 μM zmiana stężenia).
         UWAGA: Kalibracja pozwala na konwersję zmian w sygnale amperometrycznym (obserwowanych podczas enzymatycznego zapisu eksperymentalnego w kroku 2.12) na zmiany stężenia glutaminianu, jeśli jest to pożądane. Zobacz reference¹⁵, aby uzyskać instrukcje krok po kroku. Sondy dopaminergiczne używane przez to laboratorium są kalibrowane podczas procesu produkcyjnego przez komercyjnego dostawcę. Sondy glutaminianu muszą być skalibrowane w momencie użycia, ponieważ ich czułość może z czasem ulec zmniejszeniu w miarę degradacji składników enzymatycznych¹⁹. Ponieważ elektrody z włókna węglowego nie ulegają degradacji, kalibracja przeprowadzona przez firmę przed wysyłką jest wystarczająca, ponieważ istnieje zwiększone prawdopodobieństwo uszkodzenia cienkiego włókna węglowego (średnica 350 μm) poprzez dodatkową obsługę.
4. Wyłóż komorę testową ściółką pobraną z klatki domowej zwierzęcia.
   UWAGA: Zwiększa to zaznajomienie samicy z komorą testową, a także naraża samca na stymulujące seksualnie sygnały węchowe, które były dystrybuowane przez samicę w odpowiedzi na leczenie estradiolem.
5. Lekko znieczulić zwierzęta przed wprowadzeniem sondy za pomocą izofluranu lub innego lotnego środka znieczulającego w komorze indukcyjnej.
6. Wyjmij obdurator okluzyjny z kaniuli prowadzącej i włóż elektrodę z włókna węglowego lub sondę enzymatyczną przez wałek prowadzący.
7. Po włożeniu sondy umieść zwierzę w komorze testowej.
   UWAGA: To laboratorium wykorzystuje szklane akwarium o pojemności 10 galonów (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), ale można również zastosować okrągłe komory o równej powierzchni.
8. Rozpocznij nagrywanie obrazu i sygnału amperometrycznego z blokadą czasową w dostępnym na rynku oprogramowaniu, szczegółowo opisanym w innym miejscu¹⁵.
9. Podłącz czujnik do systemu nagrywającego: potencjostatu za pomocą elektrycznie ekranowanego i elektrycznego krętlika. Ustabilizuj połączenie czujnika, przykręcając kołek do mocowania głowicy. W razie potrzeby wzmocnij połączenie za pomocą folii laboratoryjnej.
   UWAGA: Do przyłączenia zarówno elektrody z włókna węglowego, jak i elektrody odniesienia do potencjostatu potrzebne jest niestandardowe złącze, podczas gdy czujniki glutaminianu enzymatycznego można podłączyć bezpośrednio do potencjostatu.
10. Pozwól czujnikowi zrównoważyć się w mózgu przed testami eksperymentalnymi.
    UWAGA: Czasy równoważenia różnią się w zależności od czujnika rejestrującego (np. czujniki enzymatyczne wymagają 2 - 4 godzin równowagi, podczas gdy elektrody z włókna węglowego wymagają tylko około 30 minut). Jeśli wszczepione są oba typy czujników, należy je zrównoważyć przez dłuższy czas czujnika enzymatycznego.
11. Po wyrównaniu czujnika wprowadź samca bodźca do komory testowej.
12. Po pierwszym zamontowaniu z wprowadzeniem prącia (zwanym intromisją) przez samca bodźca, kontynuuj nagrywanie przez dodatkowe 10 - 30 minut, w zależności od celów eksperymentu.
13. Po przeprowadzeniu testów behawioralnych odłącz czujnik samicy.
14. Wyjmij oba chomiki z komory testowej. Usuń ściółkę i wyczyść komorę przy użyciu 70% etanolu.
    UWAGA: Ze względu na krótką równowagę wymaganą do zapisów z włókna węglowego, kroki 2.3 - 2.14 można powtórzyć w celu przetestowania wielu zwierząt tego samego dnia. W przeciwieństwie do tego, ponieważ czujniki enzymatyczne wymagają około 4 godzin równowagi, należy testować tylko jedno zwierzę dziennie, aby ograniczyć możliwe różnice między osobnikami spowodowane różnicami w czasie okołodobowym zwierząt podczas testowania.

3. Ofiara i perfuzja

1. Po zakończeniu okresu testowego należy głęboko znieczulić badaną kobietę środkiem do eutanazji (np. to laboratorium stosuje dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,2 ml fenytoiny i roztworu pentobarbitalu).
2. Perfuzję przezsercową zwierzęcia za pomocą 25 mM PBS, pH 7,6, w celu usunięcia całej krążącej krwi, a następnie 20-minutowe utrwalenie przy użyciu 4% paraformaldehydu-PBS.
3. Usuń mózg i postfiks w ~ 30 ml 4% roztworu paraformaldehydu w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez noc.
   1. Przechowywać mózg w 10% roztworze sacharozy-PBS do momentu, gdy będzie gotowy do cięcia seryjnego.
      UWAGA: Mózgi mogą być przechowywane do 2 tygodni, z cotygodniową zmianą roztworu sacharozy, aby uniknąć potencjalnego wzrostu zanieczyszczeń.
4. Szeregowe cięcie mózgu w odległości 40 μm przecina wszczepiony obszar za pomocą mikrotomu zamrażającego lub kriostatu, jak opisano wcześniej¹⁹.
5. Montuj plastry szeregowo na dostępnych na rynku szkiełkach pokrytych klejem (lub zobacz²⁰, aby wykonać). Pozostawić do wyschnięcia, przynajmniej na noc.
6. Zabarwić szkiełka barwnikiem kresylowo-fioletowym, bezbarwnym i szkiełkiem nakrywkowym, jak opisano wcześniej²⁰.
7. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby potwierdzić anatomiczne umiejscowienie czujnika.

4. Kodowanie behawioralne

1. Przeglądaj filmy i dodawaj do nich adnotacje za pomocą bezpłatnego oprogramowania do pobrania na zasadach komercyjnych (patrz Spis materiałów) w zwolnionym tempie, aby precyzyjnie zakodować zachowania zablokowane w czasie dla sygnału amperometrycznego.
   UWAGA: Aby użyć kodu MATLAB w analizie (patrz poniżej), dodaj adnotacje dotyczące początku i końca każdego z zachowań samicy i mężczyzny.
   1. Opisz startWładczyni w kadrze, gdy samica inicjuje zgięcie grzbietowe grzbietu i uwodzi ogon do góry. Opisz koniec Lordozy, gdy samica kończy tę postawę, co często występuje, gdy samica dostosowuje się do innego miejsca w komorze testowej.
   2. Przypisz startAI, gdy samica jest w pozycji lordozy, a samiec przesuwa pysk w kierunku okolicy odbytu i narządów płciowych samicy, gdzie może wystąpić wąchanie, lizanie lub dotykanie okolicy krocza. Adnotuj koniecA, gdy samiec zdejmuje pysk z bliskiej odległości od okolicy odbytu i narządów płciowych samicy.
   3. Opisz startMount gdy samiec zbliża się i kładzie przednie łapy na samicy w pozycji dosiadającej, niezależnie od orientacji próby dosiadu (np. bok, zad).
   4. Adnotacja startIntromisja po udanym pchnięciu zapewnia zamontowany męski prąć dostęp do pochwy samicy.
      UWAGA: Intromisja jest behawioralnie odróżnialna od pchnięcia konnego, które ma miejsce przed intromisją, ponieważ samiec widocznie przyciąga górne kończyny do swojego ciała, wypycha miednicę do przodu i zwija ogon do góry, wskazując na penetrację (patrz Rysunek 4C).
      1. W razie potrzeby dodaj adnotację do ejakulacji.
         UWAGA: Pod koniec walki godowej i w połączeniu z udaną intromisją, samiec ma wytrysk. Chociaż nie jest się w stanie wyobrazić sobie rzeczywistej emisji, samce chomików mają charakterystyczny ruch stąpania tylną stopą podczas intromission²¹, w ten sposób adnotuj wytrysk w momencie wystąpienia ruchu stopy.
   5. Opisz endIntromission i endMount jednocześnie w kadrze, gdy samiec usunął dwie przednie łapy, a tym samym nie ma kontaktu z samicą. Ze względu na częstą niemożność wizualizacji jego wycofania, jednoczesne kodowanie tych dwóch zachowań, aby zapewnić spójność i niezawodność podczas walk godowych.
      Uwaga: Atak godowy albo następuje po udanym wytrysku, albo ma miejsce, gdy samica przełamuje pozycję lordozy po co najmniej jednym wierzchowcu.

5. Przykładowa analiza danych

Uwaga: Użycie włókna węglowego o stałym potencjale i nagrań enzymatycznych odpowiednio dla dopaminy i glutaminianu, pozwala na pomiar zarówno tonicznych, jak i fazowych wzorców uwalniania elektrochemicznego. Laboratorium to wykorzystuje bezpłatny, komercyjny system akwizycji i oprogramowanie do nagrywania i konwersji zarejestrowanych sygnałów z analogowych na cyfrowe (odchylenie 0,600 V, częstotliwość próbkowania = 1 Hz).

1. Opis przykładowego protokołu analizy danych
   1. Chociaż można użyć innych programów, określ ilościowo zmiany toniczne i fazowe (przejściowe) w zarejestrowanym sygnale elektrochemicznym za pomocą MATLAB.
      1. Dla prezentowanych danych oblicz sygnał toniczny za pomocą filtra 50-punktowej średniej kroczącej. Znormalizowana reprezentacja sygnału tylko w stanie nieustalonym została obliczona przez odjęcie sygnału tonicznego od surowych danych. Przy identyfikacji pików fazowych istnieją różne opcje algorytmiczne (np. oznaczanie pików jako zmian w sygnale o więcej niż 1 SD powyżej średniej).
      2. Zidentyfikuj lokalizacje tych pików, tj. maksima lokalne, od znormalizowanego sygnału za pomocą wyszukiwarki szczytów funkcji MATLAB z minimalną amplitudą piku ustawioną na średnią kwadratową sygnału. Lokalizacja pików wykrytych na podstawie znormalizowanego sygnału została wykorzystana do wyodrębnienia amplitudy z każdego piku. Zdolność do wykrywania pików pozwala na identyfikację wszelkich zachowań zablokowanych w czasie, które mogą zbiegać się z lub napędzać względny szczyt w badanym neurochemicznym badaniu.
   2. Segmentacja przetworzonych danych zgodnie z adnotacjami behawioralnymi (patrz krok 3); test t Studenta został wykorzystany do oceny różnic w poziomie neuroprzekaźników tonicznych, występowaniu stanów przejściowych i amplitudzie stanów przejściowych podczas lordozy przed kryciem w porównaniu z lordozą podczas napadów godowych. Aby zmierzyć zmiany w tonicznych wzorcach uwalniania elektrochemicznego, punkty danych występujące podczas pozycji lordozy bezpośrednio przed atakiem godowym (tj. Lordoza przed kryciem) porównano z punktami danych podczas sesji godowej za pomocą testu t.
2. Przygotowanie surowych danych do opisanego protokołu analizy danych
   Uwaga: Jak wspomniano, chociaż inne programy lub analizy mogą być równie opłacalnymi opcjami, aby skorzystać z opisanego powyżej kodu MATLAB, surowe dane muszą być przygotowane w następujący sposób:
   1. Eksportuj pliki adnotacji i napięcia. Aby to zrobić, w zakładce "Plik" wybierz funkcję "Eksportuj" i wybierz zakładkę "Adnotacje", aby zapisać adnotacje. W zakładce 'Plik' wybierz funkcję 'Eksportuj' i wybierz zakładkę "TSV', aby zapisać pomiary napięcia jako plik rozszerzenia TSV.
   2. Otwórz każdy plik za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i zapisz jako "xls/xlsx", aby pliki były zgodne z MATLAB.
      UWAGA: W przypadku pliku "Adnotacja" istnieją dodatkowe adnotacje, które należy ręcznie dodać po eksporcie w programie arkusza kalkulacyjnego, aby dyktować początek i koniec zarówno lordozy przed kryciem (oznaczonej adnotacją jako PreMBlordorsis), jak i walki krycia, aby te punkty czasowe można było bezpośrednio porównać, jak wspomniano w kroku 5.1.2.
   3. Opisz początek lordozy przed kryciem (startPreMBlordosis) w tym samym czasie, w którym rozpoczyna się zachowanie lordozy (startLordosis), które obejmuje również zachowanie wierzchowca, a także na początku nowego ataku godowego, jeśli samica pozostaje w pozycji lordozy.
   4. Opisz koniec lordozy przed kryciem (endPreMBlordosis), gdy rozpocznie się pierwszy wierzchowiec.
   5. Opisz początek walki godowej (startMB) w tym samym czasie, co koniecPreMBlordosis, ponieważ oznacza to początek walki krycia.
   6. Dodać adnotację do końca walki godowej (endMB) na końcu wierzchowca, który obejmuje wytrysk (patrz krok 4.1.4.1), lub po zakończeniu przez samicę pozycji lordozy (endLordosis).

Wyniki

Wykorzystując opisaną powyżej metodologię kodowania elektrochemicznego i behawioralnego, laboratorium to rozpoczęło charakteryzację wahań tonicznych i fazowych zarówno dopaminy, jak i glutaminianu podczas rejestracji in vivo zachowań seksualnych. Dzięki wysokiej rozdzielczości czasowej tej metodologii możemy dokładniej opisać neurotransmisję podczas zachowań seksualnych, a także przypisać specyficzne zmiany w wzorcach uwalniania do odpowiadających im zmian tonicznych podczas kopu...

Dyskusja

Chociaż jest to stosunkowo proste, podczas stosowania tej techniki mogą pojawić się pewne problemy. Po pierwsze, stereotaktyczne rozmieszczenie sond musi być precyzyjne: w przeciwieństwie do mikrodializy, która pobiera próbki z szerszego promienia środowiska zewnątrzkomórkowego otaczającego sondę, ta technika pozwala tylko na pomiar neuroprzekaźnika, który ma bezpośredni kontakt z sondą. Po drugie, w przypadku zapisu z włókna węglowego, ze względu na małą szerokość włókna, może dojść do pęknięcia, a sondę należy włożyć z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dąb Nembutal	Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital do wstrzykiwań sodu, USP. W tym laboratorium używa się 8,5 mg/100 g masy ciała, wstrzykiwanego dootlenowo.
Lek przeciwbólowy Loxicom	Laboratoria Norbrook	6451603670	NLPZ przeciwzapalne i przeciwbólowe stosowane do kontroli bólu pooperacyjnego. Ogólne: meloksykam.
Antybiotyk Enroflox	Laboratoria Norbrook	5552915411	Antybiotyk fluorochinolonowy w profilaktyce zakażeń pooperacyjnych. Ogólne: Enrofloksacyna.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sód, Fenytoina Środek do eutanazji sodu.
kostne	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	Śruba kościana 1/8" (opakowanie 16 sztuk) służy do mocowania czapki czaszki do czaszki.
Akryl dentystyczny (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Samoutwardzalny akryl dentystyczny służy do budowy nasadki czaszki do mocowania kaniuli i mocowania głowy do czaszki.
Konfiguracja biosensora sprzętowego	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle oferuje kompletne zestawy sprzętowe dla nowych użytkowników naszego systemu biosensorów na uwięzi dla szczurów. Zestawy zawierają komutator, przedwzmacniacz oraz system kondycjonowania i akwizycji danych
Podstawowy pakiet komputera wideo	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	Podstawowy pakiet komputerowy zawiera wstępnie skonfigurowany komputer z dużą ilością miejsca na dysku twardym, monitor o wysokiej rozdzielczości, klawiaturę i mysz, zasilacz awaryjny oraz wszystkie niezbędne.
Kamera Video EQ700 EverFocus  pakiet	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	Kamera noktowizyjna EQ700 z niezależnym źródłem podczerwieni została zakupiona w pakiecie wideokomputera Pinnacle. Dostępne są również opcje kamery kopułkowej (9000-K9) i kamery HD (9000-K11).
Oprogramowanie do przejęcia Sirenia	Pinnacle Technologies, Inc.	Darmowy - dostępny do pobrania z pinnaclet.com	Sirenia  Acquisition zapewnia pojedynczą platformę do rejestrowania danych z dowolnego systemu sprzętowego Pinnacle. Oprogramowanie oferuje synchronizację wszystkich strumieni danych, ustawienia konfigurowane przez użytkownika, konsolidację danych i wiele opcji eksportu. Ponadto oprogramowanie zawiera podstawowe moduły przeglądu i analizy zapisów z biosensorów. Syrenia  Dostarcza bezpłatne oprogramowanie typu ll-in-one, które idealnie nadaje się do gromadzenia i przeglądania danych.
Szczur na uwięzi  in vitro  zestaw kalibracyjny	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	Aby powiązać bieżące zmiany mierzone przez bioczujnik z rzeczywistymi zmianami stężenia analitu, konieczna jest kalibracja bioczujnika przed implantacją zwierzęciu. Proces ten potwierdza również integralność i selektywność czujników. Zestaw kalibracyjny zawiera zlewkę z płaszczem 20 ml (#7058), mieszadło magnetyczne 1/2" na 1/8" (#7059), zacisk kątowy (#7056), zacisk z pojedynczym bolcem z 2 bolcami (#7055), 4-kanałowy preamplifer kalibracyjny (#7053) i uchwyt kalibracyjny (#7051).
Wymieszaj talerz	Corning	6795-410D	Mieszadło cyfrowe Corning, 5" x 7", 120 VAC używane do wirowania mieszadła magnetycznego w zlewce z płaszczem podczas in vitro kalibracji biosensorów glutaminianu.
Łaźnia wodna z możliwością cyrkulacji w pętli zamkniętej	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standardowa cyfrowa podgrzewana kąpiel cyrkulacyjna, łaźnia wodna 120VAC została użyta z plastikową rurką do podgrzania zlewki z płaszczem do temperatury fizjologicznej.
Czujnik z włókna węglowego z kaniulami szczurzymi BASi	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Elektroda z włókna węglowego służąca do rejestracji neuroprzekaźnictwa dopaminy.
Elektroda referencyjna Ag/AgCl	firmy Pinnacle Technology, Inc.	7065	Niezbędny do nagrań z włókna węglowego.
Biosensory glutaminianu	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Sonda biosensoryczna enzymatyczna służąca do rejestracji neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego.
Kaniule prowadzące BASi	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Kaniule prowadzące wszczepione w obszar mózgu zainteresowania w celu prowadzenia sondy.
Plastikowa kaniula BASi dla szczurów	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizuje sondę i mocuje się do potencjostatu.