Artykuł metodologiczny

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

DOI:

10.3791/56135

⸱

12 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość mierzenia uwalniania neuroprzekaźników w szybkiej skali czasowej pozwala na powiązanie wzorców neurotransmisji z określonymi zachowaniami lub manipulacjami; potężne narzędzie do wyjaśniania podstawowych mechanizmów i obwodów. Podczas gdy technika mikrodializy jest stosowana od dziesięcioleci do pomiaru prawie każdego analitu będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu, technika ta jest ograniczona pod względem rozdzielczości czasowej. Alternatywnie, woltamperometria cykliczna szybkiego skanowania jest zarówno czasowo precyzyjna, jak i niezwykle czuła; Ponieważ jednak ta trudna technicznie metoda opiera się na elektroaktywności badanego analitu, możliwość wykrycia substancji nieelektroaktywnych (np. neuroprzekaźnika glutaminianu) jest wyeliminowana. W tym artykule szczegółowo opisano zastosowanie systemu "pod klucz", który łączy amperometrię o stałym potencjale i biodetekcję enzymatyczną w celu pomiaru zarówno elektroaktywnych, jak i nieelektroaktywnych neuroprzekaźników z precyzją czasową. Połączenie tych dwóch potężnych technik pozwala na stosunkowo łatwy pomiar zarówno tonicznej, jak i fazowej neurotransmisji oraz pozwala na jednoczesne rejestrowanie wielu neuroprzekaźników. Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie procesu pomiaru neurotransmisji dopaminy i glutaminianu in vivo przy użyciu naturalnie nagradzającego zachowania (tj. zachowania seksualnego) u samic chomików, z ostatecznym celem wykazania technicznej wykonalności tego testu do badania innych zachowań i paradygmatów eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość pomiaru uwalniania neuroprzekaźników u zwierząt zachowujących się w stanie czuwania pozwala badaczom na powiązanie określonych zachowań z przestrzennymi i czasowymi wzorcami neurotransmisji - potężne narzędzie do badania mechanizmów i obwodów leżących u podstaw zarówno naturalnych, jak i funkcyjnych zachowań w czasie rzeczywistym. Historycznie rzecz biorąc, mikrodializa była stosowana do pomiaru zarówno substancji reaktywnych, jak i niereaktywnych w środowisku zewnątrzkomórkowym mózgu1. Technika ta wykorzystuje ciągły przepływ wodnego roztworu o podobnym składzie jonowym do płynu zewnątrzkomórkowego, przez sondę mikrodializacyjną skła....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Minnesoty i są zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych13.

1. Zwierzęta i chirurgia kaniulacji

  1. Zaopatrz się w chomiki syryjskie od popularnego dostawcy zwierząt w wieku około 55 dni.
    UWAGA: Chociaż wiek zwierząt będzie się różnił ze względu na ograniczenia różnych paradygmatów eksperymentalnych, dla zachowań seksualnych ważne jest, aby uzyskać dojrzałe płciowo zwierzęta, które są w przybliżeniu w tym samym wieku.
  2. Zwierzę....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metodologii kodowania elektrochemicznego i behawioralnego opisanej powyżej, laboratorium zaczęło charakteryzować zarówno toniczne, jak i fazowe wahania zarówno dopaminy, jak i glutaminianu podczas nagrań in vivo zachowań seksualnych. Ze względu na czasowo precyzyjny sposób tej metodologii, możemy dokładniej scharakteryzować neuroprzekaźnictwo podczas zachowań seksualnych; a także przypisują określone zmiany we wzorcach uwalniania odpowiednim zmianom tonicznym podcza.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż jest to stosunkowo proste, podczas stosowania tej techniki mogą pojawić się pewne problemy. Po pierwsze, stereotaktyczne rozmieszczenie sond musi być precyzyjne: w przeciwieństwie do mikrodializy, która pobiera próbki z szerszego promienia środowiska zewnątrzkomórkowego otaczającego sondę, ta technika pozwala tylko na pomiar neuroprzekaźnika, który ma bezpośredni kontakt z sondą. Po drugie, w przypadku zapisu z włókna węglowego, ze względu na małą szerokość włókna, może dojść do pęknięcia, a sondę należy włożyć z.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować studentowi Danielowi Korusowi za pomoc w uruchomieniu kodu Matlab oraz studentowi Alexowi Boettcherowi za pomoc w prowadzeniu eksperymentów behawioralnych. Projekt ten jest wspierany przez NSF IOS 1256799 R.L.M. oraz przez National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer T32DA007234.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dąb NembutalPharmaceuticals Inc.76478-501-50Pentobarbital do wstrzykiwań sodu, USP. W tym laboratorium używa się 8,5 mg/100 g masy ciała, wstrzykiwanego dootlenowo. 
Lek przeciwbólowy Loxicom Laboratoria Norbrook 6451603670NLPZ przeciwzapalne i przeciwbólowe stosowane do kontroli bólu pooperacyjnego. Ogólne: meloksykam. 
Antybiotyk Enroflox Laboratoria Norbrook 5552915411Antybiotyk fluorochinolonowy w profilaktyce zakażeń pooperacyjnych. Ogólne: Enrofloksacyna.
Beuthanasia-D Merck Animal Health00061047305Pentobarbital Sód, Fenytoina Środek do eutanazji sodu.
kostnePinnacle Technologies, Inc.8111-16Śruba kościana 1/8" (opakowanie 16 sztuk) służy do mocowania czapki czaszki do czaszki.
Akryl dentystyczny (Bosworth Duz-All)Bosworth 166261C Samoutwardzalny akryl dentystyczny służy do budowy nasadki czaszki do mocowania kaniuli i mocowania głowy do czaszki.
Konfiguracja biosensora sprzętowego Pinnacle Technologies, Inc.8400-K2Pinnacle oferuje kompletne zestawy sprzętowe dla nowych użytkowników naszego systemu biosensorów na uwięzi dla szczurów. Zestawy zawierają komutator, przedwzmacniacz oraz system kondycjonowania i akwizycji danych
Podstawowy pakiet komputera wideoPinnacle Technologies, Inc.9000-K1Podstawowy pakiet komputerowy zawiera wstępnie skonfigurowany komputer z dużą ilością miejsca na dysku twardym, monitor o wysokiej rozdzielczości, klawiaturę i mysz, zasilacz awaryjny oraz wszystkie niezbędne.
Kamera Video EQ700 EverFocus  pakietPinnacle Technologies, Inc.  9000-K10 Kamera noktowizyjna EQ700 z niezależnym źródłem podczerwieni została zakupiona w pakiecie wideokomputera Pinnacle. Dostępne są również opcje kamery kopułkowej (9000-K9) i kamery HD (9000-K11).
Oprogramowanie do przejęcia SireniaPinnacle Technologies, Inc.Darmowy - dostępny do pobrania z pinnaclet.comSirenia  Acquisition zapewnia pojedynczą platformę do rejestrowania danych z dowolnego systemu sprzętowego Pinnacle. Oprogramowanie oferuje synchronizację wszystkich strumieni danych, ustawienia konfigurowane przez użytkownika, konsolidację danych i wiele opcji eksportu. Ponadto oprogramowanie zawiera podstawowe moduły przeglądu i analizy zapisów z biosensorów. Syrenia  Dostarcza bezpłatne oprogramowanie typu ll-in-one, które idealnie nadaje się do gromadzenia i przeglądania danych.
Szczur na uwięzi  in vitro  zestaw kalibracyjnyPinnacle Technologies, Inc.7000-K2-T-BAS Aby powiązać bieżące zmiany mierzone przez bioczujnik z rzeczywistymi zmianami stężenia analitu, konieczna jest kalibracja bioczujnika przed implantacją zwierzęciu. Proces ten potwierdza również integralność i selektywność czujników. Zestaw kalibracyjny zawiera zlewkę z płaszczem 20 ml (#7058), mieszadło magnetyczne 1/2" na 1/8" (#7059), zacisk kątowy (#7056), zacisk z pojedynczym bolcem z 2 bolcami (#7055), 4-kanałowy preamplifer kalibracyjny (#7053) i uchwyt kalibracyjny (#7051). 
Wymieszaj talerz Corning6795-410DMieszadło cyfrowe Corning, 5" x 7", 120 VAC używane do wirowania mieszadła magnetycznego w zlewce z płaszczem podczas in vitro kalibracji biosensorów glutaminianu.
Łaźnia wodna z możliwością cyrkulacji w pętli zamkniętejPolyScience8006A11BPolyScience 8006A11B 6L Standardowa cyfrowa podgrzewana kąpiel cyrkulacyjna, łaźnia wodna 120VAC została użyta z plastikową rurką do podgrzania zlewki z płaszczem do temperatury fizjologicznej. 
Czujnik z włókna węglowego z kaniulami szczurzymi BASiPinnacle Technology, Inc.7002-CFSElektroda z włókna węglowego służąca do rejestracji neuroprzekaźnictwa dopaminy.
Elektroda referencyjna Ag/AgClfirmy Pinnacle Technology, Inc.7065Niezbędny do nagrań z włókna węglowego.
Biosensory glutaminianu Pinnacle Technology, Inc.7001 Sonda biosensoryczna enzymatyczna służąca do rejestracji neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego.
Kaniule prowadzące BASiPinnacle Technologies, Inc.7030 Kaniule prowadzące wszczepione w obszar mózgu zainteresowania w celu prowadzenia sondy.
Plastikowa kaniula BASi dla szczurów Pinnacle Technologies, Inc.7011 Headmount stabilizuje sondę i mocuje się do potencjostatu.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7, Unit 7.1.1-7.1.28 (2009).
  2. Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
  3. Lindsay, S....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szybka woltametria cyklicznaamperometria ze sta ym potencja emenzymatyczne biosensorowaniepomiar uwalniania neurotransmiter wneurotransmisja in vivodetekcja dopaminy i glutaminianuanaliza zachowa seksualnychj dro p le ce coretechniki neuronauki behawioralnej

Powiązane artykuły