Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

DOI:

10.3791/56141

⸱

10 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajnik jest głównym organem żeńskiego układu rozrodczego i jest niezbędny do produkcji żeńskich gamet oraz do kontrolowania układu hormonalnego, ale skomplikowane relacje strukturalne i trójwymiarowe (3D) architektury naczyniowe jajnika nie są dobrze opisane. Aby uwidocznić połączenia 3D i architekturę naczyń krwionośnych w nienaruszonym jajniku, pierwszym ważnym krokiem jest optyczne uwidocznienie jajnika. Aby uniknąć kurczenia się tkanek, zastosowaliśmy pasywną metodę CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) w celu oczyszczenia nienaruszonego jajnika. Barwienie immunologiczne, zaawansowana wielofotonowa mikroskopia konfokalna i rekonstrukcje obrazów 3D zostały następnie wykorzystane do wizualizacji naczyń jajnikowych i naczyń włosowatych pęcherzykowych. Stosując to podejście, wykazaliśmy istotną dodatnią korelację (P <0,01) między długością naczyń włosowatych pęcherzykowych a objętością ściany pęcherzyka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyk jest podstawową strukturalną i funkcjonalną jednostką jajnika, a jego rozwój jest ściśle związany z unaczynieniem w jajniku. Naczynia krwionośne dostarczają składniki odżywcze i hormony do mieszków włosowych, a tym samym odgrywają ważną rolę we wzroście i dojrzewaniu mieszków włosowych1.

Połączenie technologii, w tym selektywnych markerów naczyń krwionośnych, transgenicznych modeli myszy i rozwoju farmaceutycznego, poszerzyło naszą wiedzę na temat sieci naczyniowych jajników, angiogenezy i funkcji naczyń krwionośnych w folikulogenezie. Jajnik jest znany jako narząd aktywny, ponieważ przebudowuje różne tkanki i sieci naczyniowe podczas folikulogenezy i owulacji. Taka aktywna przebudowa wielkości i struktury naczyń krwionośnych jest wymagana dla biologicznej funkcji rozwoju i rekrutacji pęcherzyków.

Tradycyjne metody histologiczne i histomorfometryczne wykorzystujące wycinki jajników i znakowanie immunologiczne naczyń krwionośnych są ograniczone do dwuwymiarowych (2D) obrazów2. Wraz z rozwojem technologii rekonstrukcji trójwymiarowej (3D), obrazy 2D wycinków tkanek mogą nakładać się na siebie, aby utworzyć strukturę 3D, ale ta metoda nadal ma pewne ograniczenia - cięcie tkanki może zniszczyć mikrostruktury, często brakuje niektórych części tkanki, a wykonanie rekonstrukcji 3D z obrazów uzyskanych z plasterków wymaga znacznego nakładu pracy. Obrazowanie 3D całych tkanek za pomocą mikroskopii konfokalnej może przezwyciężyć wiele z tych ograniczeń, ale metody te ograniczają się do oceny angiogenezy w zarodkowym jajniku3. Stosowanie metod oczyszczania całych tkanek, takich jak CLARITY4 może zwiększyć wizualizowaną objętość, aby rozwiązać te problemy w jajnikach po urodzeniu i dorosłych, a takie metody zapewniają optyczny klirens jajnika bez żadnych deformacji strukturalnych. Obrazowanie architektury 3D nienaruszonego jajnika zapewnia dokładną bazę danych obrazów dla oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak pakiet oprogramowania Imaris wykorzystany w tej pracy.

Przebudowa jajnika w okresie dorosłym jest częścią dynamicznego systemu fizjologicznego, co czyni jajnik doskonałym modelem do badań nad regulacją angiogenezy. Ponadto ocena roli naczyń krwionośnych jajników w stanach patologicznych żeńskiego układu rozrodczego, takich jak zespół policystycznych jajników lub rak jajnika, może być badana poprzez obrazowanie całej tkanki jajnika. Opracowanie pasywnej metody CLARITY i zastosowanie zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu dostarczyło szczegółowych informacji przestrzennych na temat relacji między naczyniami krwionośnymi a strukturami jajników, takimi jak pęcherzyki włosowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi Komisji Etyki Zwierząt w Shanghai Medical College, Fudan University (numer zatwierdzenia 20160225-013).

1. Przygotowanie przezroczystego jajnika myszy

  1. Przygotowanie roztworów
    1. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) (1 M, pH 7,6) z 0,1% Triton X-100 (PBST). Aby przygotować 1 l 10x PBS roztworu podstawowego, wymieszaj 87 g NaCl, 3,1 g NaH2PO4 · 2H2O i 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. Dodaj dH2O do 1 L i mieszaj ~ 2 h. Doprowadzić do pH 7,4 za pomocą 1 N NaOH i przechowywać w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć ten 10-krotny roztwór podstawowy w stosunku 1/10 za pomocądH2O, a następnie uzyskać 0,1% Triton X-100 w PBS.
    2. Przygotować roztwór hydrożelu (pH 7,5) przez zmieszanie 4% (wag./obj.) roztworu paraformaldehydu (PFA), 4% (wag./obj.) akrylamidu, 0,05% (wag./obj.) bisakryloamidu i 0,25% (wag./obj.) inicjatora VA-044 w podwójnie destylowanej wodzie na lodzie.
    3. Przygotować roztwór klarujący (pH 8,5), mieszając 200 mM buforu boranu sodu zawierającego 4% (wag./obj.) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie podwójnie destylowanej.
  2. Perfuzja przezsercowa i przygotowanie jajników
    1. Utrzymuj wszystkie roztwory na lodzie podczas wszystkich zabiegów.
    2. Znieczulić dorosłą samicę myszy C57BL/6 typu dzikiego wstrzyknięciem dootrzewnowym roztworu pentobarbitalu (0,35 mg/kg). Gdy nie wykaże reakcji na uszczypnięcie palca, mysz jest odpowiednio znieczulona.
    3. Użyj taśmy klejącej, aby przymocować mysz z kończynami rozciągniętymi na płaskiej płycie piankowej.
    4. Odsłoń serce przez nacięcie wyrostka mieczykowatego przez klatkę piersiową, skórę i kości nożyczkami.
    5. Wykonać nacięcie w prawym przedsionku zwierzęcia, a następnie przetoczyć lewą komorę 20 ml lodowatego 1x PBS przy 10 ml / min.
    6. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z co najmniej 20 ml roztworu hydrożelu o stężeniu 10 ml/min.
    7. Naciąć nożyczkami skórę nad brzuchem wzdłuż linii przyśrodkowo-brzusznej, która odsłania całą enterocelię, i usunąć jelita. Zbierz jajniki, a także macicę, aby zachować integralność morfologii jajników.
    8. Usuń tkankę tłuszczową wokół jajnika pod mikroskopem.
  3. odgazowywanie
    1. Umieścić jajniki w 10 ml roztworu hydrożelu w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia przez 3 dni.
    2. Przenieś jajnik do probówki o pojemności 5 ml i napełnij probówkę roztworem hydrożelu. Rozciągnij parafilm na górnej części tuby, a następnie owiń parafilm wokół szyjki tuby.
      Uwaga: Upewnij się, że między parafilmem a roztworem hydrożelu nie ma pęcherzyków.
    3. Umieścić probówkę na wytrząsarce w inkubatorze w temperaturze 37 °C na maksymalnie 3 godziny, aby umożliwić polimeryzację hydrożelu.
    4. Usuń jajnik z żelu za pomocą szpatułki i ostrożnie usuń nadmiar żelu z okolic jajnika za pomocą bibuły. Umyj jajnik cztery razy za pomocą 1x PBS.
  4. Rozliczanie pasywne
    1. Zanurz jajnik w 10 ml roztworu oczyszczającego. Delikatnie wstrząsnąć z prędkością 80 obr./min w temperaturze 37 °C, aby rozpocząć proces oczyszczania.
    2. W pierwszym tygodniu zmieniaj roztwór co 3 dni. Po tygodniu odświeżaj roztwór oczyszczający raz w tygodniu, aż jajnik stanie się czysty. Zwykle proces ten trwa około 2-3 tygodni.
      UWAGA: Jajnik może być bezpośrednio wybarwiony immunologicznie lub może być przechowywany w azydku sodu (0,02%) w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni przed barwieniem immunologicznym.

2. Barwienie immunologiczne

  1. Przemyć jajnik dwukrotnie w PBST w dniu 1 w temperaturze 37 °C na shakerze.
  2. Inkubować jajnik na wytrząsarce w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych/PBST (Tabela 1) w 2-3 dniu w temperaturze 37 °C. W prezentowanej pracy pierwszorzędowymi przeciwciałami były cząsteczka adhezji komórek płytkowo-śródbłonkowych 1 (CD31) i hydroksylaza tyrozynowa rozcieńczona odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:50 w PBST.
    Uwaga: Jeśli stosuje się dwa lub więcej rodzajów przeciwciał pierwszorzędowych, upewnij się, że istnieją różne źródła pochodzenia zwierzęcego.
  3. Przeciwciała pierwszorzędowe zmyć buforem PBST w temperaturze 37 °C w dniu 4 na shakerze.
  4. Inkubować jajnik z pożądanymi przeciwciałami drugorzędowymi w PBST w dniu 5-6 w temperaturze 37 °C na wytrząsarce. W prezentowanej pracy przeciwciałami drugorzędowymi były Alexa Flour 488 dla hydroksylazy tyrozynowej i Alexa Flour 594 dla CD31 rozcieńczonej w stosunku 1:50 w PBST.
  5. Zmyć przeciwciała drugorzędowe buforem PBST w temperaturze 37 °C w dniu 7 na shakerze.
  6. Przenieś tkankę do roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła w celu homogenizacji indeksu refrakcji w 8 dniu. Połóż chusteczkę na papierze z liniami siatki, aby sprawdzić jej przejrzystość wizualną, sprawdzając, czy linie siatki są widoczne. Gdy tkanka zostanie w pełni oczyszczona, można ją zobrazować.
  7. Wykonaj cylinder szpachlowy, który mógłby po prostu otoczyć tkankę, a następnie uformuj go w kształt podkowy i mocno dociśnij zewnętrzny grzbiet do szkiełka szkiełkowego, aby uzyskać szczelną przestrzeń. Wysokość szpachli powinna być nieco wyższa niż jajnik.
  8. Ostrożnie umieść oczyszczony jajnik w środku szpachli i dodaj roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła. Mocno przyłóż naczynie ze szklanym dnem na kit i użyj szpachli do zamocowania naczynia.

3. Mikroskopia konfokalna

  1. Do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego w panelu "Ni-E" wybierz soczewkę (w tym przypadku soczewkę obiektywową 25X zanurzoną w wodzie, 1.1-NA, 2 mm-WD) o odpowiedniej odległości roboczej (w tym przypadku 2.0 mm).
  2. W panelu "Akwizycja" wybierz liczbę kanałów. Tutaj użyj trzech kanałów.
    1. Najpierw użyj zakładki "port oka" i joysticka kontrolera XY, aby przesunąć tkankę do środka pola, sprawdzając przez okulary mikroskopu.
    2. Po wyłączeniu światła migawki kliknij zakładkę "na żywo", aby dostosować "moc lasera", "HV (wzmocnienie)" i "przesunięcie" dla każdego kanału osobno. Wyższa moc lasera i HV mogą prowadzić do wyższych sygnałów, a wyższe przesunięcie może zmniejszyć szum tła.
    3. Wybierz odpowiedni "Rozmiar skanowania" i "Liczba". Użyj rozmiaru skanu 1024 x 1024μm2 i liczby od 4 do 8.
  3. Po ustawieniu jakości obrazu w celu zdefiniowania głębokości tkanki w panelu "Korekcja intensywności Z" i po umieszczeniu soczewki na najwyższej warstwie jajnika (w środku tkanki) i dostosowaniu akwizycji dla górnej warstwy, kliknij przycisk "plus", aby zdefiniować górną warstwę.
    1. Przesuń soczewkę w dół i ustaw odpowiednią moc HV i lasera dla dolnej części tkanki i dodaj informacje o najniższej warstwie do tabeli korekcji intensywności Z. Kliknij "Do ND", aby zsynchronizować ustawienie z panelem "Akwizycja ND".
  4. W panelu "Akwizycja ND" najpierw ustaw liczbę kroków skanowania. Następnie zaznacz zakładki "Z" i "Duży obraz".
    1. Przejdź do okna "Skanuj duży obraz", aby zdefiniować rozmiar pola zgodnie z granicą tkanki za pomocą wizualizacji tkanek przez okulary. Wróć do panelu "Akwizycja ND", aby wprowadzić rozmiar obszaru skanowania ("pól") i wybrać nakładanie się od 10% do 15%.
    2. Kliknij "Uruchom korekcję Z", a nie "Uruchom teraz", aby automatycznie ustawić odpowiednią wartość HV, moc lasera i przesunięcie dla każdej warstwy i poczekać, aż obraz zostanie przetworzony.

4. 3D Rekonstrukcja poszczególnych mieszków włosowych i ich naczyń krwionośnych

  1. Najpierw użyj ImageJ5, aby otworzyć oryginalny plik sieciowej usługi informacyjnej. Kliknij przycisk "Obraz" i wybierz "Kolor" i "Podziel kanały". Następnie kliknij "Plik" i osobno zapisz kanały jako serie plików tiff, korzystając z opcji "Sekwencje obrazów" w "Zapisz jako".
  2. Użyj Imaris, aby otworzyć jedną z serii plików tiff. Kliknij przycisk "Edytuj" i wybierz "Dodaj kanały", aby dodać pozostałe kanały. Nazwę i kolor kanału można zmienić w zakładkach "Regulacja wyświetlania". Grubość tkanki może wymagać korekty w panelu "Właściwości obrazu" na liście rozwijanej w sekcji "Edycja".
  3. Aby przyciąć 3D końcowe obrazy i usunąć nadmiar części, kliknij przycisk "Edytuj" i wybierz "Przytnij 3D". Rozmiar pola można dostosować, przeciągając obramowanie.
  4. Aby zrekonstruować sygnały naczynia za pomocą algorytmu Filaments w panelu Surpass, kliknij przycisk "Filamenty", aby utworzyć nowy filament i kliknij dalej.
    1. Aby zdefiniować największą i najcieńszą średnicę, przejdź do panelu "Plaster" i znajdź naczynie śledzące. Odległość zostanie automatycznie pokazana w panelu "Zmierz" po wybraniu dwóch punktów na maksymalnej szerokości statku.
    2. Wróć do panelu "Przekrocz" i wprowadź zmierzoną szerokość, a następnie kliknij Dalej.
  5. Dostosuj próg punktu początkowego i początkowego. W panelu "Kamera" wybierz "Wybierz". Jeśli niektóre z automatycznie utworzonych kul muszą zostać usunięte, naciśnij Shift i kliknij punkt. Wybierając opcję "Nawiguj" i poruszając myszą, można obrócić strukturę, aby upewnić się, że wszystkie właściwe punkty zostały zachowane, a następnie kliknąć przycisk Dalej.
  6. Wybierz najwyższy próg dla lokalnego kontrastu i kliknij przycisk Dalej. Nie wybieraj opcji "Wykryj kolce" i kontynuuj finalizację rekonstrukcji cylindra naczynia krwionośnego. Kolor można edytować, klikając zakładkę "Kolor". Dane statystyczne można pobrać w panelu "Statystyka" zrekonstruowanego filamentu. Nadmiarowe części można usunąć w panelu "Edycja".
    UWAGA: Inne algorytmy mogą być używane do pomiaru objętości całkowitych mieszków włosowych lub ścian mieszków włosowych. W prezentowanej pracy oocyty zostały oznaczone przez autofluorescencję obu przeciwciał drugorzędowych. Ze względu na dużą ilość danych, do analizy danych wykorzystano serwer stacji roboczej.

5. Analiza statystyczna

UWAGA: Dane analizy obrazu są przedstawiane jako średnie ± standardowych błędów.

  1. Wykonaj porównania między pęcherzykami za pomocą testu t dla niezależnej próbki i użyj testu korelacji Pearsona, aby porównać współczynniki korelacji ściany pęcherzyka i długości naczyń włosowatych. Ustaw wartość P <0,05 jako granicę istotności statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostosowaliśmy pasywną metodę CLARITY do szybkiej i prostej metody pasywnego oczyszczania jajników, zachowując jednocześnie architekturę pęcherzyków i naczyń krwionośnych oraz uzyskując najwyższy sygnał fluorescencyjny z oznakowanych markerów naczyń i mieszków włosowych. Architektura 3D naczyń pęcherzykowych została określona przez barwienie immunologiczne dla CD31, markera komórek śródbłonka6. Barwienie CD31 w jajnikach dorosłych myszy prześledzono za pomocą algor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu prezentujemy obrazowanie 3D w celu oceny zależności między naczyniami włosowatymi a poszczególnymi rosnącymi pęcherzykami. W naszej poprzedniej pracy przy użyciu tego samego protokołu 9 badaliśmy role dużego naczynia krwionośnego, interakcji między pęcherzykami i lokalizacji pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy. Pasywne podejście CLARITY pozwoliło nam na zbadanie mikro- i makronaczyniowości, folikulogenezy oraz wzajemnych powiązań między ciałkami żółtymi a pęcherzykami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z Chińskiego Specjalnego Funduszu dla Postdoców (nr 2014T70392 dla YF), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81673766 dla YF), New Teacher Priming Fund, Fundacji Zuoxue Uniwersytetu Fudan oraz Projektu Rozwoju Shanghai Peak Disciplines-Integrative Medicine (20150407).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AkrylamidVetec v900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Mąka Alexa 488 (rozcieńczenie 1:50) Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Mąka Alexa 594 (rozcieńczenie 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisakryloamidAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Naczynie ze szklanym dnem o czarnych ściankach (Willco-Dish)Ted Pella14032
http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall Kwas borowySinopharm Odczynnik chemiczny10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Wodorofosforan disodowy dwunastowodny (Na2HPO4 12H2O)Odczynnik chemiczny Sinopharm10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldehydSinopharm Chemical Odczynnik80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, cząsteczka adhezji komórek płytkowo-śródbłonkowych 1 (rozcieńczenie 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Fotoinicjator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Azydek soduSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
Chlorek sodu (NaCl)Odczynnik chemiczny Sinopharm10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Dihydrofosforan sodu dwuwodny (NaH2PO4 2H2O)Sinopharm Odczynnik chemiczny 20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Odczynnik chemiczny Sinopharmdodecylosiarczan sodu30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Wodorotlenek sodu (NaOH)Odczynnik chemiczny Sinopharm10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Odczynnik chemiczny Sinopharm30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Hydroksylaza tyrozyny (TH, rozcieńczenie 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810(2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673(2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013(2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628(2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895(2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Passive CLARITYMouse Ovary3D ReconstructionVascular ArchitectureMultiphoton Confocal MicroscopyImmunostaining CD31Follicular CapillariesHydrogel FixationTissue ClearingImage Analysis

Powiązane artykuły