Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Podsumowanie

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Streszczenie

Nowa generacja bezkomórkowych systemów transkrypcyjno-translacyjnych (TXTL), zaprojektowana tak, aby miała większą wszechstronność i modułowość, zapewnia nowe możliwości wykonywania podstawowych i stosowanych nauk w reakcjach probówkowych. W ciągu ostatniej dekady bezkomórkowy TXTL stał się potężną techniką dla szerokiego zakresu nowatorskich multidyscyplinarnych obszarów badawczych związanych z biologią ilościową i syntetyczną. Nowe platformy TXTL są szczególnie przydatne do konstruowania i badania systemów biochemicznych poprzez wykonywanie syntetycznych lub naturalnych obwodów genowych. Metody in vitro Projekt TXTL okazał się wygodny w szybkim prototypowaniu elementów regulatorowych i sieci biologicznych, a także w rekapitulacji mechanizmów samoorganizacji molekularnej występujących w organizmach żywych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób zakaźne bakteriofagi, takie jak MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) i T7 (dsDNA), są w całości syntetyzowane z ich genomu w reakcjach jednogarnkowych przy użyciu Escherichia coli, bezkomórkowego systemu TXTL. Syntezę trzech colifagów określa się ilościowo za pomocą testu płytki nazębnej. Pokazujemy, w jaki sposób wydajność zsyntetyzowanego faga zależy od ustawień biochemicznych reakcji. Stłoczenie molekularne, emulowane przez kontrolowane stężenie PEG 8000, wpływa na ilość syntetyzowanych fagów o rzędy wielkości. Opisujemy również, jak amplifikować fagi i jak oczyszczać ich genomy. Zestaw protokołów i wyników przedstawionych w tej pracy powinien zainteresować multidyscyplinarnych badaczy zajmujących się bezkomórkową biologią syntetyczną i bioinżynierią.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, technologia ekspresji bezkomórkowej została opracowana z myślą o nowych zastosowaniach w powstających multidyscyplinarnych obszarach badawczych związanych z biologią syntetyczną i ilościową. Pierwotnie używane do ekspresji białek niezależnie od żywego organizmu, nowe bezkomórkowe systemy TXTL zostały opracowane zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych^1,2, znacznie rozszerzając zakres tej technologii. Nowa generacja platform TXTL została zaprojektowana tak, aby była przyjazna dla użytkownika, bardziej wydajna (osiągająca 2 mg/ml syntezy białek w trybie wsadowym³), bardziej wszechstronna na poziomie transkrypcji⁴ oraz modułowa, aby łatwo integrować nowe naturalne lub syntetyczne funkcje, które rozszerzają możliwości istniejących systemów biologicznych^5,6. W szczególności bezkomórkowe systemy TXTL stały się przydatne do szybkiego prototypowania programów genetycznych, takich jak elementy regulatorowe lub małe obwody genetyczne^7,8,9, skracając cykl projektowania, budowy i testowania do kilku dni. Co ciekawe, nowe systemy TXTL są również zdolne do przetwarzania dużych programów DNA, takich jak pełna synteza colifagów^10,11, wykazując wystarczająco silne wyniki, aby wspierać rekonstrukcję aktywnych żywych istot kodowanych w genomowym DNA.

TXTL oferują wiele zalet technicznych w porównaniu z tradycyjnymi konstruktywnymi testami biochemicznymi in vitro. Bezkomórkowy TXTL łączy proces ekspresji genów z produktem końcowym w zredukowanym i otwartym środowisku, w przeciwieństwie do złożonej cytoplazmy żywej komórki. TXTL wykorzystuje DNA do rekonstrukcji systemów biochemicznych in vitro, co dzięki nowoczesnym technikom składania DNA jest niedrogie i szybkie, a także nie wymaga wymagających wymagających rygorystycznych etapów oczyszczania białek. Ekspresja bezkomórkowa zapewnia bezpośredni dostęp do większości składników w reakcjach biochemicznych, umożliwiając w ten sposób głębszą analizę oddziaływań molekularnych¹². W reakcji TXTL można dowolnie zmieniać ustawienia biochemiczne i biofizyczne, co jest prawie niemożliwe w żywej komórce. Biorąc pod uwagę te zalety i ostatnie ulepszenia, technologia TXTL staje się coraz bardziej popularna jako alternatywna platforma dla biologii syntetycznej i ilościowej. Podczas gdy społeczność badawcza korzystająca z TXTL szybko się rozwija, a TXTL staje się standardową technologią w bioinżynierii, konieczne jest zrozumienie, w jaki sposób korzystać z takich platform, aby opracować odpowiednie praktyki związane z przeprowadzaniem reakcji TXTL i interpretacją wyników.

W tym artykule opisujemy, jak używać systemu TXTL składającego się wyłącznie z E. coli do syntezy, w reakcjach jednogarnkowych, bakteriofagów z ich genomu¹¹, takich jak MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) i T7 (dsDNA, 40 kb). Pokazujemy, jak ilość syntetyzowanych fagów zmienia się w odniesieniu do niektórych ustawień biochemicznych reakcji (stężenia magnezu i potasu). Stłoczenie molekularne, emulowane przez szereg stężeń PEG 8000, ma dramatyczny wpływ na syntezę fagów w ciągu kilku rzędów wielkości. Realizacja tak dużych układów biochemicznych w reakcjach z pojedynczą probówką, które jednocześnie podsumowują procesy transkrypcji, translacji i samoorganizacji, jest interesująca dla odpowiedzi na podstawowe pytania związane z biologią i biofizyką¹⁰ (regulacja genów, samoorganizacja), a także dla rozwoju zastosowań, takich jak zmiana przeznaczenia funkcji fagów do budowy nowych nanostruktur¹³. Oprócz praktycznej wiedzy na temat TXTL zapewniamy metody amplifikacji fagów, ekstrakcji i oczyszczania genomu oraz kwantyfikacji fagów za pomocą testu płytki nazębnej. Metody przedstawione w tym manuskrypcie są odpowiednie dla badaczy, którzy używają systemów bezkomórkowych opartych na ekstrakcie z E. coli i są zainteresowani bakteriofagami.

Protokoły przedstawione w tej pracy można podsumować w następujący sposób: 1) Amplifikacja fagów (Dzień 1: przygotowanie komórek inokulacyjnych, dzień 2: pojedyncza płytka, wzrost i koncentracja wielu fagów, a dzień 3: oczyszczanie faga), 2) Ekstrakcja dwuniciowego DNA genomu (ekstrakcja fenolem/chloroformem), oraz 3) Bezkomórkowa reakcja fagowa i eksperyment z mianem (Dzień 1: płytki z komórkami gospodarza i wykonanie płytek agarowych, Dzień 2: Reakcja bezkomórkowa i wstępna hodowla komórek gospodarza oraz Dzień 3: Hodowla komórek gospodarza i miano faga).

Protokół

UWAGA: Następujące etapy amplifikacji i metody ekstrakcji są w dużej mierze uogólnione dla wielu dwuniciowych fagów DNA, np. bakteriofag T7, enterobacteria phage T4, lub enterobacteria phage λ (L). Są one głównie używane do fagów, których genom nie jest łatwo dostępny do zakupu ze źródeł komercyjnych.

1. Amplifikacja fagów

UWAGA: Technika produkcji fagów z pojedynczą płytką i wieloma cyklami (SPMC) jest dobrze opisana dla faga T4 u Chen i wsp.¹⁴ Poniższa metoda amplifikacji fagów i ekstrakcji DNA jest uogólnieniem do użycia z dwuniciowymi fagami DNA E. coli, np. T7, T4 lub L. Ostateczny sukces protokołu w dużej mierze zależy od zdolności wybranego szczepu komórek gospodarza do wytrzymania warunków nadkażenia. Jeśli komórki gospodarza są niestabilne w wyniku nadinfekcji lub nadinfekcja nigdy nie zostanie osiągnięta, a liza nigdy nie zostanie osiągnięta w tej krytycznej fazie, najlepiej jest postępować zgodnie z protokołem lizy konfluentnej. Obejmuje to oddzielanie resztek komórkowych poprzez wirowanie z dużą prędkością oraz granulowanie fagów z prędkościami ultrawirowania. Wszystkie poniższe warunki i parametry mają służyć jako ogólny punkt wyjścia. Optymalne warunki dla lokalnej linii komórkowej gospodarza mogą być różne; Określ i przestrzegaj odpowiednich warunków.

1. Przygotowanie komórek inokulacyjnych
   1. Zaszczepić 10 ml pożywki Luria-Bertani (LB) w probówce hodowlanej o pojemności 15 ml komórkami gospodarza E. coli, np. B lub K12.
   2. Umieścić w shakerze ustawionym na 250 obr./min i temperaturze 37 °C. Pozostawić na noc do nasycenia.
2. Jednopłytkowy, wielocyklowy wzrost i koncentracja fagów
   1. Aby przygotować płytkę z właściwymi blaszkami fagowymi, należy ogrzać kilka płytek z agarem LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub przez noc.
   2. Przygotuj kilka rozcieńczeń materiału fagowego (np. T7, T4 lub L) o znanym stężeniu w pożywce LB, dążąc do ~10^{2-10 3} fagów / ml.
   3. Do każdej płytki dodać 100 μl nocnego wzrostu skoncentrowanych komórek gospodarza.
   4. Wybrać objętości przygotowanych rozcieńczeń fagowych odpowiadające zakresowi od 10-100 fagów/płytkę. Dodać wymaganą objętość rozcieńczeń fagów do każdej płytki (np. 100 μL z 10³ fagów/ml; powinno to wytworzyć ~100 blaszek). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i rozpocząć odliczanie czasu (+ 0 h). Inkubować przez 4-5 godzin.
   5. Przygotować 49 ml pożywki LB w kolbie o pojemności 250 ml i umieścić w wytrząsarce obrotowej ustawionej na 250 obr./min i 37 °C.
   6. Po + 2,5 h rozcieńczyć komórki 50x, dodając 1 ml nasyconej hodowli komórkowej z nocnego wzrostu do wstępnie ogrzanej kolby zawierającej 49 ml pożywki LB. Gdy komórki osiągną logarytmiczny wzrost (+ 4-5 godzin), zmierz absorbancję przy 600 nm (OD₆₀₀). Określ stężenie komórek, stosując konwersję OD₆₀₀ wynoszącą 1,0 = 8 x 10⁸ komórek/ml.
   7. Rozcieńczyć do 2 x 10⁷ komórek/ml za pomocą dodatkowych pożywek wzrostowych LB. Wyjąć z inkubatora płytkę agarową zawierającą blaszki fagowe. Natychmiast użyj końcówki sterylnej pipety Pasteura do rdzenia i usuń pojedynczą płytkę nazębną. Wdmuchnąć płytkę nazębną do rozcieńczonych komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 2 godziny (+ 6-7 godzin).
   8. Przetestuj pełną infekcję, pobierając próbkę o objętości 500 μl do probówki o pojemności 1,5 ml, dodając 10 μl chloroformu (CHCL₃) i natychmiast wirując z dużą prędkością. Obserwuj, czy roztwór się wyjaśnił. Gdy komórki zostaną w pełni zainfekowane, inkubować przez kolejne 2 godziny (+ 8-9 godzin).
      UWAGA: Jeśli komórki są w pełni zainfekowane, szybko ulegną lizie (<2 min) i wyjaśnią roztwór. Inne wyniki są rozważane w sekcji Dyskusja poniżej. Komórki zostaną nadkażone, ale do tego momentu nie ulegną lizie. Jeśli rozpocznie się liza, dodawanie DNazy i zbiór przez wirowanie muszą rozpocząć się natychmiast, aby zapobiec degradacji fagów.
   9. Dodać DNazę do 5 μg/ml i odwirować komórki w temperaturze 8 000 x g w temperaturze 4 °C do osadu. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 10 ml 1x TRIS chlorek magnezu (TM) (50 mM Tris o pH 7,8, 10 mM MgCl₂) bufor z 5 μg/ml DNazy. Dodaj 500 μl CHCL₃ i wiruj z dużą prędkością, aby zlizować komórki. Klarować przez odwirowanie w stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Oczyszczanie fagów

UWAGA: Oczyszczanie sacharozy jest w dużej mierze zależne od wielkości faga. Konieczne będzie rozważenie masy faga, który ma zostać wyizolowany, i przeprowadzenie korekt w warunkach gradientu. Końcowe miana wirusa powyżej^10-13 fagów/ml są łatwo osiągalne za pomocą tej metody.

1. Przygotować 12 ml 5% i 45% w/v sacharozy w 1x bufor TM.
2. Przygotuj 4x 5-45% gradienty sacharozy, pipetując 2,5 ml 45% sacharozy do 4 probówek ultrawirówek. Na wierzch z ~ 2,6 ml 5% sacharozy, zatrzymując się, gdy płyn dotrze 2 mm od krawędzi tuby.
   UWAGA: Umieść końcówkę pipety w kontakcie z powierzchnią roztworu sacharozy i bardzo powoli dozuj płyn. Lżejszy roztwór sacharozy będzie unosił się na cięższym, tworząc wyraźną granicę. Prawidłowo ułożone warstwowo rozwiązanie będzie miało interfejs ~1 mm, jeśli będzie trzymane pod światło tła.
3. Mieszaj gradienty przez obrót rury przechylnej za pomocą przyrządu do formowania gradientu przez 43 s pod kątem 86° przy 23 obr./min. Jeśli nie jest to natychmiast potrzebne, przykryć folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć 500 μl z wierzchu każdego przygotowanego gradientu sacharozy za pomocą pipetora o pojemności 1 ml i zrównoważyć z dokładnością do ± 0,002 g.
5. Zebrać zawiesiny fagów ze wszystkich probówek (krok 1.2.9). Za pomocą pipety o pojemności 1 ml dodać 500 μl zawiesiny, doprowadzając końcówkę do powierzchni cieczy i bardzo powoli dozując objętość na wierzch gradientu sacharozy, uważając, aby nie wymieszać się w szybkim pipetowaniu. Wirować przy 70 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Zrównoważyć przygotowane gradienty z dokładnością do ± 0,002 g. Mniejsze fagi mogą potrzebować do 1 godziny.
6. Usuń pasma fagowe za pomocą sterylnej strzykawki i kaniuli.
   UWAGA: Patrząc z boku, pasmo faga będzie grube i mleczne w porównaniu z otoczeniem, około 5 mm wysokości i będzie znajdować się w połowie wysokości probówki wirówkowej.
   1. Zanurz kaniulę w roztworze, aż końcówka znajdzie się wyśrodkowana na samej górnej krawędzi pasma faga. Usunąć opaskę, pociągając za tłok strzykawki, aż do usunięcia większości pasma faga.
7. Dodaj objętość sacharozy z zawieszonym fagiem do 3-4 probówek ultrawirówek. Dodać nie więcej niż 1,5 ml / probówkę. Napełnij do ~3-4 mm od góry rurki zimnym 1x TM. Przykryj folią parafinową i odwróć do wymieszania. Umieścić z powrotem w ultrawirówce i wirować w temperaturze 145 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C do osadzania. Mniejsze fagi mogą potrzebować do 2 godzin.
8. Szybko odlej supernatant i odcedź do góry nogami na jednorazowych chusteczkach. Wytrzyj wnętrze probówki sterylnym bawełnianym wacikiem, aby usunąć nadmiar supernatantu.
9. Podzielić 200-400 μL zimnego 1x TM na wszystkie granulki i ponownie zawiesić na noc w temperaturze 4 °C; nie jest wymagane wstrząsanie.
   UWAGA: Jeśli osad nie jest czysty, np. żylaste kawałki błony, DNA itp., Połącz i wykonaj dodatkowe odwirowanie w mikrowirówce przy 17 000 x g.
10. Dzień przed wyznaczeniem miana należy przygotować na noc posiew komórek gospodarza E. coli w 10 ml pożywki LB i pozostawić na noc w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 250 obr./min i temperaturze 37 °C. Inkubować odpowiednią ilość płytek hodowlanych w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed uzyskaniem miana stada fagowego.
    UWAGA: Liczba płytek do inkubacji zależy od liczby rozcieńczeń materiału fagowego, który ma być platerowany: każde unikalne rozcieńczenie materiału fagowego wymaga dwóch płytek hodowlanych (np. cztery różne rozcieńczenia materiału fagowego wymagają ośmiu płytek hodowlanych).
11. Przygotuj 100 ml górnego agaru, dodając 2,5 g LB i 0,6 g bakto-agaru do butelki o pojemności 100 ml. Rozpuść ciała stałe w wodzie dejonizowanej w objętości 100 ml i przeprowadź w autoklawie. Po autoklawie powoli odwróć butelkę 6-8 razy, aby homogenizować agar w całym roztworze. Umieść butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C na 15-20 minut, aby wyrównać temperaturę.
12. Przygotować seryjne rozcieńczanie zapasów fagów roztworem LB.
    1. Dodaj 990 μL LB do 10 μl bulionu fagowego w celu 100-krotnego rozcieńczenia. Wirować do homogenizacji. Aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia 10, dodaj 100 μl materiału fagowego do 900 μL LB. Vortex w celu homogenizacji.
    2. Powtórz powyższą serię rozcieńczeń tyle razy, ile jest to konieczne, aby uzyskać policzalną liczbę blaszek (10-100 blaszek).
       UWAGA: Aby to osiągnąć, należy rozcieńczyć materiał fagowy o 2-3 rzędy wielkości mniej niż oczekiwana wydajność faga pod względem reakcji/ml. Na przykład, jeśli dany zapas fagów zawiera 10¹¹ zakaźnych fagów/ml, należy pokryć go fagiem w rozcieńczeniu 10,^8-krotnym lub 10,^9-krotnym.
13. Przygotować obszar do miana fagów, składając 14 ml probówek hodowlanych (liczba probówek hodowlanych jest równa liczbie rozcieńczeń podstawowych fagów, które mają być posiane). Rozcieńczone próbki podstawowe fagów z kroku 2.12 i komórki bakteryjne gospodarza z kroku 2.10 umieścić na lodzie.
14. Przygotować mieszankę wzorcową, pipetując 5,25 ml górnego agaru (etap 2.11), 220 μl rozcieńczonych próbek fagów (etap 2.12) i 50 μl komórek bakteryjnych gospodarza (etap 2.10) do probówki hodowlanej o pojemności 14 ml. Zakryj probówkę hodowlaną i wiruj z dużą prędkością.
    1. Pozostały roztwór fagowy należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
15. Wyjąć dwie płytki hodowlane (krok 2.10) z inkubatora w temperaturze 37 °C. Powoli dodawaj 2,5 ml mieszanki wzorcowej na środek pierwszej płytki (bez pęcherzyków). Delikatnie obróć płytkę ręcznie, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę wzorcową, tak aby obejmowała całą płytkę hodowlaną. Powtórz z drugą płytką. Odczekaj 20 minut, aby upewnić się, że górny agar zastygnie. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 4-7 godzin.
16. Policz blaszki i określ stężenie fagów dla każdej próbki reakcyjnej.
    UWAGA: Blaszki pojawią się jako przezroczyste kółka o średnicy 1-2 mm w nieprzezroczystym dywanie komórek gospodarza. Zobacz Rysunek 1, aby uzyskać reprezentatywne wyniki. Udana produkcja fagów spowoduje końcowe stężenia 10^{12-10 13} fagów/ml.

3. Ekstrakcja dwuniciowego DNA genomu

UWAGA: Etapy rozcieńczania, wstrząsania i wirowania muszą być zoptymalizowane, aby wytworzyć grubą, stałą warstwę graniczną białka między fenolem a fazą wodną. W ten sposób powstają genomy o najwyższej czystości, które są wolne od zanieczyszczeń białkowych. Początkowe rozcieńczenie zależy od końcowego miana faga. Stado fagów o bardzo wysokim mianie (≥10¹³ fagów / ml) może wymagać 10-20-krotnego rozcieńczenia przed ekstrakcją, podczas gdy zapasy o niskim mianie (~ 10^{10-10 11} fagów / ml) mogą wymagać tylko 2-krotnego lub żadnego. Jeśli trudno jest utworzyć stałą warstwę białka w kolejnych etapach lub zawiesina wodna jest zbyt lepka, aby nadawała się do pracy ze względu na wysokie stężenie DNA, należy rozważyć większe rozcieńczenie zapasów fagów przed kontynuowaniem ekstrakcji. Na każdym etapie przetwarzania genomu ważne jest, aby używać końcówek do pipet o szerokim otworze podczas pipetowania jakichkolwiek faz wodnych. Wiele genomów fagów jest dość dużych i łatwo ulega fragmentacji poprzez ścinanie pipet. Ponadto należy wyraźnie unikać wszelkich wirów, ponieważ spowoduje to poważne ścinanie genomów.

1. Rozcieńczyć porcję materiału fagowego od etapu 2,9 do 400 μl 1x buforem TM w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać równą objętość Tris:Fenol:Chloroform do rozcieńczenia. Delikatnie potrząsaj mieszaniną na laboratoryjnym bujaku lub ręcznie przez 5 minut. Powstałą emulsję odwirować w temperaturze 17 000 x g w wirówce stołowej przez 5-10 minut
   UWAGA: Na powierzchni leżącej poniżej fazy fenolowej znajduje się wyraźna, biała warstwa białka.
3. Usuń górną fazę wodną do nowej rurki, uważając, aby nie naruszyć granicy międzyfazowej.
4. Powtórz kroki 3.2-3.3 dodatkowo 2 razy, aby uzyskać w sumie 3 ekstrakcje fenolowe. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki i dodać równą objętość_{CHCl 3}. Wstrząsnąć i odwirować (krok 3.2). Przenieś wodną próbkę DNA do czystej probówki.
5. Oszacuj objętość oczyszczonego DNA. Dodać 0,4 objętości 3 M octanu sodu (_CH3COONa) i 3 objętości 95% etanolu (EtOH). Umieścić w zamrażarce w temperaturze -20 °C do nocnego wytrącenia. Wirować przy 17 000 x g w wirówce stołowej przez 10-15 min.
   UWAGA: DNA natychmiast się odwodni i stanie się widoczne jako masa w zawiesinie w probówce. Prawidłowo powstały granulat jest biały i dobrze upakowany na dnie tuby.
6. Usunąć i odrzucić sklarowany nad osadem przez dekantację lub pipetowanie. Dodaj 500 μl 70% EtOH i delikatnie potrząśnij probówką, aż osadek uwolni się od dna probówki. Wirować przy 17 000 x g przez 5 min. Usuń i wyrzuć EtOH, uważając, aby nie naruszyć osadu.
7. Powtórz krok 3.6. Suszyć pellet na powietrzu na blacie przez 30-60 minut. Dodać 50 μl ddH₂O do osadu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w celu ponownego zawieszenia. Oznaczyć stężenie DNA za pomocą pomiarów absorpcji przy 280 nm.
   UWAGA: Oczekiwane stężenia to 0,5-5 μg/μL przy użyciu tej techniki. Podziel przez całkowitą masę cząsteczkową genomu, aby określić końcowe stężenie genomu.

4. Bezkomórkowa reakcja fagowa i eksperyment z mianem fagów

1. Przygotuj 25 g pożywki LB i 15 g bakto-agaru stałego, przelej do butelki o pojemności 1 litra i dodaj wodę dejonizowaną do 1 litra autoklawu.
2. Po sterylizacji odwróć butelkę powoli 6-8 razy, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków. Odwrócenie butelki spowoduje homogenizację agaru w całym 1 litrowym roztworze. Umieścić butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 58 °C na 20 minut przed wylaniem na płytki hodowlane.
3. Gdy temperatura roztworu LB-agar się wyrówna, przygotuj płomień obok płytek hodowlanych, aby wysterylizować środowisko w pobliżu otwartych płytek hodowlanych. Przechowywać butelkę o pojemności 1 l w łaźni wodnej, aby uniknąć zestalenia się agaru podczas przygotowywania porcji. Dodać 25 ml do płytki hodowlanej o wymiarach 100 mm x 15 mm. Z 1 litra wyprodukuje się 40 płytek hodowlanych.
4. Odłożyć jedną płytkę hodowlaną na bok i pozostawić do zestalenia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej; płytka ta zostanie użyta do posiewu komórek gospodarza. Pozostawić pozostałe 39 płytek hodowlanych do zestalenia się przez 2 dni w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub natychmiast użyć do wytworzenia miana.
5. Płytki na komórki gospodarza należy umieścić na płytce z odpowiednim szczepem bakteryjnym (np. gospodarzem B dla T7), który był przechowywany w temperaturze -80 °C, na płytce do hodowli LB-agar. Smuga obok otwartego ognia, aby uniknąć zanieczyszczenia środowiska. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Komórki gospodarza nie mają oporności na antybiotyki, dlatego niezbędna jest praca w sterylnym środowisku.
6. Reakcja bezkomórkowa
   UWAGA: Bezkomórkowe reakcje TXTL składają się w 33% z surowego ekstraktu z E. coli (8,9-9,9 mg / ml białka), a pozostałe 67% składa się z bufora reakcyjnego i genomu faga. Surowy ekstrakt przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem^15,16. Końcowe warunki reakcji to: 8,9-9,9 mg/ml białka (z surowego ekstraktu), 3-6 mM Mg-glutaminianu, 40-100 mM K-glutaminianu, 2-4% PEG 8000, 3-4 mM każdego aminokwasu, przygotowanego zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁷, oraz roztwór miksu energetycznego, opisany wcześniej¹⁵, złożony z 0,33-3,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP i GTP, 0,9 mM CTP i UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0,068 mM kwasu folinowego, 1 mM spermidyny i 30 mM 3-PGA. Fagi typu DNA wymagają stężeń genomu 0,5-10 nM, a fagi typu RNA wymagają zakresu 50-150 nM. Końcowe stężenia reakcji są unikalne dla konkretnego syntetyzowanego faga i mieszczą się w zakresach opisanych powyżej. Aby zapewnić optymalne natlenienie reakcji, końcowe objętości reakcji powinny wynosić od 10 do 20 μl. Istnieją niewielkie różnice w protokole reakcji, które zależą od postaci cząsteczki genomowej. Na przykład cząsteczki liniowego genomu wymagają dodatkowego składnika w reakcji, aby zahamować trawienie liniowych fragmentów DNA przez enzym recBCD obecny w surowym ekstrakcie.
   1. Wypełnić sekcję "Szczegółowe informacje o reakcji" w tabeli 1 (PhageTXTL_JOVE), wprowadzając całkowitą liczbę reakcji i końcową objętość reakcji.
   2. Zaprojektuj eksperyment, określając stałe i zmienne składniki reakcji. Wpisać ułamkowy procent objętościowy mieszanki wzorcowej, który jest stosunkiem całkowitej objętości stałych składników reakcji do iloczynu końcowej objętości reakcji i liczby próbek. Wprowadź zapasy i końcowe stężenia odczynników reakcyjnych w sekcji "Receptura reakcji Master Mix" w PhageTXTL_JOVE. Wpisać podstawowe i końcowe stężenia zmiennych(-ych) odczynnika(-ów), który ma być badany.
      UWAGA: Objętości składników reakcji zostaną automatycznie obliczone na podstawie objętości mieszanki wzorcowej i końcowej objętości każdej pojedynczej reakcji.
   3. Wyjąć niezbędną ilość probówek (wskazanych w sekcji "Probówki do rozmrażania" w PhageTXTL_JOVE.xlsx) surowego ekstraktu komórkowego, mieszanki energetycznych i mieszanki aminokwasów z temperatury -20 °C lub -80 °C i rozmrozić na lodzie.
      UWAGA: Po rozmrożeniu połącz wiele porcji podobnych składników (jeśli to konieczne).
   4. Podwielokrotność wskazanej objętości ekstraktu surowego, 33% końcowej objętości reakcji, do probówki mikrowirówkowej.
   5. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z tabelą 1. Homogenizuj wszystkie składniki zgodnie z "Recepturą reakcji Master Mix" przez wirowanie. Dodać odpowiednią objętość każdego składnika do ekstraktu surowego.
   6. Jeśli pracujesz z fagiem z liniowym genomem DNA (np. T7), dodaj 1 μM białka gam bakteriofaga lambda do reaction¹¹. Wirować, aby homogenizować roztwór i umieścić reakcję na lodzie na 5 minut. Hamuje to trawienie liniowych fragmentów DNA przez kompleks recBCD, który jest endogenny w surowym ekstrakcie.
   7. Po dodaniu ostatniego składnika zgodnie z tabelą 1 homogenizować reakcję przez wirowanie. Podziel mieszankę wzorcową na n probówek do mikrowirówek.
      UWAGA: Objętość każdego rozszczepienia jest iloczynem procentowej objętości ułamkowej mieszanki głównej i końcowej objętości reakcji. Na przykład dla ułamkowej zawartości głównej wynoszącej 90% i końcowej objętości reakcji wynoszącej 12 μl, objętość każdego rozszczepienia wynosi 10,8 μl.
   8. Dodaj wskazane objętości składników zmiennych do głównej tablicy mieszania (patrz Tabela 1). Dodaj wodę do każdej reakcji, aby osiągnąć pożądaną końcową objętość reakcji. Homogenizuj każdą reakcję przez wirowanie. Inkubować probówki do mikrowirówek w temperaturze 29 °C przez co najmniej 8 godzin lub przez noc.
7. Hodowla wstępna komórek gospodarza
   UWAGA: Nocna hodowla wstępna jest rozcieńczana w stosunku 50:1, aby upewnić się, że komórki gospodarza użyte w eksperymencie z mianem znajdują się w środkowej fazie logarytmicznej, co zwiększa skuteczność infekcji. Komórki środkowego logarytmu są następnie ponownie zagęszczane 10-krotnie i przechowywane na lodzie.
   1. Za pomocą sterylnej końcówki pipety zaszczepić probówkę hodowlaną o pojemności 5 ml LB 3-5 zdrowymi koloniami komórek gospodarza. Pracuj przy otwartym ogniu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
   2. Inkubować probówkę hodowlaną w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 250 obr./min przez 16 godzin lub przez noc. Komórki mogą osiągnąć fazę nasycenia następnego dnia.
8. Hodowla komórek gospodarza i przygotowanie próbki do miana faga
   1. Dozować 50 ml LB do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml i przykryć folią aluminiową. Ogrzewać kolbę w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
   2. Podwielokrotność 1 ml komórki gospodarza przez noc należy wstępnie wyhodować do wstępnie ogrzanego LB. Inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C i wstrząsać przy 250 obr./min.
   3. Odwirować 50 ml kultury komórek gospodarza przez 10 minut przy 5 000 x g. Wyrzucić LB.
   4. Zawiesić osad z zimnym (4 °C) 5 ml LB i trzymać na lodzie.
   5. Na godzinę przed rozpoczęciem doświadczenia z mianem inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Każda unikalna reakcja fagowa (i odpowiadający jej współczynnik rozcieńczenia) wykorzystuje dwie płytki. Dodatkowo inkubuj 4 płytki do kontroli eksperymentalnych (patrz Rysunek 1 dla reprezentatywnych kontroli pozytywnych i negatywnych).
   6. Przygotuj 100 ml górnego agaru (krok 2.11).
9. Przygotować seryjne rozcieńczenie reakcji bezkomórkowej roztworem LB, jak opisano w sekcji 2.12.
10. Miano fagów
    UWAGA: Układanie na talerzu należy rozpocząć po inkubacji szalek hodowlanych przez co najmniej 1 godzinę, a górny agar znajdował się w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C przez 15-20 minut po wyjęciu z autoklawu.
    1. Mianować końcowy roztwór LB reakcji bezkomórkowej zgodnie z opisem w sekcji 2, kroki 2.14-2.16.

Wyniki

Pokazujemy cztery reprezentatywne wyniki. W Rysunek 1, prezentujemy zestaw kontroli negatywnych, aby upewnić się, że bezkomórkowy system TXTL i zapasy DNA fagów nie są zanieczyszczone żywymi komórkami E. coli. Sprawdzamy, czy bezkomórkowy system TXTL jest wolny od nienaruszonego zanieczyszczenia komórkami E. coli, posiewając zarówno nieinkubowany, jak i inkubowany roztwór reakcyjny pozbawiony genomowego DNA (Rysunek 1

Dyskusja

Podążając za techniką Chen i wsp.¹⁴ W przypadku SPMC krytyczny etap jest osiągany przy określaniu właściwych warunków nadkażenia. Parametrem, który najściślej kontroluje zdolność szczepu gospodarza do wytrzymania nadkażenia, jest często początkowe stężenie infekującego faga. Komórki gospodarza muszą znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu przed początkowym zakażeniem bardzo małą ilością faga. W końcu również osiągnie wzrost logarytmiczny, a celem jest umożliwienie liczbom fagów szybk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do ultrawirowania	Beckman Coulter	344057
Rurki stożkowe	Falcon	352070
Ekspres do gradientów	BioComp Gradient Master	patrz Anal Biochem. 1985 lipiec; 148(1):254-9.
Monojekt strzykawkowy i kaniula		8881513918 i 888202017
Końcówki do pipet o szerokim otworze	Fischerbrand	02-707-134
Licznik płytek nazębnych	Nowy Brunszwik Naukowy	licznik kolonii Model C-110
Probówki hodowlane	Fischerbrand	14-961-33
System bezkomórkowy	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB receptura			agarowej 25 g/L podłoża Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents numer produktu BP1426) i 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - numer produktu 214010).