Artykuł metodologiczny

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

DOI:

10.3791/56146

⸱

7 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wolne od kseno-ksenów i w pełni zdefiniowane warunki są kluczowymi parametrami dla solidnego i powtarzalnego generowania jednorodnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS). Utrzymanie komórek hiPS na komórkach zasilających lub niezdefiniowanych matrycach jest podatne na odchylenia partii, zanieczyszczenie patogenne i ryzyko immunogenności. Wykorzystanie zdefiniowanej rekombinowanej ludzkiej matrycy lamininy 521 (LN-521) w połączeniu z preparatami bezksenograficznymi i zdefiniowanymi pożywkami zmniejsza zmienność i pozwala na spójne wytwarzanie komórek hiPS. Wektor wirusa Sendai (SeV) jest nieintegrującym się systemem opartym na RNA, co pozwala uniknąć obaw związanych z potencjalnym destrukcyjnym wpływem, jaki mogą mieć wektory integrujące integralność genomu. Co więcej, wektory te wykazały stosunkowo wysoką skuteczność w przeprogramowywaniu fibroblastów skóry. Ponadto enzymatyczne pasażowanie pojedynczych komórek ułatwia utrzymanie jednorodności komórek hiPS bez znacznego wcześniejszego doświadczenia w hodowli komórek macierzystych. W tym miejscu opisujemy protokół, który został gruntownie przetestowany i opracowany z naciskiem na odtwarzalność i łatwość użycia, zapewniając solidny i praktyczny sposób generowania zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów ludzkich komórek hiPS z fibroblastów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od pierwszego wyprowadzenia linii komórkowych hiPS przez Takahashi et al.1,2, komórki hiPS dostarczyły użytecznego narzędzia do modelowania chorób, odkrywania leków oraz jako materiał źródłowy do generowania terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej3. Hodowla komórek hiPS od dawna jest zależna od kohodowli z komórkami odżywiającymi fibroblasty4,5 lub od Matrigel6 oraz z preparatami zawierającymi płodową surowicę bydlęcą (FBS). Różnice między partiami są częstą konsekwencją niezdefiniowanego charakteru tych warunków hodowli, co skutkuje nieprzewidywalnymi zmianami, co jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do zawodności tych protokołów7. Opracowanie zdefiniowanych pożywek, takich jak Essential 8 (E8)8 i zdefiniowanych matryc hodowli komórkowych, na przykład LN-5219, pozwala na ustanowienie wysoce powtarzalnych protokołów i pomoc w solidnym generowaniu i utrzymywaniu jednorodnych komórek hiPS7,8,9,10.

Rozwój technik przeprogramowania bez integracji był krokiem naprzód. Pierwotnie, przeprogramowanie polegało na wektorach retrowirusowych, które losowo integrowały się z genomem, powodując destrukcyjny wpływ na integralność genomu11. Postępy w metodologiach przeprogramowywania obejmują rozwój wektorów opartych na RNA. Wektory RNA mają przewagę nad metodą przeprogramowania opartą na DNA, ponieważ niezamierzona integracja poprzez rekombinację genomową nie jest możliwa12. Wektory SeV zapewniają wysoką i przejściową ekspresję czynników egzogennych poprzez jednoniciowy RNA bez fazy DNA11. Wektory przeprogramowania dostarczane przez SeV są rozcieńczane podczas ekspansji komórki i ostatecznie zrzucane z hodowli, zapewniając sposób przeprogramowania bez odcisków stopy. Następnie utrzymanie pluripotencji zależy od endogennej ekspresji genów pluripotencji2.

Ponieważ pionierskie terapie oparte na komórkach hiPS zaczynają przechodzić do badań klinicznych, wymagania dotyczące standaryzowanych partii, odtwarzalności i bezpieczeństwa są podstawowymi kwestiami do rozwiązania13. Dlatego należy unikać produktów pochodzenia zwierzęcego. Na przykład stosowanie produktów ksenogenicznych wiąże się z ryzykiem zanieczyszczenia patogenami innymi niż ludzie. Wykazano również, że komórki hodowane w obecności składników hodowli pochodzenia zwierzęcego zawierają nieludzkie kwasy krzemiakowe do błon komórkowych, co grozi powstaniem pochodnych komórek immunogennych14. W związku z tym konieczność wyeliminowania produktów ksenogenicznych jest niezbędna dla wszelkich przyszłych badań klinicznych. W protokole tym stosuje się hodowlę wolną od ksenotypów i zdefiniowaną w celu utrzymania komórek hiPS, przybliżając komórki do zgodności klinicznej.

Ten protokół opisuje spójną, wysoce powtarzalną i łatwą w użyciu metodę, która generuje standaryzowane komórki hiPS z fibroblastów. Oferuje również przyjazny dla użytkownika system hodowli do utrzymania ustalonych komórek hiPS. Protokół ten został wykorzystany do wyprowadzenia ponad 300 linii komórkowych hiPS w szwedzkim narodowym ośrodku iPS Core w Karolinska Institutet, z których niektóre linie zostały wcześniej opisane15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbiór materiału pacjenta i pochodzenie komórek hiPS zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki, Sztokholm, 28 marca 2012, Numer rejestracyjny: 2012/208-31/3. Etapy hodowli komórkowej powinny być wykonywane w komorach bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej. Podczas pracy z komórkami należy zawsze stosować techniki sterylnego obchodzenia się z nimi. Przed rozpoczęciem poczekaj, aż pożywka, płytki i odczynniki osiągną temperaturę pokojową. Inkubować komórki w temperaturze 37 oC, 5% CO2 w wysokiej wilgotności.

1. Izolacja ludzkich fibroblastów z biopsji skóry

  1. Preparaty pożywki hodowlanej, enzymów trawiennych, powlekania naczyń i narzędzi preparacyjnych.
    1. Przygotować pożywkę z fibroblastami: 44,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 500 μl penicyliny/streptomycyny (PEST) (patrz Tabela 1), przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować enzymy trawienne w stężeniu roboczym 1 mg/ml: zważyć porcje 4 mg proszku dispazy i kolagenazy typu I w oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml i rozpuścić w 4 ml DMEM/F12 + 1% PEST. Wysterylizuj roztwór enzymatyczny, przepuszczając go przez sitko o wielkości 0,22 μm. Za każdym razem przygotowuj świeże roztwory enzymatyczne.
    3. Pokryj jedną studzienkę 6-dołkową płytką do hodowli tkankowej (lub 35-milimetrowym naczyniem do hodowli tkankowej) na biopsję, wypreparowaną 1 ml 0,1% żelatyny w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    4. Autoklawuj jeden zestaw nożyczek chirurgicznych i kleszczy na biopsję w celu wypreparowania.
  2. Postępowanie z biopsją
    UWAGA: Biopsje należy wykonywać tak szybko, jak to możliwe po ich pobraniu. Przechowywać w PBS + 1% PEST do 48 godzin w temperaturze 4 °C. Biopsja powinna mieć średnicę 2 - 4 mm i być zgodna z zezwoleniami etycznymi.
    1. Przenieś biopsję do naczynia o średnicy 35 mm. Przenieś biopsję do nowej płytki o średnicy 35 mm i zanurz biopsję w 2 ml 70% etanolu na 30 sekund.
    2. Przenieś biopsję do trzeciego naczynia o średnicy 35 mm i przemyj 1 ml sterylnego roztworu soli Hanka (HBSS) uzupełnionego 1% PEST.
    3. Przenieść biopsję do czwartego naczynia o średnicy 35 mm, dodać 1 ml świeżo przygotowanego 0,1% roztworu dyspazy.
    4. Pokrój biopsję skóry na 1 - 2 mm3 kawałki w naczyniu za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy, a następnie przenieś kawałki biopsji, w tym roztwór dyspazy, do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj dodatkowe 2 ml dypazy.
    5. Opłucz naczynie o średnicy 35 mm 1 ml roztworu do dyspazy i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.
    6. Inkubować biopsję w temperaturze 4 °C przez noc.
    7. Dodać 4 ml 0,1% kolagenazy I do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    8. Odwirować strawione komórki 300 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić trawienie w 2 ml pożywki fibroblastowej.
    9. Usunąć roztwór żelatyny z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Przenieść zawiesinę komórkową wraz z pozostałymi kawałkami na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej (lub 35-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej) wstępnie pokrytą 0,1% żelatyną w DPBS.
    10. Zmieniaj podłoże co trzeci dzień.
  3. Ekspansja ludzkich fibroblastów
    UWAGA: Fibroblasty są gotowe do przejścia do kolby do hodowli tkankowej T25 (25 cm2), gdy zlewają się w 80% (Rysunek 2B). Fibroblasty zazwyczaj osiągają 80% konfluencji w ciągu 7 dni. Jednak wymagany czas może się znacznie różnić, ale nie powinien być dłuższy niż 4 tygodnie.
    1. Odessać pożywkę i przemyć raz 2,5 ml DPBS.
    2. Usunąć DPBS i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki będą miały zaokrąglone krawędzie i zaczną się odrywać.
    3. Dodać 2 ml pożywki z fibroblastami, w razie potrzeby przepłukać komórki, zapewniając prawidłowe rozłączenie komórek. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki fibroblastowej i płytki fibroblastów w niepowlekanej kolbie T25 do hodowli tkanek komórkowych. Podczas rozszerzania fibroblastów po tym etapie zdysocjuj zgodnie z powyższym opisem i zasiaj 12 x 103 komórek/cm2.
    5. Gdy zlewające się komórki są gotowe do zamrożenia, rozpręż się lub płytka do przeprogramowania. Zamrozić dwie rundy fibroblastów przed rozpoczęciem jakiegokolwiek przeprogramowania (patrz następna sekcja, aby zapoznać się z procedurą zamrażania). Wydajność przeprogramowania jest na ogół wyższa w przypadku fibroblastów o niższym pasażu, komórki w pasażu 2 - 4 są optymalne. Jednak przy użyciu tego protokołu przeprowadzono udane przeprogramowanie fibroblastów do pasażu 10.
  4. Zamrażanie i rozmrażanie fibroblastów
    1. Przygotuj świeżą pożywkę do zamrażania fibroblastów: 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać w temperaturze 4 °C (Tabela 1). Po zlewaniu się kolba do hodowli tkankowej T25 może zostać zamrożona w trzech kriowialach. Przygotować 500 μl pożywki do zamrażania fibroblastów na zamrożoną fiolkę.
    2. Aby zamrozić komórki, należy je zdysocjować zgodnie z opisem w kroku 1.3, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść porcje 3 x 105 komórek do probówek o pojemności 15 ml. Wirować probówki pod ciśnieniem 300 x g przez 3 min. Odsysać supernatant.
    3. Zawiesić osady komórkowe w 500 μl pożywki do zamrażania fibroblastów o temperaturze 4 °C i przenieść do kriowali. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania i inkubować komórki w temperaturze -80 °C przez 24 godziny przed przeniesieniem ich do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    4. Aby rozmrozić komórki, zanurz dolną część kriowialu w wodzie o temperaturze 37 °C. Po upłynnieniu przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml pożywki fibroblastowej. Wiruj komórki 300 x g przez 3 min.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki z fibroblastami. Przenieść komórki do niepowlekanej kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubować w temperaturze 37 °C.

2. Przeprogramowanie wektorów SeV w fibroblastach

  1. Przygotowanie podwielokrotności wektorowych
    UWAGA: Z SeV należy obchodzić się w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie bezpieczeństwa 2. Zapoznaj się z protokołem producenta i lokalnymi wytycznymi17. Miano wirusa różni się w zależności od partii.
    1. Przed przygotowaniem porcji należy obliczyć ilość wektora potrzebną dla komórek 5 x 104 zgodnie z protokołem producenta (np. CytoTune 2.0). Miano wirusa na ogół waha się od 8 x 107 - 1,5 x 108. Rozmrozić i połączyć wektory 5:5:3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 i hKlf4 = MOI 3). Porcjować ilość obliczoną na przeprogramowanie 5 x 104 komórek do autoklawowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Rozcieńczyć podwielokrotności wirusa pożywką fibroblastów do końcowej objętości 250 μl w celu przeprogramowania.
      UWAGA: Każda fiolka jest ważna do przeprogramowania jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z 5 x 104 fibroblastami. Przechowywać porcje wirusa w temperaturze -80 °C.
  2. Transdukcja wektorowa SeV
    1. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć 1 ml DPBS. Odessać DPBS i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu oderwania komórek.
    2. Dodać 2 ml pożywki z fibroblastami, ponownie zawiesić komórki i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Wirować 300 x g przez 3 min.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki z fibroblastów.
    4. Policz fibroblasty za pomocą hemocytometru i zasiej 5 x 104 komórek w jednym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc.
    5. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych, dodać 250 μl roztworu SeV i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Codziennie zmieniaj pożywkę na świeżą pożywkę fibroblastów. Pozwól transdukowanym komórkom rosnąć przez 7 dni przed przejściem na płytki pokryte LN-521. Płytki LN-521 należy przygotować na dzień przed przejściem. Patrz 2.3.1 dla procedury powlekania.
  3. Powtarzanie transdukowanych fibroblastów
    1. Przygotowanie naczyń powlekanych LN-521: Rozcieńczyć LN-521 w DPBS do końcowego stężenia 0,63 μg/cm2. Odpipetować 2 ml roztworu LN-521 na 60-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej. Uszczelnić 60-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej za pomocą parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj podwielokrotności pożywki Essential 8 (E8) dla łatwiejszej obsługi: 48,5 ml pożywki E8, 1 ml suplementu E8 i 500 μl PEST (Tabela 1).
    3. 7 dni po transdukcji należy przenieść komórki do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm pokrytego LN-521. Dodać 250 μl trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu oderwania się komórek. Dodać 2 ml pożywki fibroblastowej i odwirowywać komórki przez 3 minuty w 300 x g.
    4. Odessać supernatant. Zawiesić osad w 2 ml pożywki fibroblastowej i policzyć komórki w hemocytometrze. Odessać roztwór LN-521 z wstępnie powlekanej płytki i zasiać 4 x 104 komórki w 5 ml pożywki fibroblastowej w naczyniu LN-521 o średnicy 60 mm. Dodać inhibitor kinazy Rho Y-27632 (ROCKi) do końcowego stężenia 5 μM. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    5. Co ważne, następnego dnia należy zmienić pożywkę na pożywkę E8. Zmieniaj podłoże E8 codziennie. Kolonie komórek hiPS pojawią się w ciągu 2-3 tygodni.

3. Wybieranie kolonii i ekspansja komórek hiPS

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane poza kabiną bezpieczeństwa biologicznego pod mikroskopem stereoskopowym. Zaleca się stosowanie siatki na włosy i masek zabiegowych. Pracuj ostrożnie, aby nie zanieczyścić kultury komórkowej.

  1. Przygotuj 24-dołkowe płytki z kulturą tkankową powlekaną LN-521 na dzień przed pobraniem. Rozcieńczyć LN-521 w DPBS 0,63 μg/cm2. Odpipetować 250 μl roztworu LN-521 do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Uszczelnij płyty za pomocą parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Kolonie są gotowe do zbioru, gdy osiągną rozmiar > 1 mm średnicy. Kolonie powinny mieć ostre krawędzie i rosnąć w jednorodnych monowarstwach (Rysunek 2D).
  2. Odessać roztwór LN-521 i dodać 500 μl E8 do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  3. Pokrój kolonie na mniejsze kawałki za pomocą skalpela w siatkę pod mikroskopem stereoskopowym. Mechanicznie zeskrobać arkusze komórek z naczynia i przenieść arkusze za pomocą pipety 200 μl do przygotowanego dołka (Rysunek 2D-2E). Zbieraj kolonie do oddzielnych studni.
  4. Pozwól komórkom przyczepić się bez zmiany podłoża przez 48 godzin. Następnie codziennie zmieniaj podłoże E8
    5. .
  5. Gdy kolonie osiągną wielkość > 5 mm, enzymatycznie pasaż komórki jako pojedyncze komórki do nowego dołka płytki pokrytej LN-521.
  6. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komórek i przemyć 250 μl DPBS.
  7. Odessać DPBS. Dodać 250 μl odczynnika dysocjacyjnego i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
  8. Zauważ, że komórki zaczęły się zaokrąglać. Oderwij komórki od płytki, kilkakrotnie przepłukując je odczynnikiem dysocjacyjnym.
  9. Dodaj 500 μl pożywki E8 do probówki o pojemności 15 ml. Przenieść komórki w odczynniku dysocjacyjnym do probówki i wirować przez 3 minuty przy 300 x g.
  10. Odessać roztwór LN-521 z wstępnie pokrytego LN-521 i dodać 500 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej.
  11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki E8.
  12. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zasiać 2,5 x 104 - 5 x 104 komórki w przygotowanym basenie LN-521 (1,25 x 104 - 2,5 x 104 komórek/cm2). Format hodowli komórkowej można łatwo przeskalować, aby dopasować go do zamierzonego celu.
  13. Dodać ROCKi do końcowego stężenia 10 μM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
  14. Zmieniaj podłoże E8 codziennie. Komórki są zwykle gotowe do przejścia po 4 - 6 dniach. Enzymatycznie pasują komórki jako pojedyncze komórki, jak opisano powyżej, gdy około 90% zlewają się.
    UWAGA: Wektory przeprogramowania są stopniowo rozcieńczane podczas ekspansji komórek hiPS i nie są wykrywalne po przejściu 12. Komórki, które są bezstronnie przeprogramowywane, często przestają się namnażać około pasażu 6 - 10 lub tracą swoją charakterystyczną morfologię pluripotencjalnych komórek macierzystych (Rysunek 3B).
  15. Zamrażanie i rozmrażanie komórek hiPS
    1. Aby zamrozić komórki, enzymatycznie dysocjuj komórki jako pojedyncze komórki, jak opisano powyżej, policz komórki w hemocytometrze i przenieś 2,5 x 105 komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej 1 ml pożywki E8. Wirować przy 300 x g przez 3 min. Odessać supernatant.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl kriopożywki PSC o temperaturze 4 °C i przenieść do kriowiwalu. Umieścić fiolkę w pojemniku do zamrażania i inkubować komórki w temperaturze -80 °C przez 24 godziny przed przeniesieniem ich do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    3. Aby rozmrozić komórki, należy przygotować wstępnie powleczony dołek LN-521 z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, zasysając roztwór LN-521 i dodając 250 μl pożywki E8. Zanurz dolną część kriowialu w wodzie o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały sopel lodu.
    4. Dodać 250 μl pożywki E8 do kriowialu i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodać 1 ml pożywki E8. Wiruj komórki 300 x g przez 3 min.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórkową do przygotowanego dołka i dodać 1% suplementu żywotności komórek lub 10 μM ROCKi. Inkubować płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od biopsji do komórek hiPS

Cały proces od biopsji do ustalonych komórek hiPS, wolnych od wektora przeprogramowania i gotowych do charakterystyki, trwa około 16 tygodni (Rysunek 1). Bardziej szczegółowy harmonogram jest określony w Rysunek 2A. Potrzeba około 4 tygodni na założenie i ekspansję kultur fibroblastów. Pierwsze kolonie komórek hiPS zaczęły pojawiać się około trze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekiwanym rezultatem tego protokołu jest pomyślne wygenerowanie kilku linii komórkowych hiPS pochodzących klonalnie. Co ważne, opisana tutaj metoda utrzymywania i namnażania ustalonych komórek hiPS jest wiarygodna i może być przeprowadzona przy niewielkim wcześniejszym doświadczeniu w hodowli komórek macierzystych. Wiadomo, że enzymatyczne pasażowanie pojedynczych komórek z ROCKi wraz z macierzą LN-521 utrzymuje komórki jako kariotypowo normalne, pluripotencjalne i łatwo zdolne do różnicowania, unikając jednocześnie in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zgłaszania żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez agentów finansujących SSF (B13-0074) i VINNOVA (2016-04134).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DispaseLife Technologies171105-041Trawienie biopsyjne
KolagenazaSigmaC0130Trawienie biopsyjne
ŻelatynaSigmaG1393Macierz fibroblastów
IMDMLife Technologies21980002-032Pożywka fibroblastowa
FBSInvitrogen10270106Podłoże
fibroblastowePenicylina/StreptomycynaLife Technologies15070-063Podłoże Antybiotyk
Niezbędny 8ThermFisher ScientificA1517001Pożywka do hodowli komórkowych iPS
LN-521BiolaminaLN521-03Matryca do hodowli komórkowych iPS
TrypLE select 1XThermoFisher Scientific12563011Odczynnik dysocjacyjny
Inhibitor kinazy Rho Y27632MilliporeSCM075Inhibitor kinazy Rho (ROCKi)
CytoTune – Zestaw do przeprogramowania iPS 2.0Life TechnologiesA1377801Wektor przeprogramowania wirusa Sendai
35 mm naczynie do hodowli tkankowejSarstedt83.3900.300Hodowla komórkowa
60 mm szalki do hodowli tkankowejSarstedt83.3901.300
tkankowej 24 dołki do hodowli komórkowychSarstedt83.3922.300Kolby do hodowli tkankowych
T25VWR734-2311Probówki do hodowli komórkowych
15 mlCorning430791Probówki wirówkowe
Probówka 1,5 mlEppendorf0030123.301Probówka 1,5 ml
CoolCell LXBiocisionBCS-405Pojemnik do zamrażania
DMSOSigmaD2650-100mlZamrażanie fibroblastów
Cryovials 1,8 mlVWR479-6847
Zestaw do kriokonserwacjiGibcoA2644601PSC CryomediumRevitaCell
suplement Trypsin-EDTA (0,05%)ThermoFisherScientific25300054Enzym dysocjacji fibroblastów
DMEM/F12Life Technologies31331-028Rozcieńczalnik
DPBSLife Technologies14190-094PBS
HBSSThermoFIsher Scientific14025-050Przygotowanie do biopsji
HemocytometrSigmaBRAND, 718920Zliczanie komórek
ParafilmVWR291-1213Płytki uszczelniające do przechowywania
Płytki do hodowli do hodowli komórkowych Cryovials PSC enzymów trawiennych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195(2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wektor wirusa Sendaisystem hodowli wolny od sk adnik w pochodzenia zwierz cegoreprogramowanie fibroblast wprocedura wyizolowania koloniipasa owanie enzymatycznemarkery pluripotencjir nicowanie w cia a embrionalnesk ad zdefiniowanej po ywki

Powiązane artykuły