Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wolne od kseno-ksenów i w pełni zdefiniowane warunki są kluczowymi parametrami dla solidnego i powtarzalnego generowania jednorodnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS). Utrzymanie komórek hiPS na komórkach zasilających lub niezdefiniowanych matrycach jest podatne na odchylenia partii, zanieczyszczenie patogenne i ryzyko immunogenności. Wykorzystanie zdefiniowanej rekombinowanej ludzkiej matrycy lamininy 521 (LN-521) w połączeniu z preparatami bezksenograficznymi i zdefiniowanymi pożywkami zmniejsza zmienność i pozwala na spójne wytwarzanie komórek hiPS. Wektor wirusa Sendai (SeV) jest nieintegrującym się systemem opartym na RNA, co pozwala uniknąć obaw związanych z potencjalnym destrukcyjnym wpływem, jaki mogą mieć wektory integrujące integralność genomu. Co więcej, wektory te wykazały stosunkowo wysoką skuteczność w przeprogramowywaniu fibroblastów skóry. Ponadto enzymatyczne pasażowanie pojedynczych komórek ułatwia utrzymanie jednorodności komórek hiPS bez znacznego wcześniejszego doświadczenia w hodowli komórek macierzystych. W tym miejscu opisujemy protokół, który został gruntownie przetestowany i opracowany z naciskiem na odtwarzalność i łatwość użycia, zapewniając solidny i praktyczny sposób generowania zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów ludzkich komórek hiPS z fibroblastów.
Wprowadzenie
Od pierwszego wyprowadzenia linii komórkowych hiPS przez Takahashi et al.1,2, komórki hiPS dostarczyły użytecznego narzędzia do modelowania chorób, odkrywania leków oraz jako materiał źródłowy do generowania terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej3. Hodowla komórek hiPS od dawna jest zależna od kohodowli z komórkami odżywiającymi fibroblasty4,5 lub od Matrigel6 oraz z preparatami zawierającymi płodową surowicę bydlęcą (FBS). Różnice między partiami są częstą konsekwencją niezdefiniowanego ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zbiór materiału pacjenta i pochodzenie komórek hiPS zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki, Sztokholm, 28 marca 2012, Numer rejestracyjny: 2012/208-31/3. Etapy hodowli komórkowej powinny być wykonywane w komorach bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej. Podczas pracy z komórkami należy zawsze stosować techniki sterylnego obchodzenia się z nimi. Przed rozpoczęciem poczekaj, aż pożywka, płytki i odczynniki osiągną temperaturę pokojową. Inkubować komórki w temperaturze 37 oC, 5% CO2 w wysokiej wilgotności.
1. Izolacja ludzkich fibroblastów z biopsji skóry
- Preparaty pożywki hodowlanej, en....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Od biopsji do komórek hiPS
Cały proces od biopsji do uzyskania ustabilizowanych komórek hiPS, pozbawionych wektora reprogramującego i gotowych do charakterystyki, trwa około 16 tygodni (Rysunek 1). Bardziej szczegółowy harmonogram przedstawiono na Rysunku 2A. Ustanowienie i namnożenie kultur fibroblastów zajmuje około 4 tygodni. Pierwsze kolonie komórek hiPS zaczęły pojawi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Oczekiwanym rezultatem tego protokołu jest pomyślne wygenerowanie kilku linii komórkowych hiPS pochodzących klonalnie. Co ważne, opisana tutaj metoda utrzymywania i namnażania ustalonych komórek hiPS jest wiarygodna i może być przeprowadzona przy niewielkim wcześniejszym doświadczeniu w hodowli komórek macierzystych. Wiadomo, że enzymatyczne pasażowanie pojedynczych komórek z ROCKi wraz z macierzą LN-521 utrzymuje komórki jako kariotypowo normalne, pluripotencjalne i łatwo zdolne do różnicowania, unikając jednocześnie in.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zgłaszania żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez agentów finansujących SSF (B13-0074) i VINNOVA (2016-04134).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Trawienie biopsyjne |
| Kolagenaza | Sigma | C0130 | Trawienie biopsyjne |
| Żelatyna | Sigma | G1393 | Macierz fibroblastów |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Pożywka fibroblastowa |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Podłoże |
| fibroblastowePenicylina/Streptomycyna | Life Technologies | 15070-063 | Podłoże Antybiotyk |
| Niezbędny 8 | ThermFisher Scientific | A1517001 | Pożywka do hodowli komórkowych iPS |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | Matryca do hodowli komórkowych iPS |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Odczynnik dysocjacyjny |
| Inhibitor kinazy Rho Y27632 | Millipore | SCM075 | Inhibitor kinazy Rho (ROCKi) |
| CytoTune – Zestaw do przeprogramowania iPS 2.0 | Life Technologies | A1377801 | Wektor przeprogramowania wirusa Sendai |
| 35 mm naczynie do hodowli tkankowej | Sarstedt | 83.3900.300 | Hodowla komórkowa |
| 60 mm szalki do hodowli tkankowej | Sarstedt | 83.3901.300 | |
| tkankowej 24 dołki do hodowli komórkowych | Sarstedt | 83.3922.300 | Kolby do hodowli tkankowych |
| T25 | VWR | 734-2311 | Probówki do hodowli komórkowych |
| 15 ml | Corning | 430791 | Probówki wirówkowe |
| Probówka 1,5 ml | Eppendorf | 0030123.301 | Probówka 1,5 ml |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | Pojemnik do zamrażania |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Zamrażanie fibroblastów |
| Cryovials 1,8 ml | VWR | 479-6847 | |
| Zestaw do kriokonserwacji | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell |
| suplement Trypsin-EDTA (0,05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Enzym dysocjacji fibroblastów |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Rozcieńczalnik |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Przygotowanie do biopsji |
| Hemocytometr | Sigma | BRAND, 718920 | Zliczanie komórek |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Płytki uszczelniające do przechowywania |
Bibliografia
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
