Artykuł metodologiczny

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56153

⸱

6 października 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Streszczenie

W mózgu, synapsy są wyspecjalizowanymi połączeniami między neuronami, określającymi siłę i rozprzestrzenianie się sygnalizacji neuronalnej. Liczba synaps jest ściśle regulowana podczas rozwoju i dojrzewania neuronów. Co ważne, deficyty liczby synaps mogą prowadzić do dysfunkcji poznawczych. Dlatego ocena liczby synaps jest integralną częścią neurobiologii. Ponieważ jednak synapsy są małe i bardzo zwarte w nienaruszonym mózgu, ocena liczby bezwzględnej jest trudna. Protokół ten opisuje metodę łatwej identyfikacji i oceny synaps w wycinkach hipokampa gryzoni za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Obejmuje trzyetapową procedurę oceny synaps w wysokiej jakości obrazach mikroskopii konfokalnej poprzez analizę kolokalizacji białek pre- i postsynaptycznych w wycinkach hipokampa. Wyjaśnia również, w jaki sposób przeprowadzana jest analiza i podaje reprezentatywne przykłady zarówno z synaps pobudzających, jak i hamujących. Protokół ten stanowi solidną podstawę do analizy synaps i może być stosowany do wszelkich badań badających strukturę i funkcję mózgu.

Wprowadzenie

Ludzki mózg składa się z około 1014 synaps. Liczba synaps jest ściśle regulowana podczas rozwoju i dojrzewania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W trakcie rozwoju liczba synaps jest modulowana przez synaptogenezę i przycinanie w celu utworzenia funkcjonalnych sieci neuronowych. Uczenie się i pamięć są wspierane przez regulację liczby i siły synaps, proces znany jako wzmocnienie synaps i depresja1. Co ważne, stabilizacja dojrzałych synaps jest niezbędna do utrzymania połączeń sieci neuronalnych. Ponadto deficyty gęstości synaps odnotowano we wczesnych stadiach chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD)2. Dlatego zdolność do dokładnej identyfikacji i oceny liczby synaps ma fundamentalne znaczenie dla oceny fizjologii i patologii mózgu.

Ekstremalna gęstość i zwarta natura synaps sprawiają, że trudno jest oszacować ich dokładną liczbę w nienaruszonych obszarach mózgu. Synapsy chemiczne w OUN składają się z dwóch neuronów znajdujących się w bliskim sąsiedztwie, oddzielonych szczeliną synaptyczną cleft3. Zakończenie presynaptyczne lub bulon synaptyczny wyłania się z aksonu i składa się z nagromadzonych pęcherzyków, które zawierają neuroprzekaźniki określające specyficzność synapsy - a mianowicie glutaminian i kwas gamma-aminomasłowy (GABA) odpowiednio dla synaps pobudzających i hamujących. Błony pęcherzyków zawierają transportery pęcherzykowe specyficzne dla każdego neuroprzekaźnika: pęcherzykowy transporter glutaminianu (vGlut) dla glutaminianu i pęcherzykowy transporter GABA (vGAT) dla GABA. Zakończenie postsynaptyczne jest bardzo gęstą strukturą złożoną z wielu białek, w tym receptorów, cząsteczek adhezyjnych i białek rusztowania. W synapsach pobudzających, białko post-synaptycznej gęstości-95 (PSD-95) jest najliczniejszym białkiem rusztowania4, modulując pobudzającą funkcję receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA-) i α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA-), podczas gdy gefiryna zakotwicza receptory hamujące w hamującym zakończeniu postsynaptycznym 5. Ogólnie rzecz biorąc, specyficzność białek dla przedziałów pre- i postsynaptycznych pomaga w różnicowaniu i identyfikacji podtypów synaps.

Ocena liczby synaps może być przeprowadzona za pomocą różnych technik. Najczęściej stosuje się mikroskopię elektronową (EM), która umożliwia analizę synapsy w zwartych i nienaruszonych obszarach mózgu z dużym powiększeniem i rozdzielczością. Technika ta jest jednak bardzo kosztowna, wymaga skomplikowanego przygotowania próbki i jest bardzo czasochłonna. Inne techniki obejmują wykorzystanie tomografii matrycowej6, która ma główną wadę polegającą na tym, że wymaga specjalistycznego i drogiego sprzętu do przeprowadzenia analizy. Co więcej, linie transgeniczne wyrażające specyficzne markery synaptyczne są przydatne w ocenie liczby synaps7, ale generowanie nowych linii może być restrykcyjne i kosztowne, a nadekspresja białek może skutkować niepożądanymi fenotypami poza celem.

Ze względu na te ograniczenia i dla uproszczenia, wielu badaczy ocenia liczbę synaps, badając całkowite poziomy białek synaptycznych. Jednak utratę synaps można zaobserwować przed istotnymi zmianami w białku, ponieważ strukturalna przebudowa synaps powoduje rozproszenie pre- lub post-synaptycznej apozycji, bez degradacji białek synaptycznych. Co więcej, w chorobie Alzheimera poziom białek synaptycznych jest obniżony w wyniku degeneracji synaps lub śmierci neuronów8,9. Kwantyfikacja całkowitych poziomów nie umożliwia takiego rozróżnienia. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania niezawodnej, dostępnej i dokładnej metody oceny liczby synaps w mózgu.

W tym artykule opisujemy, jak dokładnie zidentyfikować i określić liczbę synaps za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. Synapsy są definiowane przez kolokalizację markerów pre- i postsynaptycznych, które pojawiają się w rozkładzie punktowym. Wykazujemy zasadność tej techniki poprzez badanie sygnalizacji Wnt w mózgu. Wnt są wydzielanymi białkami ważnymi dla tworzenia, eliminacji i utrzymania synaps. Indukcja in vivo wydzielanego antagonisty kaskady Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), prowadzi do pobudzającej utraty synaps przy jednoczesnym zachowaniu synaps hamujących w hipokampie10. Ilustrujemy identyfikację i liczbę synaps pobudzających i hamujących w wycinkach hipokampa od dorosłej myszy wykazującej ekspresję Dkk1 i podkreślamy możliwość przeniesienia tej techniki na inne rodzaje preparatów tkankowych / hodowlanych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem myszy i szczurów zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z procedurami Schedule 1 w ramach ustawy Home Office Animals (Scientific Procedures) act 1986. Skład sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) znajduje się w Tabeli 1.

1. Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa

  1. Jak najszybciej wyciąć mózg myszy, używając szpachelki i ostrych nożyczek do przecięcia czaszki, a następnie umieścić go w lodowatym, napowietrzonym (95% O2, 5% CO2) ACSF o wysokiej zawartości sacharozy (~100 mL).
  2. Umieścić mózg myszy na szalce Petriego, usunąć skalpelem móżdżek oraz niewielki fragment kory przedczołowej, a następnie przeciąć mózg wzdłuż linii środkowej na dwie półkule.
  3. Położyć obie półkule stroną cięcia do dołu i przykleić każdą z nich do stolika wibrotomu.
  4. Wyciąć skrawki o grubości 200 - 300 µm z całego obszaru zainteresowania. W przypadku hipokampa z każdej półkuli powinno uzyskać się około 3 - 4 skrawków.
  5. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieść skrawki do komory zanurzonej w napowietrzonym (95% O2, 5% CO2) ACSF. Inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 min.
    UWAGA: Na tym etapie można przeprowadzić inkubację skrawków z aktywnymi czynnikami farmakologicznymi, takimi jak rekombinowane białka Dkk1, dodając je do komory ze skrawkami.
  6. Wyjąć skrawki z komory za pomocą pędzla, przenieść je do płytki 24-dołkowej i utrwalić przez 20 min do 1 h w 4% paraformaldehydzie (PFA)/4% sacharozie w temperaturze pokojowej (RT).
    Uwaga: PFA jest toksyczny, należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  7. Przemyć skrawki trzykrotnie w 1X PBS (po 10 min każde płukanie).
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać na 1 - 2 dni, pod warunkiem przechowywania skrawków w 1X PBS w temperaturze 4 °C.

2. Immunofluorescencja dla markerów synaptycznych

UWAGA: Składy wszystkich użytych buforów znajdują się w Tabeli 2.

  1. Zastąp PBS buforem blokującym/permeabilizującym (Tabela 2) w dołkach z przekrojami i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 – 6 h.
  2. Rozcieńcz poliklonalne przeciwciało świni domowej przeciwko vGlut1 w stosunku 1:2 000 w buforze blokującym/permeabilizującym.
    UWAGA: vGlut1 jest markerem służącym do wizualizacji presynaptycznych zakończeń pobudzających. Do identyfikacji postsynaptycznych synaps pobudzających należy użyć poliklonalnego przeciwciała przeciwko PSD-95 i rozcieńczyć je 1:500 w tym samym roztworze. W każdym dołku należy zastosować objętość minimum 300 µL. Aby zidentyfikować lokalizację anatomiczną hipokampa, należy użyć przeciwciała, które identyfikuje również strukturę neuronalną, np. MAP2 lub Tubulin. Wyznacz odpowiednie stężenia wszystkich przeciwciał pierwszorzędowych dla wybranych markerów synaptycznych (pre- i postsynaptycznych) i rozcieńcz je w świeżym buforze blokującym/permeabilizującym.
  3. Inkubuj przekroje w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez noc (lub przez 1 – 2 dni) w temperaturze 4 °C. Użyj platformy wytrząsowej z intensywnym ruchem.
  4. Przemyj przekroje trzy razy w PBS (po 10 min każde płukanie).
  5. Rozcieńcz odpowiednie przeciwciała drugorzędowe 1:500 w buforze blokującym. Na przykład, przy użyciu przeciwciała przeciwko vGlut1 od świni domowej, zastosuj przeciwciało drugorzędowe rozpoznające komponent świni domowej (np. osioł anty-świnia domowa) sprzężone ze specyficznym fluoroforem. Przy użyciu przeciwciała przeciwko PSD-95 od królika, zastosuj przeciwciało drugorzędowe rozpoznające komponent królika (np. osioł anty-królik) sprzężone z innym specyficznym fluoroforem.
  6. Inkubuj przekroje w tym roztworze przez 2 – 3 h w temperaturze pokojowej (RT). Upewnij się, że przekroje są chronione przed światłem, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są światłoczułe.
  7. Przemyj przekroje trzy razy w PBS (po 10 min każde płukanie).
  8. Ostrożnie usuń przekroje z płytki 24-dołkowej za pomocą pędzelka i ułóż je równomiernie na uprzednio oznakowanych szkiełkach przedmiotowych. Dodaj kroplę medium montażowego na każdy przekrój, a następnie delikatnie połóż na przekrojach szkiełko nakrywkowe. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Zadbaj o użycie wystarczającej ilości medium montażowego (300-400 µL), ponieważ zbyt mała ilość może doprowadzić do wyschnięcia przekrojów.
  9. Pozostaw do wyschnięcia na minimum 1 – 2 dni w temperaturze pokojowej (RT), przechowując szkiełka w ciemności.
  10. Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C w krótkim terminie, natomiast w przypadku przechowywania długoterminowego przechowuj je w temperaturze -20 °C.

3. Pozyskiwanie i analiza obrazów konfokalnych

  1. Obrazowanie z użyciem konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej.
    1. Zidentyfikować obszar hipokampa do obrazowania (np. cornua ammonis 1 i 3 (CA1, CA3) lub zakręt zębaty (DG)) za pomocą obiektywu 10x lub 20x.
    2. Zmienić obiektyw na 40x lub 63x z imersją olejową, aby upewnić się, że anatomia skrawka jest nienaruszona, identyfikując ciągłe neuryty i zorganizowaną strukturę. Jako punkt odniesienia użyć markera neuronalnego, takiego jak MAP2 (Rycina 1A).
    3. Następnie przełączyć na obiektyw 60x z imersją olejową (NA = ~1.3 - 1.4) i dostosować ustawienia dla każdego kanału, aby uzyskać optymalny sygnał i kontrast. Ustawić intensywność każdego lasera tak, aby uniknąć nasycenia pikseli, korzystając z opcji wysokiego/niskiego kontrastu.
      UWAGA: Ustawienia te będą zależeć od użytego mikroskopu; ustawienia mocy lasera stosowane na Rycini 2, Rycini 3 i Rycini 4 znajdują się w Tabeli materiałów. Dla uzyskania najlepszych wyników należy zastosować rozdzielczość 1024 x 1024 pikseli. Ustawienia powinny pozostać stałe dla różnych warunków w ramach tego samego eksperymentu. W razie potrzeby można zastosować dodatkowe powiększenie.
    4. Ocenić głębokość, na której barwienie jest równomierne, i zebrać stosy obrazów z co najmniej 8 równoodległych (250 nm) płaszczyzn. Następnie wykonać 3 sąsiednie reprezentatywne stosy obrazów z tego samego obszaru zainteresowania na skrawku.
      UWAGA: Głębokość może różnić się między skrawkami, ale powinna wynosić zawsze około 2 - 5 µm od powierzchni skrawka.
    5. Powtórzyć akwizycję w co najmniej 3 skrawkach na warunek i u 6 - 8 zwierząt na grupę traktowaną.
  2. Analiza obrazów.
    UWAGA: Użyć automatycznego oprogramowania do analizy obrazów (patrz Tabela materiałów). Należy pamiętać, że niektóre systemy wymagają licencji, podczas gdy inne są bezpłatne, np. ImageJ. Wykorzystane oprogramowanie musi analizować obrazy w 3D, uwzględniając wszystkie płaszczyzny zebranego stosu. Szczegóły dotyczące oprogramowania użytego do analizy obrazów (Rycina 1) znajdują się w Tabeli materiałów.
    1. Zastosować niestandardowy protokół progu intensywności w celu identyfikacji wszystkich punktów synaptycznych i markerów neuronalnych, które są ręcznie optymalizowane i wybierane w oprogramowaniu [szczegóły dotyczące oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów].
      UWAGA: Oprogramowanie identyfikuje minimalną i maksymalną intensywność dla każdego fluoroforu i przypisuje procent intensywności do każdego rozpoznanego obiektu. Procent intensywności będzie różnić się w zależności od użytego fluoroforu i przeciwciała przeciwko markerowi synaptycznemu.
    2. W przypadku markerów synaptycznych upewnić się, że w oprogramowaniu wybrano filtry wielkości (>0.1µm3 i <0.8µm3) i zastosowano je do obrazu. Dostosować parametry tak, aby wybrane obiekty nie nakładały się na siebie. Wykluczyć wszelkie obiekty, które są zbyt duże lub zbyt małe, aby mogły być uznane za punkty synaptyczne (patrz Rycina 2B).
      UWAGA: Po optymalizacji te same wartości progowe są stosowane do wszystkich obrazów w ramach danego eksperymentu.
    3. Ilościowo określić średnią liczbę, intensywność i objętość poszczególnych punktów synaptycznych (presynaptycznych lub postsynaptycznych), korzystając z zoptymalizowanych protokołów progowych wybranych w oprogramowaniu. Znormalizować liczbę punktów do objętości pola obrazu (w zastosowanym tutaj systemie wynosi ona około 16 928 µm3 ). Znormalizować intensywność punktów synaptycznych do intensywności referencyjnego markera neuronalnego.
      UWAGA: Synapsy definiuje się jako kolokalizację markerów presynaptycznych i postsynaptycznych. Po ustaleniu protokołów progowych dla punktów presynaptycznych i postsynaptycznych, oprogramowanie powinno identyfikować kolokalizację punktów synaptycznych jako nakładanie się jednego lub więcej pikseli w pojedynczej płaszczyźnie.
      UWAGA: Do analizy statystycznej należy potwierdzić, że wszystkie zestawy próbek spełniają warunki normalności rozkładu i jednorodności wariancji, co określono odpowiednio testami Lillieforsa i χ2. Próbki wykazujące rozkład normalny i jednorodność wariancji powinny być analizowane za pomocą testów parametrycznych, zgodnie z poniższym opisem. Na przykład analiza punktów synaptycznych pobudzających powinna być przeprowadzona przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA z blokowaniem i powtórzeniami. Każdy oddzielny eksperyment należy traktować jako blok; zazwyczaj przeprowadza się trzy niezależne eksperymenty, w każdym z 1 - 3 myszami z każdego warunku.

Analiza punktów synaptycznych; progowanie intensywności; ekstrakcja pomiarów; tabela danych; układ eksperymentalny.
Rycina 1: Analiza punktów synaptycznych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.(A) Zrzut ekranu z konfiguracji protokołu progowania intensywności. Przedstawiony przykład dotyczy PSD-95, w którym wybrane punkty mają zdefiniowany rozmiar >0.1 µm3 i <0.8 µm3 oraz charakteryzują się zminimalizowaną liczbą nakładających się obiektów. Należy zauważyć, że pokazany obraz przedstawia jedną płaszczyznę konfokalną, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację punktów synaptycznych i dokładny dobór parametrów. (B) Zrzut ekranu z wyników analizy z oprogramowania (po wyborze zoptymalizowanego protokołu). Przykład surowych pomiarów liczby punktów synaptycznych na podstawie objętości. Wartości te są następnie eksportowane do programu arkusza kalkulacyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy tkanki nerwowej; MAP2, vGlut1; rozkład białek synaptycznych; analiza fluorescencyjna.
Rycina 2: Kontrola jakości skrawka i ustawienia parametrów dla punktów synaptycznych. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne (obiektyw 40x) obszaru zainteresowania: stratum radiatum (sr) i stratum oriens (so) obszaru CA1 skrawka hipokampa zidentyfikowane za pomocą barwienia MAP2. Pasek skali = 2 µm. (B) Obrazy konfokalne (obiektyw 60x i dodatkowe powiększenie 1,3X w oprogramowaniu akwizycyjnym) stratum radiatum obszaru CA1 z markerami pobudzającymi – vGlut1 (zielony) i PSD-95 (czerwony) – ze skrawków hipokampa. Zwrócono uwagę na identyfikację wyraźnych punktów presynaptycznych i postsynaptycznych. Punkty większe niż 0,8 µm3 są wykluczone z kwantyfikacji (białe strzałki). Pasek skali = 2 µm (C) Obrazy konfokalne (obiektyw 60x i dodatkowe powiększenie 1,3X w oprogramowaniu akwizycyjnym) stratum radiatum obszaru CA1 z markerem pobudzającym – vGlut1 (zielony) – z przekrojów hipokampa ciętych w kriotomie z całych mózgów utrwalonych w PFA. Zwrócono uwagę na obecność dużych dziur oraz nieregularnego, grudkowatego barwienia vGlut1. Pasek skali = 2 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki

Utrata synaps występuje we wczesnych stadiach chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) i choroba Parkinsona2,11,12. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych deficytów pozostają słabo poznane. Niedobory sygnalizacji Wnt były wiązane z AD13,14,15,16,17. Białka Wnt są wydzielanymi glikoproteinami i odgrywają kluczową rolę w formowaniu synaps oraz modulacji przekaźnictwa synaptycznego18,19,20,21. Niedawno zidentyfikowaliśmy białka Wnt jako kluczowe regulatory utrzymania synaps w dojrzałym układzie nerwowym10,22. Aby dokładnie zbadać wpływ sygnalizacji Wnt na synapsy w hipokampie myszy modyfikowanych genetycznie, wykorzystaliśmy preparat skrawka mózgu oraz mikroskopię konfokalną do oceny zmian w liczbie synaps. Zidentyfikowano zdrowe skrawki, w których struktura była dobrze zachowana (Ryc. 2A). Ponadto starannie określono kryteria wyboru punktów synaptycznych, wykluczając duże zabarwione obiekty, które prawdopodobnie reprezentowały zagregowane białka (Ryc. 2B). Kryterium to zastosowano do wszystkich obrazów, stosując te same rygorystyczne parametry analizy.

Wykorzystaliśmy transgeniczny model systemowy, który indukuje ekspresję wydzielanego antagonisty Wnt, Dkk1, u dorosłych myszy (iDkk1) pod kontrolą tetracykliny (patrz Tabela materiałów)10,22. Wykazaliśmy, że blokada sygnalizacji Wnt w dorosłym hipokampie wywołuje utratę synaps pobudzających specyficznie w obszarze stratum radiatum pola CA1 (Rycina 3). Rycina 3A przedstawia reprezentatywne obrazy konfokalne presynaptycznych i postsynaptycznych markerów pobudzających (odpowiednio vGlut1 i PSD-95) uzyskane z przekrojów hipokampa myszy iDkk1 wykazujących ekspresję Dkk1 przez dwa tygodnie, a także ich odpowiednich kontroli. Obrazy te przeanalizowaliśmy za pomocą oprogramowania Volocity i stwierdziliśmy znaczną redukcję liczby synaps pobudzających, ilościowo określoną przez kolokalizację punktów znakowanych vGlut1 i PSD-95 w obszarze CA1 hipokampa myszy iDkk1 po dwutygodniowej indukcji Dkk1 (Rycina 3B, *p <0.05; test Kruskala-Wallisa; 6 myszy na genotyp). W stratum radiatum pola CA1 liczba punktów synaps pobudzających na 1 000 µm3 spadła z 500 u myszy kontrolnych do 300 u myszy iDkk1. W przeciwieństwie do tego, indukowana ekspresja Dkk1 nie wpłynęła na liczbę synaps hamujących (identyfikowanych poprzez kolokalizację presynaptycznego i postsynaptycznego markera, odpowiednio vGAT i gefiryny), co pokazano na Rycini 4A-B (p >0.05; test Kruskala-Wallisa; 3 myszy na genotyp).

Co istotne, przeprowadziliśmy analizę mocy statystycznej, aby oszacować odpowiednią liczbę skrawków i zwierząt niezbędnych do uzyskania tych wiarygodnych wyników. Przy użyciu programu R obliczyliśmy, że w celu wykrycia dużego efektu (f = 0,4) z 80% pewnością (moc = 0,8) w jednoczynnikowej analizie ANOVA z blokowaniem i powtórzeniami, opisanej w kroku 3.2.6, wymagane było około 35 skrawków na warunek (3 obrazy x 3 skrawki x 6 zwierząt = 36).

Mikroskopia fluorescencyjna synaps, markery vGlut1 i PSD95, wraz z wykresem słupkowym liczby synaps.
Rycina 3: Utrata synaps pobudzających w skrawkach hipokampa myszy iDkk1. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne stratum radiatum obszaru CA1 pokazują synapsy pobudzające, zidentyfikowane poprzez ko-lokalizację vGlut1 i PSD-95 (białe strzałki). Dolny panel przedstawia powiększenie zaznaczonego prostokąta. Paski skali = 2 µm. (B) Procent synaps pobudzających w grupach kontrolnej i iDkk1 został wyznaczony ilościowo przy użyciu oprogramowania wymienionego w Tabeli materiałów (*p < 0,05; test Kruskala-Wallisa; 6 myszy na genotyp). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rycina została zmodyfikowana na podstawie publikacji10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna białek synaptycznych; wykres słupkowy przedstawia wyniki hamowania synaps.
Rycina 4: Synapsy hamujące nie wykazują zmian w skrawkach hipokampa myszy iDkk1. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne stratum radiatum obszaru CA1, przedstawiające synapsy hamujące zidentyfikowane poprzez ko-lokalizację vGAT i gefiryny (białe strzałki). Dolny panel stanowi powiększenie zaznaczonego prostokąta. Paski skali = 2 µm. (B) Procent synaps hamujących u myszy kontrolnych i iDkk1, ilościowo określony przy użyciu oprogramowania Volocity (p >0,05; test Kruskala-Wallisa; 3 myszy na genotyp). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Składniki ACSF z wysoką zawartością sacharozyStężenieUwagi
NaCl75 mM
NaHCO₃325 mM
KCl2,5 mM
NaH2PO4, 2H2O1,25 mM
Kwas kynurenowy1,25 mM
Kwas pirogronowy2 mM
EDTA0,1 mM
CaCl₂21 mMDodać po napowietrzeniu roztworu
MgCl₂24 mMDodać po napowietrzeniu roztworu
D-glukoza25 mM
Sacharoza100 mM
Składniki ACSF do komory zanurzeniowej
NaCl125 mM
NaHCO3325 mM
KCl2,5 mM
NaH2PO4, 2H2O1,25 mM
CaCl₂21 mMDodać po natlenieniu roztworu
MgCl221 mMDodać po napowietrzeniu roztworu
D-glukoza25 mM

Tabela 1: Skład ACSF.

Bufor blokujący/permeabilizującyStężenieUwagi
Surowica osła10%
Triton-X0.50%
PBS1x
10x PBSpH do 7.4
NaCl1.37 M
KCl27 mM
NaH2PO4100 mM
KH2PO418 mM
4% PFA/4% sacharozypH do 7.4
PBS1xRozcieńczyć z 10x
PFA1.33 M
Sacharoza117 mM

Tabela 2: Bufory użyte do barwienia immunofluorescencyjnego.

Dyskusja

Precyzyjna ocena liczby synaps ma zasadnicze znaczenie w dziedzinie neuronauki. Tutaj pokazujemy, jak ocenić gęstość synaps w regionie warstwy promienistej CA1 wycinków hipokampa jako systemu modelowego. Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod wykazano w naszym niedawnym artykule badawczym na temat wpływu niedoboru Wnt w hipokampie, w którym oceniliśmy również liczbę synaps za pomocą pojedynczego odcinka EM10. Wielkość utraty synaps jest podobna między jednosekcyjnym EM a opisaną tutaj metodą wycinka mózgu10. Tak więc odkrycie to świadczy o dokładności i niezawodności tej techniki.

Co ważne, ograniczeniem zarówno jednosekcyjnych synaps EM, jak i synaps barwiących się immunologicznie, jak przedstawiono tutaj, jest brak możliwości dokładnego oszacowania bezwzględnej liczby synaps dla określonego regionu mózgu. Rzeczywiście, ważne jest, aby zidentyfikować wszelkie globalne zmiany morfologiczne, ponieważ zmiany całkowitej objętości mogą wpływać na liczbę synaptyczną. Innym ograniczeniem jest to, że niektóre przeciwciała są mniej skuteczne w barwieniu nienaruszonych obszarów mózgu, częściowo ze względu na ekstremalną gęstość połączeń synaptycznych. Doświadczyliśmy wyższej jakości barwienia vGlut1 i gefiryny przy użyciu tego preparatu w plastrach, a następnie wiązania PFA przez maksymalnie 1 godzinę, w porównaniu z natychmiastowym utrwaleniem całego mózgu w PFA (Figura 2C). To ostatnie prowadziło do zbitych zabarwień synaptycznych z w tkance. Niemniej jednak penetracja przeciwciał vGlut1 jest nadal ograniczona w obu metodach (kilkadziesiąt mikronów). Nie udało nam się przezwyciężyć tego ograniczenia, nawet przy zwiększonej inkubacji przeciwciał, ale zakładając, że penetracja przeciwciał jest większa niż całkowita głębokość, która jest obrazowana, nie powinno to mieć wpływu na ostateczny wynik. Ponadto należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby zabarwienie było równomierne na całym nabytym kominie.

W naszym badaniu chcieliśmy odróżnić synapsy pobudzające od hamujących. W związku z tym wybraliśmy odpowiednio vGlut1 / PSD-95 i vGAT / gefirynę, ponieważ białka te są silnie eksprymowane w hipokampie dorosłej myszy i są specyficzne dla każdego podtypusynapsy 4,5. Inne pobudzające i hamujące markery synaptyczne można było wykorzystać do identyfikacji każdej odpowiedniej synapsy, takie jak receptory wzbogacone w każdej synapsie, w tym receptory NMDA i AMPA dla synaps pobudzających i receptory GABAA dla synaps hamujących. Inne neuroprzekaźniki lub neuromodulatory można również zidentyfikować za pomocą naszego protokołu, zapewniając dostępność specyficznych przeciwciał, jak pokazano w przypadku synaps dopaminergicznych w prążkowiu22. Ponadto zmniejszenie grubości każdego wycinka do 120 μm może częściowo zniwelować niewielką ilość próbek uzyskanych za pomocą ostrych plastrów, co jest niezbędne w przypadku badań nad małymi strukturami mózgu, takimi jak ciało migdałowate.

Przyszłe zastosowania naszego protokołu mogą zostać wdrożone w badaniach nad różnymi obszarami mózgu i zaburzeniami. Na przykład w prążkowiu (regionie mózgu związanym z chorobą Parkinsona) kombinacja vGlut2 / PSD-95 lub vGlut1 / PSD-95 może być użyta do odróżnienia synaps pobudzających od aferentów pochodzących odpowiednio z kory lub wzgórza22.

Podsumowując, pokazaliśmy wiarygodną metodę badania liczby synaps w tkankach mózgowych przy użyciu markerów pre- i postsynaptycznych do zdefiniowania synapsy. Krytyczne kroki obejmują przygotowanie dobrych wycinków hipokampa, czas utrwalenia do 1 godziny w PFA, zastosowanie wystarczającej ilości pożywki montażowej, zastosowanie niezawodnych przeciwciał, odpowiednie ustawienia akwizycji obrazu i rygorystyczne wykrywanie punktów synaptycznych. Ostatecznie metoda ta jest stosunkowo szybka i łatwo możliwa do odtworzenia przez każde laboratorium, które ma dostęp do mikroskopu konfokalnego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust i Parkinson's UK. Chcielibyśmy również podziękować Pani Johannie Buchler za jej wkład w obrazy konfokalne oraz członkom laboratorium za ich konstruktywny wkład w pracę nad manuskryptem i metodologią.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
VibratomeLeicaVT1000S
Przeciwciało pierwszorzędoweMilliporeAB5905vGlut1 (1:2000)
Przeciwciało pierwszorzędoweThermo ScientificMA1-046PSD-95 (1:500)
Przeciwciało pierwszorzędoweUkłady synaptyczne131 004vGAT (1:500)
Przeciwciało pierwszorzędoweSystemy synaptyczne147011Gefiryna (1:500)
Przeciwciało pierwszorzędoweAbcamab5392MAP2 (1:10000)
Przeciwciało drugorzędoweJackson Laboratories706-545-148Osioł Anty-Świnka morska Alexa Fluor 488 (1:600)
Przeciwciało drugorzędoweAbcamab175470Osioł Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)
Podłoże montażoweSouthernBiotech00-4958-02Fluoromount-G
Konfokalne Mikroskop OlympusNAFV1000 mikroskop konfokalny wykorzystujący obiektyw olejowy o aperturze numerycznej (NA) 60x 1,35. W przypadku vGlut1 użyj lasera 488 o mocy procentowej 14%. Do PSD-95 użyj lasera 559 o mocy procentowej 20%.
Oprogramowanie analitycznePerkinElmerNAVolocity
SkalpelSwann-Morton203No 11
Super GlueLoctite1446875
95% O2, 5% CO2BOCNACylinder
24-dołkowa płytkaCorning3524
Szkiełkaszklane Thermo7107grubości 08-1,0 mm
Corning430167
iDkk1Myszy N/AN/Auzyskano przez skrzyżowanie myszy transgenicznych tetO Dkk1 z myszami transgenicznymi CaMKIIα rtTA2. Transgeniczne myszy TetO Dkk1 i CaMKIIα rtTA2 skrzyżowano w stanie heterozygotycznym. Obie linie myszy zostały wyhodowane na tle C57BL/6J. Jako grupę kontrolną wykorzystano pojedyncze rodzeństwo transgeniczne i z miotu WT.
NazwaFirma<strong>Numer katalogowyKomentarze
Odczynniki do roztworów:
NaClSigmaV800372
KClSigma P9333
Na2HPO< sub>4Sigma255793
KH2PO4SigmaP9791
Ca2ClSigma223506
Mg2ClSigmaM9272
NaH2PO4Sigma71505
Kwas kynureninowySigmaK3375
NaHCO3SigmaS5761
Kwas pirogronowySigma107360
EDTASigmaE6758
D-GlukozaSigmaG5767
SacharozaSigmaS8501
Triton-XSigmaT8787
Ośle SerumMiliporeS30-100ml
PFASigmaP6148
Myszy z szalką Petriego o

Bibliografia

  1. Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
  2. Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
  3. Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694(2012).
  4. Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
  5. Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
  6. Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
  7. Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
  8. Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
  9. Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44(2016).
  10. Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
  11. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
  12. Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
  13. Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
  14. De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
  15. Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
  16. Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
  17. Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
  18. Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
  19. Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302(2015).
  20. Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162(2013).
  21. Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
  22. Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gęstość synaptycznaskrawki hipokampamikroskopia immunofluorescencyjnamikroskopia konfokalnakolokalizacja vGlut1 i PSD95synapsy pobudzającesynapsy hamująceprzygotowanie skrawków mózgubarwienie przeciwciałamianaliza obrazu
Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.