Method Article

Rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu

DOI:

10.3791/56158

⸱

September 20th, 2017

 ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, University Health Network, 2Department of Pediatrics, British Columbia Children's Hospital & University of British Columbia, 3Institute of Medical Science, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje klinicznie stosowany sposób rozpuszczania związków hydrofobowych w środowisku wodnym przy użyciu kombinacji samoorganizujących się roztworów peptydów i aminokwasów. Nasza metoda rozwiązuje główne ograniczenie terapii hydrofobowych, w których brakuje bezpiecznych, skutecznych środków rozpuszczalności i metod dostarczania do warunków klinicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samoorganizujące się peptydy (SAP) są obiecującymi narzędziami do dostarczania hydrofobowych środków terapeutycznych do zastosowań klinicznych; ich właściwości amfipatyczne pozwalają im rozpuszczać związki hydrofobowe w środowisku wodnym ludzkiego ciała. Jednak samoorganizujące się roztwory peptydów mają słabą kompatybilność krwi (np. niską osmolarność), co utrudnia ich kliniczne zastosowanie poprzez podawanie dożylne. Niedawno opracowaliśmy uogólnioną platformę do hydrofobowego dostarczania leków, która łączy SAP z roztworami aminokwasów (SAP-AA) w celu zwiększenia rozpuszczalności leków i osmolarności preparatu, aby spełnić wymagania dotyczące zastosowań klinicznych. Ta strategia formułowania została dokładnie przetestowana w kontekście trzech strukturalnie różnych związków hydrofobowych – PP2, rottleryny i kurkuminy – w celu wykazania jej wszechstronności. Ponadto zbadaliśmy skutki zmiany składników formulacji, analizując 6 różnych SAP, 20 naturalnie występujących aminokwasów w niskich i wysokich stężeniach oraz dwa różne współrozpuszczalniki: dimetylosulfotlenek (DMSO) i etanol. Nasza strategia okazała się skuteczna w optymalizacji składników dla danego leku hydrofobowego, a funkcję terapeutyczną sformułowanego inhibitora PP2 obserwowano zarówno in vitro, jak i in vivo. Niniejszy manuskrypt przedstawia naszą uogólnioną metodę formulacji z wykorzystaniem kombinacji SAP-AA dla związków hydrofobowych oraz analizę rozpuszczalności jako pierwszy krok w kierunku potencjalnego zastosowania tych preparatów w bardziej funkcjonalnych badaniach. Dołączamy reprezentatywne wyniki rozpuszczalności dla preparatu hydrofobowego związku, kurkuminy, i omawiamy, w jaki sposób nasza metodologia służy jako platforma dla przyszłych badań biologicznych i modeli chorób.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SAPs to klasa biomateriałów, które były intensywnie badane jako rusztowania 3D w medycynie regeneracyjnej1,2,3,4. Ostatnio jednak zostały wykorzystane jako nośniki do dostarczania środków terapeutycznych ze względu na ich unikalne właściwości biologiczne5,6,7,8. SAP w naturalny sposób łączą się w stabilne nanostruktury9, zapewniając w ten sposób sposób sposób hermetyzację i ochronę leków. SAP są amfipatyczne, składają się ze specyficznego wzorca hydrofobowych i hydrofilowych powtórzeń aminokwasów, co napędza ich samoorganizację9,10 i pozwala im służyć jako medium między środowiskami hydrofobowymi i hydrofilowymi. W związku z tym, w klinicznym dostarczaniu leków hydrofobowych – które mają wyjątkowo niską biodostępność i wchłanianie w organizmie z powodu braku rozpuszczalności w środowisku wodnym11,12 – SAP są obiecujące jako nośnik dostawczy. Co więcej, ich wzorzec sekwencji sugeruje również, że SAP mogą być racjonalnie zaprojektowane i skonstruowane tak, aby zmaksymalizować kompatybilność z dowolnym lekiem lub związkiem (tj. w oparciu o grupy funkcyjne) i dodatkowo wspomóc rozpuszczalność.

SAP zostały zastosowane jako skuteczne środki dostarczania leków w wielu warunkach in vitro i in vivo13,14,15,16. Wykazały się również dużym bezpieczeństwem i biokompatybilnością. Jednak ze względu na niską osmolarność preparatów leków SAP, nie mogą one być stosowane do wstrzykiwań dożylnych, jak w warunkach klinicznych13. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, opracowaliśmy niedawno strategię, która łączy SAP z roztworami aminokwasów w celu zmniejszenia stosowania toksycznych współrozpuszczalników i zwiększenia osmolarności formulacji, a tym samym znaczenia klinicznego. Zdecydowaliśmy się na użycie aminokwasów, ponieważ są one budulcem SAP, są już klinicznie akceptowane, a w połączeniu z SAP zwiększają rozpuszczalność hydrofobowych leków, jednocześnie zmniejszając ilość wymaganego SAP17,18.

Zbadaliśmy kombinacje SAP-AA jako uogólnioną platformę do hydrofobowej rozpuszczalności leków i późniejszego dostarczania, tworząc wieloetapowy proces przesiewowy i stosując go do inhibitora Src, PP2, jako modelowego związku hydrofobowego. W tym procesie zbadaliśmy wpływ zmiany składników formulacji – ostatecznie testując 6 różnych SAP, wszystkie 20 aminokwasów w 2 różnych stężeniach (niskim i wysokim; niskim w oparciu o stężenia w istniejących zastosowaniach klinicznych, a wysokie stężenia były 2x, 3x lub 5x większe niż stężenie kliniczne w oparciu o maksymalną rozpuszczalność każdego aminokwasu w wodzie), i 2 różne współrozpuszczalniki – oraz wybrane kombinacje, które rozpuściły PP2 do dalszej analizy. Ten preparat leku okazał się skuteczny jako nośnik leków w hodowlach komórkowych, a także w modelach in vivo przy użyciu zarówno podawania dotchawiczego, jak i dożylnego. Podobnie, nasze prace dotyczyły wszechstronności kombinacji SAP-AA w rozpuszczaniu wielu, strukturalnie różnych związków hydrofobowych w środowisku wodnym; W szczególności leki rottlerin i curcumin18. W tym manuskrypcie przedstawiono metodę formulacji SAP-AA i analizę rozpuszczalności kurkuminy jako przykład pierwszego kroku w naszym procesie przesiewowym. Protokół ten zapewnia prosty, powtarzalny sposób badania przesiewowego w poszukiwaniu optymalnych kombinacji SAP-AA, które rozpuszczają dowolny związek hydrofobowy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów aminokwasów

  1. Przygotować i oznaczyć dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml dla każdego aminokwasu (po jednej dla "niskich" i "wysokich" stężeń).
  2. Przygotować dużą kolbę o pojemności 2 litrów zawierającą oczyszczoną wodę (18,2 MΩ·cm w temperaturze 25 °C).
  3. Oblicz ilość każdego aminokwasu (w gramach), aby osiągnąć pożądane stężenia, i zważ odpowiednią ilość aminokwasu do odpowiednich probówek wirówkowych o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki.
    UWAGA: W przypadku "wysokiego" stężenia dwóch ujemnie naładowanych aminokwasów zamiast wody stosuje się PBS. Nie mogliśmy zwiększyć ich stężenia ze względu na niską rozpuszczalność w wodzie, a stosowanie PBS zamiast wody pomaga utrzymać niskie pH. Ponadto obliczenia stężenia uzyskano przy użyciu końcowej objętości 40 ml dla każdego roztworu aminokwasów. Wszystkie stężenia aminokwasów przedstawiono w tabeli 3. Pamiętaj, aby przepłukać szpatułkę między aminokwasami, aby uniknąć zanieczyszczenia. Zalecamy spłukanie wodą, a następnie przetarcie 70% etanolem.
  4. Dodać 40 ml oczyszczonej wody (lub PBS) do każdej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej. Zakryj probówki i wiruj lub energicznie wstrząsaj aż do rozpuszczenia. Sonikacja w kąpieli wodnej (temperatura pokojowa, 130 W, 40 kHz) może być również stosowana w celu wspomagania procesu rozpuszczalności.
    UWAGA: Następujące roztwory aminokwasów są wrażliwe na światło i powinny być pokryte folią aluminiową: tryptofan, fenyloalanina i tyrozyna (które składają się z aromatycznych struktur przypominających pierścienie) oraz cysteina (reaktywna grupa -SH).

2. Przygotowanie rozwiązań SAP-AA

  1. Przygotować 20 ml fiolek scyntylacyjnych dla samoorganizujących się peptydów. Dla danego peptydu samoorganizującego się należy przygotować jedną fiolkę na przygotowany roztwór aminokwasu (każda kombinacja zostanie umieszczona w osobnej fiolce).
  2. Używając wagi analitycznej o wysokiej wydajności (o dokładności odczytu do 0,1 mg lub mniejszej), odważyć około 1 ± 0,2 mg peptydu na dnie każdej fiolki. Nakrętkę po zważeniu i zapisać dokładną masę peptydu na nasadce.
  3. Odmierzyć pipetą odpowiednią objętość roztworu aminokwasu (przygotowanego w sekcji 1) do każdej fiolki zawierającej peptyd, w celu osiągnięcia pożądanego stężenia peptydu samoorganizującego się (0,1 mg/ml dla długich peptydów o długości 16 aminokwasów lub 0,2 mg/ml dla krótszych peptydów o długości 8 aminokwasów).
  4. Sonikować przez 10 minut w łaźni wodnej (130 W, 40 kHz) w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwory w fiolkach są całkowicie zanurzone w łaźni wodnej.

3. Przygotowanie roztworów podstawowych Lek-DMSO lub Lek-Etanol

  1. Połącz 1 mg leku (w tym przypadku kurkuminy) ze 100% DMSO i kolejny 1 mg ze 100% etanolem, aby utworzyć dwa roztwory podstawowe.
    UWAGA: Dodaliśmy 200 μl DMSO i 400 μl etanolu, aby uzyskać zapasy DMSO-kurkuminy i etanolu-kurkuminy, które wynosiły odpowiednio 5 mg / ml i 2,5 mg / ml, ze względu na różną rozpuszczalność w każdym rozpuszczalniku; Należy jednak pamiętać, że stężenie bulionu należy dostosować w zależności od interesującego nas leku hydrofobowego. Czynniki takie jak rozpuszczalność leku i efektywne stężenie biologiczne są ważne dla określenia tej wartości. Należy również pamiętać, że zapas zostanie rozcieńczony 100-krotnie i 50-krotnie odpowiednio w preparatach DMSO i etanolu w połączeniu z roztworami SAP-AA (patrz sekcja 4). Preferowane może być przygotowanie większej ilości bulionu w zależności od liczby wymaganych preparatów – w tym przypadku należy użyć więcej niż 1 mg leku. Zapas można przechowywać w temperaturze -20 °C; Rozmrozić na lodzie i wirować przed użyciem.
  2. Wiruj fiolki przez 15 s, aby całkowicie rozpuścić lek.

4. Przygotowanie preparatów leczniczych

  1. Przygotuj przezroczyste probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dla każdego preparatu. Pamiętaj, aby oznaczyć probówki przeznaczonym peptydem samoorganizującym się, aminokwasem (i stężeniem) oraz współrozpuszczalnikiem.
  2. Dodaj 10 μl bulionu Drug-DMSO lub 20 μl bulionu Drug-Ethanol do odpowiednich probówek do mikrowirówek.
  3. Dodać 990 μl roztworów kwasu SAP-AA do odpowiednich oznakowanych probówek mikrowirówek zawierających Drug-DMSO i 980 μL do tych zawierających Drug-Ethanol. W ten sposób uzyskuje się 1 ml preparatów leczniczych z 1% DMSO lub 2% etanolu.
    UWAGA: Końcowe stężenie wszystkich preparatów kurkuminy wynosiło 0,5 mg/ml zgodnie z protokołem. Ponownie, będzie się to różnić w przypadku stosowania innych związków hydrofobowych i/lub zaczynania od innego stężenia podstawowego (patrz krok 3.1)
  4. Wirować energicznie przez 30 s i pozostawić preparaty na 30 minut.

5. Badanie rozpuszczalności

  1. Po okresie odpoczynku ponownie energicznie wiruj przez 30 s.
  2. Odwirować preparaty przy 14,220 g przez 1 min.
  3. Przeanalizuj dno probówek mikrowirówkowych pod kątem wytrącania (poprzez wizualizację).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla leku hydrofobowego, kurkuminy, opracowaliśmy preparaty wykorzystujące wszystkie 20 naturalnie istniejących aminokwasów w niskich stężeniach, w połączeniu tylko z jednym SAP, EAK16-II, jako dowód słuszności zasady. Przetestowaliśmy również preparaty wykorzystujące zarówno DMSO, jak i etanol jako współrozpuszczalniki. W sumie w ten sposób powstało 40 preparatów kurkuminy, z których każdy zawierał inne składniki. Należy zauważyć, że w naszych poprzednich badaniach z użyciem inhibitora Sr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W procedurze formułowania istnieją różne krytyczne kroki i punkty, które należy wziąć pod uwagę podczas rozwiązywania problemów. Po pierwsze, ponieważ pracujemy z różnymi składnikami i stężeniami, wiele etapów wirowania w całym protokole zapewnia, że wszystkie stężenia są jednolite i prawidłowe. Niektóre z hydrofobowych roztworów aminokwasów o wysokim stężeniu mogą nadal nie zostać całkowicie rozpuszczone po wirowaniu, a w takim przypadku można je energicznie wstrząsnąć ręcznie, aby wspomóc ten proces. Podobnie, ważne je...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, granty operacyjne MOP-42546 i MOP-119514.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EAK16-ICanPeptide Inc.Niestandardowa sekwencja peptydów: AEAKAEAKAEAKAEAK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc.Niestandardowa sekwencja peptydowa: AEAEAKAKAEAEAKAK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC
EAK16-IVCanPeptide Inc.Niestandardowa sekwencja peptydów: AEAEAEAEAKAKAKAK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC
EFK8-IICanPeptide Inc.Niestandardowa sekwencja peptydów: FEFEFKFK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC
A6KECanPeptide Inc.Niestandardowa sekwencja peptydów: AAAAAAKE, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC
P6KECanPeptide Inc.Niestandardowa sekwencja peptydów: PPPPPPPKE, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości według HPLC
AlaninaSigma-AldrichA7469-100GL-Alanina
IzoleucynaSigma-AldrichI7403-100GL-Izoleucyna
LeucynaSigma-AldrichL8912-100GL-Leucyna
MetioninaSigma-AldrichM5308-100GL-Metionina
ProlinaSigma-AldrichP5607-100GL-Prolina
WalinaSigma-AldrichV0513-100GL-Walina
FenyloalaninaSigma-AldrichP5482-100GL-Fenyloalanina
TryptofanSigma-AldrichT8941-100GL-Tryptofan
TyrozynaSigma-AldrichT8566-100GL-Tyrozyna
GlycineSigma-AldrichG8790-100GL-Glycine
AsparagineSigma-AldrichA4159-100GL-Asparagine
GlutaminaSigma-AldrichG8540-100GL-Glutamina
SerineSigma-AldrichA7219-100GL-Serine
TreoninaSigma-AldrichT8441-100GL-Treonina
HistydynaSigma-AldrichH6034-100GL-Histydyna
LizynaSigma-AldrichL5501-100GL-Lizyna
ArgininaSigma-AldrichA8094-100GL-Arginina
Kwas asparaginowySigma-AldrichA7219-100GKwas L-asparaginowy
Kwas glutaminowySigma-AldrichG8415-100GKwas
L-glutaminowyCysteinaSigma-AldrichC7352-100GL-Cysteina
DimetylosultlenekSigma-AldrichD4540-500MLDMSO
EtanolSigma-Aldrich277649-100MLBezwodna
kurkuminaSigma-Aldrich08511-10MGLek hydrofobowy, kurkumina
RottlerinEMD Millipore557370-10MGLek hydrofobowy, rottlerin
PP2Enzo BML-EI297-0001Lek hydrofobowy,
fiolki scyntylacyjneVWR2650-66022-081Szkło borokrzemianowe, z nakrętką, 20 mL. Fiolki do ważenia peptydów.
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlVWR352070Polipropylen, sterylne, 50 mL. Do roztworów aminokwasów.
PP2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
  2. Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
  3. Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
  4. Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
  5. Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
  6. Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
  7. Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
  8. French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
  9. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
  10. Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
  11. Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
  12. Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
  13. Bawa, R., Fung, S. -Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
  14. Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
  15. Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
  16. Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
  17. Fung, S. -Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
  18. Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrophobic CompoundsSelf assembling PeptidesAmino Acid SolutionsSolubility TestingDrug FormulationCo solvent OptimizationPeptide Amino Acid CombinationsCurcumin SolubilityAqueous Solution DeliveryTherapeutic Function

Related Articles