Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Laserowo indukowana neowaskularyzacja naczyniówkowa (CNV) jest dobrze znanym modelem naśladującym mokrą formę zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). W tym protokole staramy się przeprowadzić czytelnika nie tylko przez techniczne rozważania dotyczące generowania zmian indukowanych laserem w celu wywołania procesów neowaskularnych, ale raczej skupić się na potężnych informacjach, które można uzyskać z multimodalnego obrazowania podłużnego in vivo przez cały okres obserwacji.
Indukowany laserowo mysi model CNV został wygenerowany przez podanie laserem diodowym. Do monitorowania indukcji, progresji i regresji CNV wykorzystano multimodalne techniki obrazowania in vivo. Po pierwsze, bezpośrednio po laserowaniu wykonano optyczną koherentną tomografię koherentną w domenie spektralnej (SD-OCT) w celu sprawdzenia pęknięcia błony Brucha. Późniejsze obrazowanie in vivo za pomocą angiografii fluoresceinowej (FA) potwierdziło udane uszkodzenie błony Brucha na podstawie seryjnych obrazów uzyskanych na poziomie naczyniówki. Podłużna obserwacja proliferacji i regresji CNV w dniach 5, 10 i 14 po wykonaniu laserowania przy użyciu zarówno SD-OCT, jak i FA. Przedstawiono prostą i niezawodną klasyfikację nieszczelnych wycieków CNV na podstawie obrazów FA. Automatyczna segmentacja do pomiaru całkowitej grubości siatkówki, w połączeniu z ręcznym zastosowaniem kalibru do pomiaru grubości siatkówki w miejscach CNV, pozwala na bezstronną ocenę obecności obrzęku. Na koniec przeprowadza się weryfikację histologiczną CNV za pomocą barwienia izolektyną GS-IB4 na płaskich naczyniówkach. Barwienie jest progowe, a obszar dodatni izollektyny jest obliczany za pomocą ImageJ.
Ten protokół jest szczególnie przydatny w badaniach terapeutycznych wymagających wysokoprzepustowych badań przesiewowych patologii CNV, ponieważ umożliwia szybką, multimodalną i wiarygodną klasyfikację patologii CNV i obrzęku siatkówki. Ponadto SD-OCT o wysokiej rozdzielczości umożliwia rejestrację innych patologicznych cech charakterystycznych, takich jak nagromadzenie płynu podsiatkówkowego lub śródsiatkówkowego. Metoda ta nie daje jednak możliwości zautomatyzowania analizy objętości CNV z obrazów SD-OCT, która musi być wykonywana ręcznie.
Wprowadzenie
Pierwsza udana próba naśladowania patologii ludzkiego CNV u gryzoni została zademonstrowana prawie trzy dekady temu za pomocą lasera kryptonowego u szczurów Long-Evans1. Następnie laser kryptonowy został użyty do przerwania błony Brucha w najpopularniejszym szczepie myszy, C57BL/6J2,3,4. Wskaźnik powodzenia indukcji CNV zweryfikowano za pomocą FA i barwień histologicznych. Szybki rozwój nieinwazyjnych metod obrazowania, takich jak OCT, przyczynił się do rozwoju dziedziny przedklinicznych modeli gryzoni. Możliwość monitorowania zmian morfologicznych w siatkówce w wielu punktach czasowych w tym samym oku znacząco przyczynia się do zmniejszenia wykorzystania zwierząt i zwiększa skuteczność w badaniach eksperymentalnych. Ocena histologiczna zmian CNV jest dość prosta i wymaga oznakowania nieprawidłowego wzrostu naczyń wokół miejsca podania lasera, akwizycji obrazu i oszacowania obszaru/objętości za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Natomiast metody obrazowania in vivo wprowadzają bardziej złożone analizy patologii CNV i jej interpretację.
Tutaj prezentujemy prostą i stosunkowo szybką metodę stopniowania indukcji, progresji i regresji CNV za pomocą FA, SD-OCT oraz metody automatycznej segmentacji w mysim modelu CNV indukowanym laserem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz Dyrektywą WE 86/609/EWG dotyczącą eksperymentów na zwierzętach, przy użyciu protokołów zatwierdzonych i monitorowanych przez Fińską Radę ds. Doświadczeń na Zwierzętach.
1. Model CNV myszy indukowany laserem 5
- Sprawdź oczy zwierzęcia makroskopowo pod kątem jakichkolwiek nieprawidłowości.
- Zważ mysz.
- Obliczyć i przygotować odpowiednią ilość środków znieczulających do użycia w zależności od masy ciała zwierzęcia, np. mieszaninę medetomidyny (1 mg/kg), ketaminy (75 mg/kg) i wody destylowanej (0,9% roztwór NaCl) w stosunku 1:1,5:2,5 lub ketaminy (40-75 mg/kg), ksylazyny (5 mg/kg) i wody destylowanej (0,9% roztwór NaCl) w stosunku 1:2,5:1; dla myszy 20 g, wstrzyknąć 0,1 ml mieszaniny.
- Wstrzyknąć środek znieczulający dootrzewnowo.
- Umieść mysz z powrotem w klatce i poczekaj, aż zwierzę zostanie znieczulone. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona z powodu braku odruchu pedałowania.
- Zapewnić stosowanie laserowego sprzętu ochrony osobistej.
- Włącz lampę szczelinową i laser diodowy 532 nm.
- Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na poduszce grzewczej.
- Nałóż jedną kroplę Tropicamidu na rozszerzenie źrenic. Odczekaj 3-5 minut do pełnego (3 mm) rozszerzenia źrenic.
- Umieść mysz na stoliku lampy szczelinowej.
- Umieść jedną kroplę płynnego żelu okulistycznego na szkiełku nakrywkowym, aby wyrównać rogówkę.
- Ustaw oko myszy tak, aby głowa nerwu wzrokowego znajdowała się pośrodku.
- Ustaw moc lasera na 100 mW, czas trwania na 100 ms, a rozmiar plamki na 50 μm.
- Skoncentruj wiązkę lasera na nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE).
- Wykonaj trzy strzały laserowe w jedno oko, omijając naczynia krwionośne siatkówki, idealnie w pozycjach godziny 4, 8 i 12 wokół nerwu wzrokowego. Po wszystkich strzałach laserowych sprawdź dno oka pod kątem braku krwawienia z siatkówki. Oko przeciwległe służy jako kontrola nielaserowa.
- Wyrzuć szkiełko nakrywkowe i umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej.
- Nałóż jedną kroplę żelu PEG na oba oczy.
2. SD-OCT 6,7
- Umieść mysz w stadium wyrównania gryzoni i unieruchom głowę.
- Ustaw obiektyw systemu SD-OCT (np. Bioptigen/Leica Envisu R2200) tak, aby był skierowany w stronę oka podczas obrazowania in vivo za pomocą kontrolerów X-stage i Y.
- Wykonaj skany SD-OCT, aby zweryfikować pęknięcia błony Brucha: gdy SD-OCT zeskanuje całe oko, ręcznie przesuń linię odniesienia w miejscach laserowanych. Pęknięcia błony Brucha powinny być wyraźnie widoczne w obszarach laserowych (patrz Rysunek 1).
3. Angiografia fluoresceinowa 7,8,9
- Wyjmij mysz z uchwytem i umieść ją w systemie FA (np. Heidelberg Spectralis HRA2).
- Skoncentruj się na obszarach oparzeń laserowych dna oka w trybie odbicia podczerwonego z głową nerwu wzrokowego pośrodku okienka widzenia.
- Wstrzyknąć 0,1 ml 5% soli sodowej fluoresceiny dla myszy 20 g podskórnie lub dootrzewnowo.
- Skoncentruj się na poziomie naczyniówki.
- Zrób zdjęcie z poziomu ostrości naczyniówki.
- Ponownie ustaw ostrość na poziomie siatkówki i zrób zdjęcie.
- Odczekaj 30 s i powtórz kroki 3.4-3.6.
- Wyjmij mysz z uchwytu i umieść ją na poduszce grzewczej.
- Odwróć znieczulenie za pomocą α2-antagonisty medetomidyny, atipamezolu (0,5 mg/kg, i.p.) lub poczekaj na powrót do zdrowia zwierzęcia po znieczuleniu.
- Powtórzyć obrazowanie in vivo SD-OCT i FA u znieczulonych zwierząt w 5, 10 i 14 dniu obserwacji.
4. Klasyfikacja CNV
- Oceń uszkodzenie błony Brucha na podstawie obrazów OCT i obrazów FA naczyniówki wykonanych bezpośrednio po laserowaniu w dniu 0 w następujący sposób:
0 - Membrana Brucha nie została uszkodzona
1 - udane uszkodzenie błony Brucha - Oceń obecność CNV w laserowych miejscach, w których doszło do wycieku, zaobserwowanego, porównując dynamikę sygnału fluoresceiny w serii obrazów FA siatkówki w następujący sposób:
0 - normalny wygląd siatkówki
0,5 - słabe zabarwienie przecieku
1.0 - nieszczelne obszary CNV
Uwaga: Użyj obrazowania OCT w celu dodatkowego potwierdzenia CNV lub w wątpliwym FA, gdzie obecność płynu śródsiatkówkowego na obrazach OCT sugerowałaby klasyfikację CNV.
5. Pomiary grubości siatkówki
- Użyj zautomatyzowanego oprogramowania do segmentacji do pomiarów grubości siatkówki. Upewnij się, że całkowita grubość siatkówki jest brana pod uwagę jako grubość wszystkich warstw od warstwy włókien nerwowych do RPE (zdrowe miejsca pomiaru) lub do wyimaginowanej linii łączącej RPE wokół miejsca uszkodzenia (miejsca laserowe) (patrz również Rysunek 7).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pęcherzyk lub krwawienie podsiatkówkowe bezpośrednio po laseroterapii nie zawsze są widoczne. Dlatego badanie SD-OCT jest szczególnie istotne dla weryfikacji uszkodzenia błony Blocha. Rysunek 1 przedstawia przykład obrazowania OCT w różnych punktach czasowych po zastosowaniu lasera.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obrazowanie multimodalne oferuje cenne narzędzia do oceny patologii CNV. W tym miejscu przedstawiliśmy protokół obrazowania składający się z FA, SD-OCT i automatycznej segmentacji w celu szybkiej, powtarzalnej i wiarygodnej oceny patologii CNV. Potwierdzono pęknięcie błony Brucha po podaniu lasera. Ponadto zastosowanie SD-OCT na tym etapie pozwoliło również na natychmiastową wizualizację ewentualnych krwotoków śródsiatkówkowych i podsiatkówkowych, co może zaburzyć interpretację wyników. Nieszczelności siatkówki oceniano ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor, dr Symantas Ragauskas, jest pracownikiem (naukowcem) i udziałowcem firmy Experimentica Ltd., która oferuje usługi badawcze na zlecenie z wykorzystaniem przedklinicznego modelu CNV zastosowanego w tym artykule.
Autorka Ewa Kiełczewski jest pracownikiem (inżynier ds. aplikacji badawczych, OCT) firmy Leica Microsystems, która produkuje systemy SD-OCT używane w tym artykule.
Autor, Joseph Vance, jest pracownikiem (dyrektorem sprzedaży NA OCT) firmy Leica Microsystems, która produkuje systemy SD-OCT używane w tym artykule. Joseph Vance jest również prezesem i dyrektorem zarządzającym Spective, LLC.
Autor, dr Simon Kaja, jest konsultantem, dyrektorem naukowym i udziałowcem Experimentica Ltd., organizacji zajmującej się badaniami przedklinicznymi na zlecenie, która oferuje usługi badań kontraktowych, w tym przedkliniczny model CNV wykorzystany w tym artykule. Dr Simon Kija jest również dyrektorem generalnym K&P Scientific, LLC, firmy konsultingowej zajmującej się naukami przyrodniczymi, a także profesorem okulistyki im. dr Johna P. i Therese E. Mulcahy na Uniwersytecie Loyola w Chicago, Stritch School of Medicine. Warunki tej umowy zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Loyola w Chicago zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów.
Autor, dr Giedrius Kalesnykas, jest pracownikiem (CEO) i udziałowcem firmy Experimentica Ltd., która oferuje usługi badań kontraktowych z wykorzystaniem przedklinicznego modelu CNV zastosowanego w tym artykule.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Yuliyi Naumchuk (Loyola University Chicago) i Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) za doskonałe wsparcie techniczne i wideograficzne. Program badawczy dr Kaja jest wspierany przez Dr. John P. and Therese E. Mulcahy Endowed Professorship in Ophthalmology na Uniwersytecie Loyola w Chicago.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Medetomidyna (nazwa handlowa Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Znieczulenie |
| Ketamina | Intervet | Vnr 51 14 85 | Znieczulenie |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Znieczulenie |
| Ksylazyna (nazwa handlowa Rompun weterynarz) | Bayer | vnr 14 89 99 | Znieczulenie |
| Tropicamid | Santen | Vnr 04 12 36 | Rozszerzenie źrenic środek |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Smar |
| Systane | Alcon | - | Smar |
| 5% Sól sodowa fluoresceiny | Sigma | Aldrich F6377-100G | Środek fluorescencyjny |
| Atipamezole (nazwa handlowa Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Znieczulenie |
Bibliografia
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502(2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643(2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
