System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Podsumowanie

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym i najbardziej śmiertelnym pierwotnym nowotworem mózgu u dorosłych, powodującym około 14 000 zgonów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych. Mediana przeżycia po rozpoznaniu wynosi mniej niż 15 miesięcy przy maksymalnej resekcji chirurgicznej, radioterapii i chemioterapii temozolomidem. Wyzwania związane z opracowywaniem skuteczniejszych metod leczenia GBM stają się coraz bardziej oczywiste i obejmują jego nieustępliwą inwazyjność, oporność na standardowe leczenie, złożoność genetyczną i zdolność adaptacji molekularnej oraz subpopulacje komórek GBM o fenotypowych podobieństwach do normalnych komórek macierzystych, zwanych tutaj komórkami macierzystymi glejaka (GSC). Ponieważ GSC są niezbędne do wzrostu i progresji guza, terapia oparta na różnicowaniu stanowi realną metodę leczenia tych nieuleczalnych nowotworów.

Poniższy protokół opisuje zbiór procedur mających na celu stworzenie wysokoprzepustowej platformy przesiewowej, mającej na celu identyfikację małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju GSC. Sercem systemu jest reporterowy konstrukt różnicowania fibrylarnego białka fibrylarnego gleju (GFAP). Protokół zawiera następujące procedury ogólne: 1) ustanowienie linii raportujących zróżnicowanie SGR; 2) badanie/walidacja znaczenia osoby zgłaszającej dla samoodnawiania się/zdolności klonogennej Sekretariatu Generalnego; oraz (3) badania przesiewowe leków oparte na cytometrii przepływowej o dużej pojemności.

Platforma przesiewowa zapewnia proste i niedrogie podejście do identyfikacji małych cząsteczek, które sprzyjają różnicowaniu GSC. Co więcej, wykorzystanie bibliotek leków zatwierdzonych przez FDA ma potencjał do identyfikacji środków, które mogą być szybciej ponownie wykorzystane. Oczekuje się również, że terapie, które promują różnicowanie rakowych komórek macierzystych, będą działać synergistycznie z obecnymi terapiami "standardowej opieki", które, jak wykazano, są ukierunkowane i eliminują przede wszystkim bardziej zróżnicowane komórki rakowe.

Wprowadzenie

Ostatnie badania wykazały, że nowotwory zawierają małą populację komórek, określanych jako rakowe komórki macierzyste (CSC) lub komórki inicjujące nowotwór, które są odpowiedzialne za progresję nowotworu, przerzuty i odporność na chemio- i radioterapie 1^,2. Obecność nowotworowych komórek macierzystych i ich bardziej zróżnicowanych potomków w obrębie nowotworów jest uważana za ważny czynnik sprzyjający heterogeniczności wewnątrznowotworowej, a tym samym stanowi główną przeszkodę w leczeniu nowotworów³. Hierarchia komórek nowotworowych, przedstawiona przez teorię rakowych komórek macierzystych, zainspirowała rozwój nowych strategii leczenia nowotworów ⁴. Jednym z podejść do celowania w nowotworowe komórki macierzyste jest identyfikacja i hamowanie szlaków sygnałowych, o których wiadomo, że są wymagane podczas rozwoju embrionalnego dotkniętego narządu. Rzeczywiście, my i inni opublikowaliśmy wcześniej wiele artykułów opisujących ciągłe zapotrzebowanie na szlaki sygnałowe istotne dla neuronalnych komórek macierzystych Sonic Hedgehog i Notch w glejaku^5,6,7. Prace te pomogły w ugruntowaniu przesłanek dla kilku badań klinicznych GBM. Drugim podejściem do celowania w nowotworowe komórki macierzyste jest promowanie ich różnicowania. Podejście to spotkało się z dużym poparciem ze względu na korzystne wyniki badań przedklinicznych i klinicznych w leczeniu ostrej białaczki promielocytowej kwasami retinowymi (ATRA, analog witaminy A). W tym przypadku stwierdzono, że ATRA usuwa blok dojrzewania i promuje różnicowanie komórek rakowych⁸. Niedawno Piccirillo i współpracownicy elegancko wykazali, że BMP-4 promuje różnicowanie GSC w astrocyty ze znaczącym działaniem anty-GBM in vitro i in vivo⁹.

Uzasadnienie obecnego badania opiera się na podejściu "inżynierii odwróconej" do celów GSC. Biorąc pod uwagę ogromną heterogeniczność obecną w GBM i słabe różnicowanie będące jedną z cech charakterystycznych raka, zapytaliśmy, czy możemy promować bardziej korzystny fenotyp - różnicowanie się do stanu podobnego do astrocytów. W tym przypadku nie mamy wcześniejszej wiedzy na temat szlaków sygnałowych, które utrzymują GSC w danej próbce guza, ale raczej dążymy do osiągnięcia pożądanego fenotypu (np. dodatniego wyniku GFAP).

Ten raport opisuje procedury używane do ustanowienia linii reporterowych różnicowania GSC od transdukcji kultur wzbogaconych GSC do selekcji klonalnej GSC. Zastosowane linie neurosfery glejaka zostały stworzone w laboratorium profesora Angelo Vescovi od pacjentów z rozpoznaniem glejaka pierwotnego w Szpitalu San Raffaele - Mediolan we Włoszech. Linie te zostały szeroko przebadane w kilku publikacjach ^{6,10,11,12,13,14}. Zdecydowanie zaleca się, aby osoby, które są zainteresowane wdrożeniem tych technik w swoim laboratorium, określiły znaczenie reportera dla zdolności do samoodnawiania się komórek macierzystych raka w komórkach, które planują badać (dotyczy to każdego zgłaszającego). W tym celu dostępny jest szczegółowy protokół dla jednego z testów klonogennych in vitro akceptowanych w tej dziedzinie^15,16. Na końcu znajduje się szczegółowy protokół opisujący wykorzystanie różnicujących linii reporterowych w badaniu przesiewowym leków opartym na cytometrii przepływowej. Warto zauważyć, że podobnie jak w przypadku opisanego tutaj systemu różnicowania astrogleju, udało nam się ustalić i zweryfikować linie reporterowe GSC integrujące reporter MAP2:GFP (różnicowanie neuronalne). W związku z tym metodologie opisane w tym artykule mogą być stosowane do badania różnicowania komórkowego w różnych liniach komórkowych.

Niektóre z liczb w tym raporcie można znaleźć w niedawnej publikacji: "Atracurium Besylate i inne czynniki blokujące przewodnictwo nerwowo-mięśniowe promują różnicowanie astrogleju i wyczerpują komórki macierzyste glejaka¹⁸.

Protokół

UWAGA: Astroglejowe i neuronalne systemy reporterowe lentiwirusa zostały zakupione jako wstępnie zapakowane, skoncentrowane preparaty lentiwirusowe. Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu techniki cytometrii przepływowej. Ponadto, aby w pełni wykorzystać ten protokół, użytkownik będzie potrzebował dostępu do cytometru przepływowego o dużej przepustowości (akceptuje płytki 96-dołkowe jako źródło próbki).

1. Lentiwirusowy system reporterowy transkrypcji

UWAGA: We wszystkich analizach cytometrii przepływowej używaj komórek rodzicielskich, nietransdukowanych lub komórek transdukowanych wektorowo (niefluorescencyjnych) do ustalenia wyjściowej fluorescencji. Zauważ również, że na wszystkich etapach, na których wymagane jest mechaniczne rozcieranie, bądź delikatny. Ostre wycieranie może zabić znaczną liczbę delikatnych GSC i wpłynąć na wyniki cytometrii przepływowej.

1. Płytka 1x10⁶ komórek w 2 ml kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych na płytce 6-dołkowej.
2. Transdukuj komórki, dodając reporter lentiwirusa przy wielokrotności infekcji (moi) równej 5.
3. Dodać 2 μl polibrenu, aby uzyskać końcowe stężenie 8 μg/ml.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 przez} noc.
5. Następnego dnia zastąp pożywkę wzrostową, aby usunąć niezwiązanego wirusa. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i inkubować przez 24 godziny.
6. Zebrać 0,5 ml całkowitej objętości; odwirować komórki w temperaturze 360 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i usunąć supernatant przez aspirację. Dodać 0,5 ml świeżej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych do pozostałych komórek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w celu dalszej ekspansji.
7. Dodać 200 μl odczynnika dysocjacyjnego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
8. Dysocjuj komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół.
   UWAGA: Ostre roztarcie może spowodować znaczne zabicie GSC, całkowitą dysocjację osiąga się zwykle po 20 - 30 razy.
9. Aby zminimalizować przyczepianie się lub agregację komórek, dodaj 800 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
10. Przenieść 200 μl zawiesiny każdej komórki do dołka zawierającego 96-dołkową płytkę.
11. Do tej procedury należy użyć laboratoryjnego cytometru przepływowego z 96-dołkową płytką, wyposażonego w niebieski laser do wzbudzenia i z możliwością wykrywania białka zielonej fluorescencji. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej z co najmniej 10 000 żywotnych komórek dla każdego akwizycji.
12. Określ procent komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.

2. Wybór, Ekspansja i Walidacja Subklonów

1. Komórki płytki w 100 μl pożywki z nerwowych komórek macierzystych o gęstości 0,7 komórki na dołek na 96-dołkowej płytce.
2. Hodowla klonów przez 11 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Ten krok jest w dużym stopniu zależny od typu komórki i prawdopodobnie będzie wymagał dostosowania w oparciu o użytą linię komórkową. Z reguły średnica kuli ≥ 100 μm jest dobrym wskaźnikiem obecności klonogennych GSC w neurosferach.
3. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr FITC zaznacz studzienki zawierające pojedynczą neurosferę, w której ~1-5% komórek jest GFP-dodatnich.
   UWAGA: Określenie dokładnego procentu komórek GFP-dodatnich nie jest w tym momencie zbyt krytyczne. Każdy z subklonów zostanie później oceniony za pomocą cytometrii przepływowej. Ten krok jest wykonywany w celu zmniejszenia całkowitej liczby klonów do analizy, z naciskiem na neurosfery, które pochodzą z niezróżnicowanego, GFAP-ujemnego GSC.
4. Rozwijaj wybrane klony reporterowe, aż będzie wystarczająca liczba komórek do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Studzienka sub-konfluentna z 6-dołkowej płytki zawierającej ≤ 1,5x10⁵ komórek/ml powinna zapewnić wystarczającą liczbę komórek.
   UWAGA: Szczegółowa procedura izolacji i rozszerzania GSC jest dostępna pod adresem ¹⁷.

3. Oznaczanie ekspresji GFAP:GFP za pomocą cytometrii przepływowej

1. Pobrać podwielokrotność komórek (0,5 ml) z każdego klonu reporterowego i nietransdukowanych kontroli w celu określenia dokładnego procentu komórek GFP-dodatnich. Biorąc pod uwagę klony reporterowe, które zawierają ~1 - 5% komórek GFP-dodatnich.
2. Wirować komórki w temperaturze 360 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant przez aspirację.
3. Do każdej osadki dodać 200 μl odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować probówki w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C.
4. Delikatnie rozcieraj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki (zwykle od 20 do 30 razy).
5. Aby zminimalizować przyłączanie lub agregację komórek, dodaj 800 μl HBSS do końcowej objętości 1 ml.
6. Przenieść 200 μl na studzienkę 96-dołkowej płytki z każdej zawiesiny komórek.
7. Do tej procedury należy użyć laboratoryjnego cytometru przepływowego z 96-dołkową płytką. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej z co najmniej 10 000 żywotnych komórek dla każdego akwizycji.

4. Test samoodnawiania ELDA do oceny zdolności klonogenicznej

UWAGA: Dla kontroli, zarówno komórki rodzicielskie, nietransdukowane, jak i transdukowane lentiwirusem z ekspresją GFP, powinny być używane do określenia względnego potencjału klonogennego linii reporterowych różnicowania GSC do oryginalnych kultur GSC, z których pochodzą.

1. Dysocjuj subklony reporterowe różnicowania na zawiesiny jednokomórkowe, jak opisano powyżej.
2. Płytki komórkowe na 96-dołkowych płytkach w 100 μl kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych o gęstości komórek w zakresie od 5 do 500 komórek na studzienkę.
3. Inkubować komórki przez 9 do 11 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Oceń dodatnie dołki poprzez bezpośrednią wizualizację neurosfer pod mikroskopem świetlnym. Studnia powinna być uważana za "pozytywną", jeśli zawiera co najmniej jedną dużą neurosferę.
5. Podłącz dane: całkowitą liczbę przeanalizowanych odwiertów i liczbę odwiertów dodatnich za pomocą interfejsu online ELDA dostępnego pod adresem http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. Przygotowanie rozcieńczenia biblioteki leków

1. Wyjąć płytki biblioteczne z magazynu w temperaturze -80 °C, przykryć folią aluminiową (chronić związki wrażliwe na światło). Rozmrażać przez około 30 minut do godziny w temperaturze pokojowej.
2. Użyj 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, aby rozcieńczyć związki z biblioteki do 0,2 mM w kompletnym pożywce z nerwowych komórek macierzystych. Rozcieńczyć DMSO do 10% w podłożu wzrostowym
   UWAGA: Końcowe stężenie DMSO powinno wynosić 0,1% po dodaniu do komórek. Wyższe stężenie DMSO w kulturze może powodować toksyczność. Z tego powodu zaleca się zbadanie wrażliwości na DMSO w zastosowanej linii komórkowej przed zabiegiem.
3. Użyj DMSO jako kontroli nośnika do traktowania komórek znajdujących się w lewej i prawej kolumnie każdej płytki (kolumny 1 i 12; Studnie od A do H).
4. Przykryj rozcieńczone tabliczki biblioteczne folią aluminiową i włóż oryginalne płytki biblioteczne do zamrażarki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

6. Ekran narkotykowy

UWAGA: Komórki traktowane DMSO powinny być używane do ustawiania podstawowej fluorescencji i dostosowywania bramkowania.

1. Płytka 5x10³ komórki w 96-dołkowej płytce w 99 μl kompletnej pożywki do wzrostu nerwowych komórek macierzystych.
2. Używając 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, potraktuj komórki rozcieńczonymi związkami bibliotecznymi o końcowym stężeniu 2 μM (1 μL 0,2 mM leku w 99 μl zawiesiny komórek) lub DMSO (kontrola). Inkubować płytki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Za pomocą 12-kanałowego pipetora wielokanałowego dodać 150 μl odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
4. Dysocjację komórek należy delikatnie rozcierać za pomocą 12-kanałowego pipetora wielokanałowego, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (zwykle od 20 do 30 razy). Ilość czasu potrzebna do całkowitej dysocjacji neurosfer będzie się różnić w zależności od linii GSC. Chociaż zalecany odczynnik do dysocjacji komórek (patrz materiały) jest bezpieczny, a inkubacja trwająca do 45 minut nie miała wpływu na żywotność w wielu testowanych liniach GSC, sprawdź, czy każda linia GSC ma być użyta w badaniach przesiewowych.
   UWAGA: Końcowa objętość w każdym dołku powinna wynosić około 250 μl (100 μl zawiesiny komórkowej + 150 μl odczynnika do dysocjacji komórek).
5. Określić procent komórek wykazujących ekspresję reportera GFAP:GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj standardowej strategii bramkowania. Najpierw narysuj rozproszenia do przodu i z boku, aby uzyskać ogólne pojęcie o rozmiarze i żywotności komórki. Następnie umieść bramę na żywotnej populacji jednokomórkowej. Jest to populacja, dla której zostanie oznaczona zielona fluorescencja (eGFP). Każdy związek, który powoduje wzrost odsetka komórek dodatnich pod względem GFP o ponad trzy odchylenia standardowe w stosunku do kontroli (traktowany DMSO), jest uważany za pozytywne "trafienie". Próg ten powinien być dostosowany w zależności od konkretnego zastosowania i pożądanej rygorystyczności.
   UWAGA: W przypadku ekranu o wysokiej przepustowości zaleca się użycie pojedynczego subklonu reportera GSC. Po zidentyfikowaniu trafienia każde trafienie powinno zostać zweryfikowane pod kątem dodatkowych subklonów zgłaszających z tej samej linii GSC. Aby zwiększyć pewność prawdziwych trafień, zaleca się również testowanie związków przeciwko subklonom reporterowym wyizolowanym z różnych linii neurosfer GSC.

Wyniki

Trzy niezależne linie neurosfer pochodzące od pacjentów zostały transdukowane za pomocą astroglejowego reportera lentiwirusa, kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP), połączone w ramce z kasetą oporności na zeocynę i sterowane przez ludzki element promotora GFAP (Rysunek 1). Następnie pojedyncze klony izolowano poprzez posiewanie 0,7 komórki na studzienkę na 96-dołkowej płytce ( Rysunek 2), a następnie cytometryczne określenie procentu komóre...

Dyskusja

Podczas gdy większość wcześniejszych badań nad GSC koncentrowała się przede wszystkim na markerach, które je definiują, w tym badaniu zdecydowaliśmy się przyjąć odwrotne podejście. Skupiamy się przede wszystkim na zróżnicowanych potomkach generowanych przez GSC (np. komórki wyrażające markery astroglejowe i neuronalne). Tutaj demonstrujemy wykorzystanie wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych leków opartego na komórkach, który opiera się na ludzkiej ekspresji GFP zależnej od promotora GFAP. Wszystkie eksperymenty...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Zbilansowany roztwór soli Hanka)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Wirus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml sterylny jednorazowy odczynnik zbiorniki	Corning	4870
płytka 6-dołkowa	Thermo Fisher Scientific	130184
96-dołkowa płytka	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Kolba Termo Wentylacyjna	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² Termo wentylowany	Fisher Scientific	130190
15 ml Probówki wirówkowe	Celltreat	229411
1,5 ml Probówki do mikrowirówek	Fisher Scientific	05-408-129
Pipeta wielokanałowa Ovation, 12-kanałowa, 0,5 - 20uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Pipeta wielokanałowa Ovation, 12-kanałowa, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
Wielokanałowe końcówki do pipet 25 i mu;	l VistaLab Technologies	4060-1002
Wielokanałowe 12-kanałowe końcówki do pipet 250 μ l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Stacjonarny cytometr przepływowy	EMD Millipore	0500-4005
NIH Kolekcje kliniczne 1 i 2 biblioteki małych cząsteczek	Evotec
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Do przygotowania pożywki z nerwowych komórek macierzystych (500 ml)			Stężenie końcowe
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Sól sodowa heparyny	Sigma Aldrich	H3149	0,0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5,4 mM
Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14,5 mM
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progesteron	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescyna	Sigma Aldrich	P5780	4.8 & mikro; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Filtr butelkowy, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Służy do filtrowania mediów sterylizacyjnych