Method Article

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

DOI:

10.3791/56176

⸱

January 10th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym i najbardziej śmiertelnym pierwotnym nowotworem mózgu u dorosłych, powodującym około 14 000 zgonów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych. Mediana przeżycia po rozpoznaniu wynosi mniej niż 15 miesięcy przy maksymalnej resekcji chirurgicznej, radioterapii i chemioterapii temozolomidem. Wyzwania związane z opracowywaniem skuteczniejszych metod leczenia GBM stają się coraz bardziej oczywiste i obejmują jego nieustępliwą inwazyjność, oporność na standardowe leczenie, złożoność genetyczną i zdolność adaptacji molekularnej oraz subpopulacje komórek GBM o fenotypowych podobieństwach do normalnych komórek macierzystych, zwanych tutaj komórkami macierzystymi glejaka (GSC). Ponieważ GSC są niezbędne do wzrostu i progresji guza, terapia oparta na różnicowaniu stanowi realną metodę leczenia tych nieuleczalnych nowotworów.

Poniższy protokół opisuje zbiór procedur mających na celu stworzenie wysokoprzepustowej platformy przesiewowej, mającej na celu identyfikację małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju GSC. Sercem systemu jest reporterowy konstrukt różnicowania fibrylarnego białka fibrylarnego gleju (GFAP). Protokół zawiera następujące procedury ogólne: 1) ustanowienie linii raportujących zróżnicowanie SGR; 2) badanie/walidacja znaczenia osoby zgłaszającej dla samoodnawiania się/zdolności klonogennej Sekretariatu Generalnego; oraz (3) badania przesiewowe leków oparte na cytometrii przepływowej o dużej pojemności.

Platforma przesiewowa zapewnia proste i niedrogie podejście do identyfikacji małych cząsteczek, które sprzyjają różnicowaniu GSC. Co więcej, wykorzystanie bibliotek leków zatwierdzonych przez FDA ma potencjał do identyfikacji środków, które mogą być szybciej ponownie wykorzystane. Oczekuje się również, że terapie, które promują różnicowanie rakowych komórek macierzystych, będą działać synergistycznie z obecnymi terapiami "standardowej opieki", które, jak wykazano, są ukierunkowane i eliminują przede wszystkim bardziej zróżnicowane komórki rakowe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania wykazały, że nowotwory zawierają małą populację komórek, określanych jako rakowe komórki macierzyste (CSC) lub komórki inicjujące nowotwór, które są odpowiedzialne za progresję nowotworu, przerzuty i odporność na chemio- i radioterapie 1,2. Obecność nowotworowych komórek macierzystych i ich bardziej zróżnicowanych potomków w obrębie nowotworów jest uważana za ważny czynnik sprzyjający heterogeniczności wewnątrznowotworowej, a tym samym stanowi główną przeszkodę w leczeniu nowotworów3. Hierarchia komórek nowotworowych, przedstawiona przez teorię rakowych komórek macierzy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Astroglejowe i neuronalne systemy reporterowe lentiwirusa zostały zakupione jako wstępnie zapakowane, skoncentrowane preparaty lentiwirusowe. Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu techniki cytometrii przepływowej. Ponadto, aby w pełni wykorzystać ten protokół, użytkownik będzie potrzebował dostępu do cytometru przepływowego o dużej przepustowości (akceptuje płytki 96-dołkowe jako źródło próbki).

1. Lentiwirusowy system reporterowy transkrypcji

UWAGA: We wszystkich analizach cytometrii przepływowej używaj komórek rodzicielskich, nietransdukowanych lub komórek transdukowanych wektorowo (niefluorescencyjnyc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy niezależne linie neurosfer pochodzące od pacjentów zostały transdukowane za pomocą astroglejowego reportera lentiwirusa, kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP), połączone w ramce z kasetą oporności na zeocynę i sterowane przez ludzki element promotora GFAP (Rysunek 1). Następnie pojedyncze klony izolowano poprzez posiewanie 0,7 komórki na studzienkę na 96-dołkowej płytce ( Rysunek 2), a następnie cytometryczne określenie procentu komóre.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy większość wcześniejszych badań nad GSC koncentrowała się przede wszystkim na markerach, które je definiują, w tym badaniu zdecydowaliśmy się przyjąć odwrotne podejście. Skupiamy się przede wszystkim na zróżnicowanych potomkach generowanych przez GSC (np. komórki wyrażające markery astroglejowe i neuronalne). Tutaj demonstrujemy wykorzystanie wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych leków opartego na komórkach, który opiera się na ludzkiej ekspresji GFP zależnej od promotora GFAP. Wszystkie eksperymenty.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo wsparta przez NIH R01CA187780.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ESGRO Complete AccutaseEMD MilliporeSF006
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650
HBSS (Zbilansowany roztwór soli Hanka)Sigma AldrichH6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Wirus)SBI (System Biosciences)SR10015VA-1
50 ml sterylny jednorazowy odczynnik zbiornikiCorning4870
płytka 6-dołkowaThermo Fisher Scientific130184
96-dołkowa płytkaFalcon353072
Biolite T25 cm² Kolba Termo WentylacyjnaThermo Fisher Scientific130189
Biolite T75 cm² Termo wentylowanyFisher Scientific130190
15 ml Probówki wirówkoweCelltreat229411
1,5 ml Probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408-129
Pipeta wielokanałowa Ovation, 12-kanałowa, 0,5 - 20uLVistaLab Technologies1060-0020
Pipeta wielokanałowa Ovation, 12-kanałowa, 5-250uLVistaLab Technologies1060-0250
Wielokanałowe końcówki do pipet 25 i mu; l VistaLab Technologies4060-1002
Wielokanałowe 12-kanałowe końcówki do pipet 250 μ lVistaLab Technologies4060-9025
Guava easyCyte 5HT Stacjonarny cytometr przepływowyEMD Millipore0500-4005
NIH Kolekcje kliniczne 1 i 2 biblioteki małych cząsteczekEvotec
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Do przygotowania pożywki z nerwowych komórek macierzystych (500 ml)Stężenie końcowe
BSAGoldBio.comA-421-2500,20%
DMEM/F12 10XCorning90-091-PB1X
Sól sodowa heparynySigma AldrichH31490,0002%
HEPES 1MSigma AldrichH40365,4 mM
Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100X)Life Technologies41400-0451X
NaHCO3Sigma AldrichS-576114,5 mM
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) 100XGibco15140-1221X
ProgesteronSigma AldrichP878316 nM
PutrescynaSigma AldrichP57804.8 & mikro; M
Basic FGF (FGF2), HumanGoldBio1140-02-5010 ng/ml
EGF, HumanGoldBio1150-04-10020 ng/ml
Filtr butelkowy, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, IndCorning431160Służy do filtrowania mediów sterylizacyjnych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-406....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glioblastoma Stem CellsFlow Cytometry ScreeningGFAP Reporter ConstructSmall Molecule ScreeningCellular Differentiation AssayDrug Repurposing PlatformLentivirus TransductionNeurosphere FormationGFP Positive CellsHigh Throughput Screening

Related Articles