Artykuł metodologiczny

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56186

⸱

29 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC), University of Cologne, 2Cologne Center for Genomics (CCG), University of Cologne, 3Cologne Excellence Cluster for Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), Research Center and Systems Biology of Ageing Cologne, University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Streszczenie

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest powszechnie stosowaną techniką mapowania lokalizacji posttranslacyjnie zmodyfikowanych histonów, wariantów histonów, czynników transkrypcyjnych lub enzymów modyfikujących chromatynę w danym locus lub w skali całego genomu. Połączenie testów ChIP z sekwencjonowaniem nowej generacji (tj. ChIP-Seq) jest potężnym podejściem do globalnego odkrywania sieci regulacyjnych genów i poprawy funkcjonalnej adnotacji genomów, zwłaszcza niekodujących sekwencji regulatorowych. Protokoły ChIP zwykle wymagają dużych ilości materiału komórkowego, co wyklucza możliwość zastosowania tej metody do badania rzadkich typów komórek lub biopsji małych tkanek. Aby test ChIP był zgodny z ilością materiału biologicznego, którą zwykle można uzyskać in vivo podczas wczesnej embriogenezy kręgowców, opisujemy tutaj uproszczony protokół ChIP, w którym liczba kroków wymaganych do wykonania testu została zmniejszona w celu zminimalizowania utraty próbki. Ten protokół ChIP został z powodzeniem wykorzystany do zbadania różnych modyfikacji histonów w różnych embrionalnych tkankach kurczaków i dorosłych myszy przy użyciu niskiej i średniej liczby komórek (5 x 104 - 5 x 105 komórek). Co ważne, protokół ten jest kompatybilny z technologią ChIP-seq wykorzystującą standardowe metody przygotowania bibliotek, zapewniając w ten sposób globalne mapy epigenomiczne w bardzo istotnych tkankach embrionalnych.

Wprowadzenie

Modyfikacje potranslacyjne histonów są bezpośrednio zaangażowane w różne procesy zależne od chromatyny, w tym transkrypcję, replikację i naprawę DNA1,2,3. Co więcej, różne modyfikacje histonów wykazują dodatnie (np. H3K4me3 i H3K27ac) lub ujemne (np. H3K9me3 i H3K27me3) korelacje z ekspresją genów i mogą być szeroko zdefiniowane odpowiednio jako aktywujące lub represyjne znaczniki histonów2,3. W związku z tym globalne mapy modyfikacji histonów, zwane również mapami epigenomicznymi, stały się potężnymi i uniwersalnymi narzędziami do funkcjonalnego opisywania genomów kręgowców4,5. Na przykład dystalne sekwencje regulatorowe, takie jak wzmacniacze, można zidentyfikować na podstawie obecności specyficznych sygnatur chromatyny (np. aktywnych wzmacniaczy: H3K4me1 i H3K27ac), które odróżniają je od proksymalnych regionów promotorowych (np. aktywnych promotorów: H3K4me3)6,7,8. Z drugiej strony, geny z głównymi funkcjami regulacyjnymi tożsamości komórkowej są zwykle znajdowane z szerokimi domenami chromatyny oznaczonymi jako H3K4me3 lub H3K27me3, w zależności od transkrypcyjnie aktywnego lub nieaktywnego statusu podstawowych genów, odpowiednio9,10. Podobnie, ekspresja głównych genów tożsamości komórkowej wydaje się być często kontrolowana przez wielokrotne i przestrzennie zgrupowane wzmacniacze (tj. super-wzmacniacze), które można zidentyfikować jako szerokie domeny oznaczone H3K27ac11.

Obecnie, mapy modyfikacji histonów są generowane przy użyciu technologii ChIP-seq, która w porównaniu do poprzednich podejść, takich jak ChIP-chip (ChIP sprzężony z mikromacierzami) zapewnia wyższą rozdzielczość, mniej artefaktów, mniej szumów, większy zasięg i niższe koszty12. Niemniej jednak generowanie map epigenomicznych przy użyciu technologii ChIP-seq ma swoje nieodłączne ograniczenia, związane głównie ze zdolnością do skutecznego przeprowadzenia ChIP w próbkach będących przedmiotem zainteresowania. Tradycyjne protokoły ChIP zazwyczaj wymagały milionów komórek, co ogranicza możliwość zastosowania tej metody do linii komórkowych in vitro lub komórek, które można łatwo wyizolować in vivo (np. Komórki krwi). W ciągu ostatnich kilku lat opisano szereg zmodyfikowanych protokołów ChIP kompatybilnych z niską liczbą komórek13,14,15,16. Jednak protokoły te są specjalnie zaprojektowane do łączenia z sekwencjonowaniem nowej generacji (tj. ChIP-seq) i zazwyczaj używają metod przygotowania biblioteki ad hoc13,14,15,16.

Tutaj opisaliśmy protokół ChIP, który może być użyty do zbadania profili modyfikacji histonów przy użyciu niskiej i pośredniej liczby komórek (5 x 104 - 5 x 105 komórek) w wybranych loci (np. ChIP-qPCR) lub globalnie (tj. ChIP-seq) (Rysunek 1). W połączeniu z technologią ChIP-seq, nasz protokół ChIP może być używany razem ze standardowymi metodami przygotowania bibliotek, dzięki czemu jest szeroko dostępny dla wielu laboratoriów10. Protokół ten został wykorzystany do zbadania kilku znaczników histonowych (np. H3K4me3, H3K27me3 i H3K27ac) w różnych tkankach embrionalnych kurczaka (np. Rdzeniowej cewie nerwowej (SNT), protuberancjach czołowo-nosowych i epiblastach). Przewidujemy jednak, że powinno to mieć szerokie zastosowanie do innych organizmów, w których próbki istotne biologicznie i/lub klinicznie można uzyskać tylko w niewielkich ilościach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgodnie z niemieckimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, do przeprowadzenia eksperymentów na zarodkach kurzych nie była potrzebna zgoda Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Zgodnie z lokalnymi wytycznymi, tylko eksperymenty z zarodkami kurczaków HH44 (18-dniowych) i starszych wymagają zatwierdzenia przez IACUC. Jednak wszystkie zarodki użyte w tym badaniu znajdowały się we wcześniejszych stadiach rozwoju embrionalnego (tj. HH19 (72 h)).

UWAGA: Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego opisu testu ChIP, tak aby można go było skutecznie połączyć z qPCR lub sekwencjonowaniem nowej generacji (tj. ChIP-seq) w celu zbadania modyfikacji histonów w próbkach embrionalnych o niskiej liczebności (od 5 x 104 - 5 x 105 komórek dla każdej reakcji ChIP) i różnych typach tkanek (Rysunek 1). Protokół powinien mieć zastosowanie do badania profili wiązania czynników transkrypcyjnych i koaktywatorów (np. p300). Jednak ze względu na mniejszą obfitość tych białek regulatorowych, prawdopodobnie wymagana będzie większa liczba komórek (5 x 105 - 5 x 106 komórek na każdą reakcję ChIP).

1. Przygotowanie jaj i mikrodysekcja kurczaka SNT

UWAGA: Procedura mikrodysekcji technicznie różni się w zależności od tkanki i modelu zwierzęcego do modelu zwierzęcego. W tej sekcji opisano szczegółowo protokół preparacji stosowany do uzyskania ramiennych skrawków SNT z zarodków kurcząt w stadium HH19 jako przykład.

  1. Inkubuj płodne jaja kur rasy white leghorn, uzyskane od lokalnego hodowcy, w orientacji poziomej w temperaturze 37 °C i wilgotności 80% przez 3 dni, aby uzyskać zarodki kurze w stadium HH19.
  2. Określ etapy zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania rozwoju embrionalnego kurczaka Hamburger i Hamilton17.
  3. Wszystkie mikrodysekcje należy wykonywać w niskich temperaturach, w przeciwnym razie integralność chromatyny może być zagrożona.
  4. Wyizolować zarodki HH19.
    1. Aby umożliwić dostęp do zarodków, należy wyekstrahować 3 ml albuminy za pomocą 10 ml strzykawki z igłą (0,90 x 40 mm) w celu obniżenia blastodermy.
    2. Zrób mały otwór w jaju za pomocą cienkich nożyczek i dodaj 1 ml roztworu Locke'a (patrz Materiały dodatkowe dla przepisu), aby ułatwić usunięcie błon zewnątrzzarodkowych.
    3. Wstrzyknąć 10% roztwór czarnego atramentu indyjskiego/Locke'a za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą (0,55 x 25 mm2) pod blastoderm, aby ułatwić wizualizację zarodków.
    4. Odetnij błonę pozazarodkową otaczającą zarodek za pomocą drobnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
    5. Za pomocą perforowanej łyżki przenieś zarodek na 4,5 cm szalkę Petriego zawierającą 20 ml 1x roztworu PBS.
  5. Wypreparuj owodnię i pozostałe części błony pozazarodkowej za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym.
  6. Przeciąć poprzeczny segment SNT na poziomie ramiennym zarodka, rozciągając się doogonowo do okolicy klatki piersiowej, aby wyizolować SNT (Ryc. 2).
  7. Usuń tkanki, które bocznie/brzusznie otaczają SNT (np. mezoderma płytki bocznej, ektoderma, struna grzbietowa i aorta) za pomocą kleszczy (Rysunek 2).
  8. Zanurzyć każdy wycięty segment SNT kurczaka na 3,5 cm szalce Petriego zawierającej 5 ml ciepłej (37 °C) trypsyny (roztwór trypsyny/EDTA 1:250).
  9. Przerwij leczenie trypsyną, gdy rozluźnienie tkanek nienerwowych wokół SNT zostanie wykryte pod mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Czas trypsynizacji musi być ściśle kontrolowany, aby uniknąć nadmiernego trawienia i dyspersji tkanki nerwowej oraz zachować integralność strukturalną SNT.
  10. Po leczeniu trypsyną należy ręcznie usunąć pozostałe tkanki mezenchymalne i ektodermalne, aby przygotować czysty wycinek SNT.
  11. Przenieś sekcję SNT do probówki o pojemności 1,5 ml i błyskawicznie zamroź ją w ciekłym azocie. Po zgromadzeniu wystarczającej liczby skrawków SNT (zebrać skrawki SNT z ~30 zarodków kurczaka na jedną reakcję ChIP), przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Jeśli wystarczająca ilość tkanki embrionalnej (tj. 5 x 105 - 5 x 106 komórek) może zostać wycięta z jednego lub kilku zarodków kurczaka, zamrażanie nie jest konieczne i można przejść bezpośrednio do kolejnych kroków. Zapoznaj się z przewodnikiem rozwiązywania problemów w tabeli 1.
    UWAGA: Uwaga! Ciekły azot ma wyjątkowo niską temperaturę, należy go odpowiednio zabezpieczyć.

2. Sieciowanie białek do DNA: Dzień 1

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Dodać 500 μl DMEM z 10% FBS i 10 μl 1 M Na-maślanu bezpośrednio do zamrożonej tkanki lub, alternatywnie, natychmiast do świeżo wypreparowanej tkanki. Homogenizować komórki, delikatnie zawieszając je pipetą o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Dodanie Na-maślanu jest opcjonalne, ale zalecane w przypadku badania acetylacji histonów. Zamiast DMEM-10% FBS, próbki można ponownie zawiesić w 1x PBS z 0,1% BSA. Dodanie FBS lub BSA jest opcjonalne, ale ułatwia granulowanie próbek w kolejnych etapach wirowania.
  2. Dodaj 13,5 μl 37% formaldehydu (1% formaldehydu na końcu) i umieść na rotatorze na 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Uwaga! Formaldehyd jest toksyczny.
  3. Dodaj 25 μl 2,5 M glicyny do probówki i umieść ją na rotatorze na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby ugasić formaldehyd.
  4. Wirować probówkę o masie 850 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej. Odrzucić supernatant.
  5. Przepłukać osad jednorazowo 500 μl zimnego, świeżo przygotowanego buforu do przemywania (receptura znajduje się w materiałach dodatkowych), odwirować w temperaturze 850 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.

3. Liza i Sonikacja

  1. Przygotuj kompletny bufor do lizy (LB) (przepis znajduje się w materiałach uzupełniających) i schłodzić na lodzie. Na 1 ml użyj 950 μl LB, 40 μl koncentratu inhibitora proteazy (25x) i 10 μl 100% PMSF.
  2. Zawiesić osad w 300 μl kompletnego LB przez pipetowanie i umieścić go na platformie kołyszącej na 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Sonikować próbki przy użyciu następujących ustawień: Temp = 4 °C, Czas całkowity = 7 minut, interwał "włączenia" = 30 s, interwał "wyłączenia" = 30 s, amplituda = 25%
    UWAGA: Warunki sonikacji muszą być zoptymalizowane dla każdej tkanki i będą się różnić w zależności od użytego sonikatora. Zaleca się stosowanie najniższych ustawień sonikacji, które skutkują ściętym DNA o wielkości od 200 do 600 pz. Ścinanie różni się znacznie w zależności od rodzaju tkanki, ilości, objętości sonikacji, warunków sieciowania i sprzętu. Zapoznaj się z przewodnikiem rozwiązywania problemów w Tabeli 1.
  4. Odwirować sonifikowaną próbkę w temperaturze 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzać resztki komórkowe.
  5. Przenieść lizat (supernatant) do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Jeśli materiał wyjściowy zostanie uznany za wystarczający do dwóch eksperymentów ChIP, wówczas do sonikowanej chromatyny można dodać 300 μL pełnego LB (tj. końcowa objętość: 600 μL).
  6. Dodać 30 μl 10% etoksylatu oktylofenolu na każde 300 μl sonikowanego lizatu (stężenie końcowe: 1%) i wymieszać pipetując.
    UWAGA: Uwaga! Etoksylat oktylofenolu jest silnie toksyczny (doustnie, skórnie, wziewnie).

4. Inkubacja przeciwciał

  1. Porcjować 330 μl sonikowanego lizatu do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml: 300 μl dla ChIP i 30 μl jako kontrola wejściowa (10% materiału wyjściowego). Przechowywać "wejściową próbkę kontrolną o pojemności 30 μl" w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Jeśli dwie reakcje ChIP są przeprowadzane z tej samej próbki, wówczas 660 μL sonikowanego lizatu można rozprowadzić do trzech probówek o pojemności 1,5 ml (300 μL dla ChIP#1, 300 μL dla ChIP#2 i 60 μL jako kontrola wejściowa (20% materiału wyjściowego każdego ChIP)).
  2. Dodać 3 - 5 μg przeciwciała do 300 μl podwielokrotności sonikowanej chromatyny i odwrócić, aby wymieszać.
    UWAGA: W tym badaniu każdą reakcję ChIP przeprowadzono z przeciwciałem specyficznym dla histonu H3 tri metylowanego w K4 (H3K4me3), histonu H3 di metylowanego w K4 (H3K4me2), histonu H3 trimetylowanego w K27 (H3K27me3) i triacetylacji histonu H3 w K27 (H3K27me3). Powodzenie tego protokołu jest całkowicie zależne od jakości zastosowanego przeciwciała. Przeciwciało powinno być swoiste i skuteczne w immunoprecypitacji określonego białka. Ważne jest, aby określić ilość przeciwciała, którą można wykorzystać do immunoprecypitacji usieciowanego kompleksu białko-DNA. Również swoistość przeciwciała można sprawdzić za pomocą Western blot, aby upewnić się, że wykrywa ono właściwe białko. Przeciwciało, które wykrywa wiele niespecyficznych prążków, nie jest zalecane w przypadku ChIP.
  3. Umieścić probówkę na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C przez noc (12 - 16 godzin), aby związać przeciwciało z chromatyną.
    UWAGA: Zapoznaj się z przewodnikiem rozwiązywania problemów w Tabeli 1.

5. Przygotowanie koralików magnetycznych: Dzień 2

  1. Podwielokrotność 50 - 100 μl zawiesiny białka G/kulek magnetycznych do każdej reakcji ChIP do 1,5 ml probówki do mikrofuge na lodzie.
  2. Umyj kulki magnetyczne trzykrotnie zimnym roztworem blokowym (przepis znajduje się w materiałach uzupełniających) (4 °C). Dodać 500 μl zimnego roztworu blokowego i wymieszać, odwracając lub trzepiąc. Włóż rurkę do uchwytu magnetycznego i poczekaj, aż koraliki osiądą z boku tuby. Odlej klarowny płyn i powtórz. Po ostatnim praniu usuń cały płyn za pomocą końcówki nakładającej żel.

6. Immunoprecypitacja chromatyny

  1. Dodaj 300 μl chromatyny związanej z przeciwciałami do umytych kulek i odwróć, aby wymieszać.
  2. Obracać pionowo na rotatorze probówki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny, aby związać przeciwciało z kulkami.

7. Umyj, eluuj i odwróć linki krzyżowe

  1. Schłodzić bufor myjący RIPA (patrz materiały uzupełniające dla przepisu) na lodzie, ustawić łaźnię wodną na 65 °C i wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C.
  2. Umyj kulki związane z chromatyną cztery razy w 1 ml zimnego buforu myjącego RIPA i trzymaj na lodzie. W tym celu dodaj 1 ml zimnego buforu myjącego RIPA i wymieszaj, odwracając lub strzepując. Umieść rurkę w uchwycie magnetycznym i poczekaj, aż koraliki osiądą z boku rurki. Odlej klarowny płyn i powtórz.
    UWAGA: Liczba płukań z użyciem buforu myjącego RIPA może wymagać optymalizacji w zależności od typu próbki, obfitości próbki i użytego przeciwciała. Zwiększona liczba płukań zmniejszy tło, ale także zmniejszy całkowitą ilość odzyskanego DNA, co może zagrozić dalszej analizie za pomocą qPCR lub ChIP-seq.
  3. Dodaj 1 ml TE/50 mM NaCl do probówki i przenieś kulki związane z chromatyną w TE/50 mM NaCl do świeżej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml przed usunięciem cieczy za pomocą uchwytu magnetycznego, jak opisano powyżej.
  4. Wiruj kulki o masie 900 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, umieść rurkę z powrotem w uchwycie magnetycznym i usuń wszystkie pozostałe TE za pomocą końcówki ładującej żel.
  5. Dodać 210 μl buforu elucyjnego (patrz materiały uzupełniające dla receptury) w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić przez trzepanie.
  6. Eluować przez 15 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym, wstrząsając.
  7. Wiruj koraliki o wymiarach 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i umieść rurkę w uchwycie magnetycznym.
  8. Przenieś supernatant (~200 μl) do świeżej probówki do mikrofuge, gdy kulki opadną.
  9. Rozmrozić wejściowe próbki kontrolne (30 μl) od -20 °C do temperatury pokojowej (zamrożone w kroku 4.1), dodać 3 objętości buforu elucyjnego (90 μl) i wymieszać przez krótkie wirowanie.
  10. Inkubować wióry i próbki kontrolne w temperaturze 65 °C przez noc (12-16 godzin) w celu odwrócenia usieciowań.

8. Trawienie białka komórkowego i RNA: Dzień 3

  1. 8.1W temperaturze pokojowej dodać 1 objętość buforu TE na probówkę (w celu rozcieńczenia SDS) i odwrócić do mieszania: dodać 120 μl TE do 120 μl próbki kontrolnej i 200 μL TE do 200 μL próbki ChIP.
  2. Dodać RNazę A do końcowego stężenia 0,2 mg/ml i odwrócić do mieszania: dodać 2,4 μl 20 mg/ml RNazy A do 240 μl próbki kontrolnej i 4 μl 20 mg/ml RNazy A do 400 μl próbki ChIP.
  3. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 2 godziny w celu wytrawienia RNA.
  4. Dodać proteinazę K do końcowego stężenia 0,2 mg/ml i odwrócić do mieszania: dodać 2,4 μl 20 mg/ml proteinazy K do 240 μl próbki kontrolnej i 4 μl 20 mg/ml proteinazy K do 400 μl próbki ChIP.
  5. Inkubować w temperaturze 55 °C w łaźni wodnej przez 2 godziny w celu wytrawienia białka i oczyszczenia DNA.

9. ChIP-qPCR

UWAGA: Wykonaj ekstrakcję i oczyszczanie DNA, zgodnie z opisem w Materiałach Uzupełniających.

UWAGA: Sprawdź skuteczność sonikacji zgodnie z opisem w Materiałach Uzupełniających, aby potwierdzić, że uzyskano fragmenty DNA o długości od 200 do 500 pz (Rysunek 3).

UWAGA: Kluczowym krokiem jest ustalenie, czy ChIP faktycznie zadziałał. Jeśli znane są miejsca wiązania genomu dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, startery można zaprojektować do ilościowego PCR (qPCR) w celu określenia, czy znane miejsca są specyficznie wzbogacone w DNA ChIP, w porównaniu z regionami kontroli ujemnej, które nie powinny być związane przez białka kandydujące. Jako przykład, praca ta przedstawia wyniki ChIP-qPCR uzyskane za pomocą ChIP wykonane dla H3K4me3 (znacznik histonu aktywnego promotora) i H3K27me3 (znacznik histonu nieaktywnego promotora) w odcinkach SNT wyizolowanych z zarodków piskląt HH14 ( Figura 4A).

  1. Wymieszać każdą parę starterów (do przodu i do tyłu) w tej samej probówce i przygotować stężenie podstawowe po 20 μM przy użyciu dH2O (Tabela 2).
    UWAGA: wydajność każdej pary starterów powinna być oceniona przed analizą ChIP-qPCR.
  2. Użyj ChIP i 20% wejściowego kontrolnego DNA uzyskanego w kroku 8.5 do optymalizacji qPCR.
    UWAGA: Wejściowe DNA jest zwykle rozcieńczane 20x (do 1% materiału wyjściowego użytego w reakcjach ChIP) do analizy qPCR.
  3. Na każde 10 μl PCR wymieszać następujące składniki w probówce do PCR: dla DNA mastermix dodać 2 μl dH2O, 2,5 μl zielonej mieszanki SYBR i 1 μl DNA (z ChIP lub 1% wsadu); dla mastermixu ze starterami dodać 2,375 μL dH2O, 2,5 μL zielonej mieszanki SYBR, i 0,125 μl mieszanki starterów do przodu i do tyłu.
  4. Mieszać próbki przez wirowanie przez 2 sekundy i krótko odwirowywać przy 900 x g przez 1 minutę.
  5. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym (przykład zastosowanych tutaj starterów i warunków cyklicznych można znaleźć odpowiednio w Tabeli 2 i Tabeli 3).
    UWAGA: Analiza danych ChIP-qPCR: Sygnały ChIP są obliczane jako procent danych wejściowych. Krótko mówiąc, po uzyskaniu wartości Ct dla każdej reakcji qPCR, do wartości Ct uzyskanych dla wejściowych reakcji DNA stosuje się współczynnik rozcieńczenia wynoszący 100 lub 6,644 cykli (log2 ze 100). Następnie, dla danego obszaru zainteresowania (tj. pary starterów), sygnały ChIP są obliczane w następujący sposób:
    Skorygowane wejście = Ct (wejście) - 6,644
    Sygnał ChIP = 100 x POWER(2; średnia skorygowanej wartości Input-Ct ChIP sample)

10. Przygotowanie biblioteki ChIP-seq; Koniec naprawy: Dzień 4

  1. Rozcieńczyć do 100 ng ChIP-DNA w 60 μl buforu elucyjnego (patrz Tabela Materiałów).
  2. Dodać 40 μl mieszanki do naprawy końcówek i delikatnie odpipetować 10 razy.
  3. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut na termocyklerze.
  4. Zmieszać kulki magnetyczne i dodać 160 μl do probówki zawierającej końcową mieszankę naprawczą. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej .
  5. Umieść rurkę w uchwycie magnetycznym i poczekaj, aż koraliki osiądą z boku tuby.
  6. Odlej klarowny płyn.
  7. Trzymając probówkę na uchwycie magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH.
  8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s i odrzucić supernatant. Powtórz raz..
  9. Trzymaj probówkę przez 15 minut na uchwycie magnetycznym w temperaturze pokojowej. Gdy granulka wyschnie, wyjmij rurkę z uchwytu magnetycznego.
  10. Zawiesić osad w 20 μl bufora do sporządzania zawiesiny. Delikatnie odpipetuj 10 razy, aby dokładnie wymieszać.
  11. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  12. Umieść rurkę w uchwycie magnetycznym i poczekaj, aż koraliki osiądą z boku rurki. Przenieść 17,5 μl supernatantu do nowej probówki.

11. Przygotowanie biblioteki ChIP-seq; Końce Adenylate 3'

  1. Dodać 12,5 μl mieszanki ogonkowej A do nowej probówki i dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Umieścić probówkę na termocyklerze i inkubować zgodnie z następującym programem: 37 °C przez 30 min, 70 °C przez 5 min i utrzymywać w temperaturze 4 °C

12. Przygotowanie biblioteki ChIP-seq; Adaptery Ligate

  1. Dodać 2,5 μl buforu do resuspensji, 2,5 μl mieszanki ligacyjnej i 2,5 μl odpowiedniego wskaźnika adaptera RNA. Dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy.
  2. Inkubować na termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 30 °.
  3. Dodać 5 μl buforu do podwiązywania i dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy.
  4. Zwirować kulki magnetyczne i dodać 42,5 μl do próbki. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i poczekaj, aż koraliki osiądą z boku rurki i odleją klarowny płyn
  6. Trzymając probówkę na uchwycie magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH.
  7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s i odrzucić supernatant. Powtórz raz.
  8. Trzymaj probówkę na uchwycie magnetycznym i pozwól próbce wyschnąć na powietrzu przez 15 minut.
  9. Wyjąć probówkę z uchwytu magnetycznego i ponownie zawiesić osad w 52,5 μl buforu do resuspensji. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, umieścić probówkę w uchwycie magnetycznym i poczekać, aż kulki osiądą z boku probówki. Przenieść 50 μl klarownego supernatantu do nowej probówki.
  10. Zmieszać kulki magnetyczne i dodać 50 μl do próbki. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym i poczekaj, aż koraliki osiądą z boku rurki i odlej przezroczysty płyn.
  12. Trzymając probówkę na uchwycie magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH.
  13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s i odrzucić supernatant. Powtórz raz.
  14. Trzymaj probówkę na uchwycie magnetycznym i pozwól próbce wyschnąć na powietrzu przez 15 minut.
  15. Wyjąć probówkę z uchwytu magnetycznego i ponownie zawiesić osad w 27,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy.
  16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, umieścić probówkę w uchwycie magnetycznym i poczekać, aż kulki osiądą z boku probówki. Przenieść 25 μl klarownego supernatantu do nowej probówki.

13. Przygotowanie biblioteki ChIP-seq; Amplifikacja fragmentów DNA

  1. Umieścić 12,5 μl matrycy w probówce PCR o pojemności 0,2 ml. Dodać 2,5 μl koktajlu starterowego PCR, 10 μl ulepszonej mieszanki PCR. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Umieść probówkę na termocyklerze i postępuj zgodnie z warunkami opisanymi w tabeli 4.
  2. Zmieszać kulki magnetyczne i dodać 25 μl do próbki. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym, poczekaj, aż koraliki osiądą z boku rurki i odlej przezroczysty płyn.
  4. Trzymając probówkę na uchwycie magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s i odrzucić supernatant. Powtórz raz.
  5. Trzymaj probówkę na uchwycie magnetycznym i pozwól próbce wyschnąć na powietrzu przez 15 minut. Wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego i ponownie zawieś osad w 32,5 μl buforu do rezaparcji. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy.
  6. Inkubować probówkę/płytkę PCR przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umieścić probówkę/płytkę PCR na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej, poczekać, aż kulki osiądą na boku probówki i przenieść 30 μl supernatantu do nowej probówki.

14. Przygotowanie biblioteki ChIP-seq; Walidacja biblioteki

UWAGA: Walidacja biblioteki jest przeprowadzana przy użyciu systemu kontroli jakości DNA i RNA. Przygotowanie drabinki: podwielokrotność 1 μl drabinki genomowego DNA do pierwszej probówki/studzienki i dodać 3 μl buforu do próbki.

  1. Przygotowanie próbki: zmieszać 1 μl próbki z biblioteki (10 - 100 ng/μl) z 3 μl buforu próbki w probówce. Zakręć w dół, a następnie wiruj z maksymalną prędkością przez 5 s. Odwirować w dół, aby umieścić próbkę na dnie probówki.
  2. Załaduj próbki do systemu kontroli jakości.
  3. Po zakończeniu przebiegu przeanalizuj wyniki, ustawiając kontrast na maksymalną wartość, aby upewnić się, że w próbce nie ma żadnych dimerów starterów (Rysunek 5); dimery starterów powinny odpowiadać w paśmie około 135 pz. Jeśli występuje nawet słabe prążki, należy przystąpić do drugiego oczyszczania, dodając bufor elucyjny (patrz tabela materiałów) do objętości 50 μl i dodać 47,5 μl zmieszanych kulek magnetycznych. Jeśli stężenie próbki jest zbyt niskie (<2 nM), należy przystąpić do przeprowadzenia PCR (krok 13.1), stosując 18 cykli zamiast 15, z objętością 12,5 μl próbki pozostałą z kroku 12.16.
  4. Określ ilościowo biblioteki indywidualnie za pomocą qPCR, korzystając z dostępnych na rynku zestawów.
    UWAGA: Pule bibliotek mogą być sekwencjonowane przy użyciu sekwencera z pojedynczym odczytem protokołu 1 x 50 nt w celu uzyskania 30 M odczytów na próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zaprezentować wydajność naszego protokołu ChIP, przeprowadzono eksperymenty ChIP-seq z wykorzystaniem połączonych sekcji SNT z embrionów kurzych w stadium HH19, wyrostków szczękowych embrionów kurzych w stadium HH22 oraz embrionów kurzych w stadium HH3, w celu zbadania profilu wiązania różnych modyfikacji histonowych (t.j. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 i H3K27me3). Po uzyskaniu DNA z ChIP, wydajność sonikacji oceniono za pomocą elektroforezy żelowej na żelu agarozowym odpowiednic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Profilowanie epigenomiczne modyfikacji histonów za pomocą ChIP-seq może być wykorzystane do poprawy funkcjonalnej adnotacji genomów kręgowców w różnych kontekstach komórkowych 4,5,18. Te profile epigenomiczne mogą być wykorzystywane między innymi do identyfikacji elementów wzmacniających, do definiowania stanu regulacyjnego wzmacniaczy (tj. aktywnych, zagruntowanych lub opanowanych) oraz do definiowania głównych regulat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogłyby zostać ujawnione.

Podziękowania

Autorzy dziękują Janowi Appelowi za doskonałą pomoc techniczną podczas tworzenia tego protokołu. Prace w laboratorium Rada-Iglesias są wspierane przez fundusze CMMC, granty badawcze DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 i TE 1007/3-1), grant UoC Advanced Researcher Group oraz grant CECAD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reagent
BSA w proszkuCarl Roth3737.3
Bufor fosforanowo-solny (PBS)Sigma AldrichD8537
Tris-HCL pH 8,0Sigma AldrichT1503
NaClCarl Roth3957.2
EDTACarl Roth8043.2
EGTACarl Roth3054.2
Na-deoksycholanSigma AldrichD6750-24
N-lauroilsarkozynaSigma Aldrich61743-25G
HepesApplichemA3724,0250
LiClCarl Roth3739.2
NP-40Sigma AldrichI3021-100ml
SDSCarl Roth1833
Białko G/kulki magnetyczneInvitrogen1004D
37% FormaldehydSigma Aldrich252549-1L
RNaza glicyny
Peqlab12-RA-03
Proteinaza KSigma Aldrich46,35 E
Na-maślanSigma Aldrich
Inhibitor proteinazyRoche5892791001
SYBRgreen Mixbiozym617004
dH2OSigma AldrichW4502
1 Kb drabinkaThermofisherSM1333
Orange GSigma Alrich03756-25
AgaroseInvitrogen16500-500
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)Gibco25200-072
Etoksylat oktylofenolu (Triton X 100)Roth3051.4
DMEM (Dulbecco´ s Modified Eagle Medium)Gibco31331-028
Końcówki do ładowania żelu MultiflexA.HartensteinGS21
qPCR PłytkiSarstedt721,985,202
384 wellSarstedt721,985,202
Probówki 1,5 mLSarstedt72,706
100 - 1,000 µ L Końcówki filtracyjneSarstedt70,762,211
2 - 20 &mikro; L Końcówki filtracyjneSarstedt70,760,213
2 - 200 &mikro; L Końcówki filtracyjneSarstedt70,760,211
0,5 - 10 &mikro; L Końcówki filtraPrzeciwciało Sarstedt701,116,210
H3K27me3Aktywny motyw39155
Przeciwciało H3K27acAktywny motyw39133
Przeciwciało H3K4me3Aktywny motyw39159
Przeciwciało H3K4me2Aktywny motyw39141
End Repair MixIlluminaFC-121-4001
Koraliki paramagnetyczneBeckman CoulterA63881
Bufor do zawieszaniaIlluminaFC-121-4001
A-Tailing MixIlluminaFC-121-4001
Ligation MixIlluminaFC-121-4001
Indeksy adaptera RNAIlluminaRS-122-2101
Stop bufor ligacyjnyIlluminaFC-121-4001
Koktajl starterowy do PCRIlluminaFC-121-4001
Wzmocniona mieszanka do PCRIlluminaFC-121-4001
Drabinka genomowego DNAAgilent5067-5582
Bufor elucyjnyAgilent19086
Bufor do próbekAgilent5067-5582
Zestawkwantyfikacyjny bibliotekiKapa BiosystemsKK4835 – 07960204001
Płodne jaja z białka kurczakaLSL Rhein MainKN: 15968
Igła (Neoject)A.Hartenstein10001
Strzykawka (Ecoject 10 mL)Dispomed witt oHG21010
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
WirówkaHermleZ 216 MK
WytrząsarkaITABISMKR13
SonikatorActiveMotive EpiShear sonda Sonikator
SonicatorDiagenodeBioruptor Plus
RotatorStuartSB3
Zmienna głośność (5 – 1,000 μ L) pipety:EppendorfN/A
TimerSigmaN/A
Uchwyt magnetycznyThermo FisherDynaMag-2 12321D
Spinner stołowyHeathrow ScientificSprout
MixerLMSVTX 3000L
Real-Time PCR CyclerLight Cycler; Serial Nr.5662
PCR CyclerApplied BiosystemsGene Amp PCR System 9700
System kontroli jakości DNA i RNAAgilentAgilent 4200 TapeStation System
KleszczeDumont5-Inox-H
Perforowana łyżkaŚwiatowe instrumenty precyzyjne501997
SLB2659V Roche

Bibliografia

  1. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
  4. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  6. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  8. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  9. Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
  10. Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
  11. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  12. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  13. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  14. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  15. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  16. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
  18. Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
  19. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  20. Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pr bki o niskiej zawarto citkanka embrionalnamodyfikacje histon wwydajno sonikacjiwi zanie przeciwciakuleczki magnetyczneoczyszczanie DNAilo ciowy PCR

Powiązane artykuły