Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Summary

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Abstract

Analiza globalnych zmian ekspresji genów jest cennym narzędziem do identyfikacji nowych szlaków leżących u podstaw obserwowanych fenotypów. Danio pręgowany jest doskonałym modelem do szybkiej oceny całego transkryptomu z całych zwierząt lub pojedynczych populacji komórek ze względu na łatwość izolacji RNA od dużej liczby zwierząt. W artykule przedstawiono protokół globalnej analizy ekspresji genów w zarodkach danio pręgowanego z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA (RNASeq). Opisujemy otrzymywanie RNA z całych zarodków lub z populacji komórek uzyskanych za pomocą sortowania komórek u zwierząt transgenicznych. Opisujemy również podejście do analizy danych RNASeq w celu identyfikacji wzbogaconych szlaków i terminów ontologii genów (GO) w globalnych zestawach danych dotyczących ekspresji genów. Na koniec udostępniamy protokół walidacji zmian ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR). Protokoły te mogą być wykorzystywane do analizy porównawczej zestawów kontrolnych i eksperymentalnych danio pręgowanego w celu identyfikacji nowych zmian ekspresji genów i zapewnienia molekularnego wglądu w fenotypy będące przedmiotem zainteresowania.

Introduction

Analiza porównawcza globalnej ekspresji genów jest cennym narzędziem do identyfikacji nowych genów przyczyniających się do obserwowanych fenotypów. Takie analizy zazwyczaj opierają się na ilościowej ocenie obfitości transkryptów w porównaniu między próbkami eksperymentalnymi i kontrolnymi. Podejścia celowane, takie jak qRT-PCR, są stosunkowo szybkie i dokładne w badaniu zmian ekspresji pojedynczych genów. Sekwencjonowanie RNA (RNASeq) oferuje szerokie, wolne od hipotez podejście do identyfikacji istotnych zmian w ekspresji genów między próbkami, co czyni je obecnie standardem dla takich badań w systemach eksperymentalnych.

Danio pręgowany stał się ważnym modelem w wielu obszarach chorobowych. Pierwotnie opracowane ze względu na ich użyteczność w badaniach biologii rozwoju, ze względu na ich wysoką płodność i stosunkowo niskie koszty utrzymania, eksperymentalne zastosowanie danio pręgowanego ewoluowało, obejmując szeroki zakres fenotypów od stadium embrionalnego do dorosłego, a także szeroki wachlarz testów molekularnych^1,2,3. Rzeczywiście, te zalety sprawiają, że badania mechanistyczne molekularne są szybkie i opłacalne ze względu na łatwość pozyskiwania dużych ilości materiału w połączeniu z łatwością manipulacji zarówno genetycznej, jak i środowiskowej na wszystkich etapach życia. Co więcej, przezroczysta natura zarodków i larw danio pręgowanego sprawia, że idealnie nadaje się do generowania specyficznych dla komórek i tkanek transgenicznych linii reporterowych, umożliwiając wizualizację in vivo dyskretnych populacji komórek⁴. Wykorzystanie takich linii pozwala na globalną analizę ekspresji genów w określonych izolowanych typach komórek w oparciu o ekspresję genu reporterowego.

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół globalnej analizy ekspresji genów za pomocą RNASeq po hodowli zarodków danio pręgowanego. Eksperymentalne manipulacje genetyczne, w tym przejściowe knockdown genu oparte na morfolinie (MO) lub edycja genomu za pośrednictwem CRISPR, zostały przedstawione w innym miejscu^5,6,7. Dlatego skupiamy się na szczegółowym protokole izolacji RNA z całych zarodków lub posortowanych transgenicznych komórek wykazujących ekspresję reportera, a następnie na prostej analizie obliczeniowej wyników RNASeq przy użyciu narzędzi szlaku i terminów ontologii genów (GO). Na koniec dołączyliśmy strategię walidacji zmian ekspresji genów za pomocą ilościowej PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR). Protokoły te mają zastosowanie do zarodków danio pręgowanego poddanych szerokiemu zakresowi warunków eksperymentalnych, w tym porównaniu mutantów genetycznych lub warunków środowiskowych.

Protocol

Wszystkie poniższe protokoły dotyczące zwierząt są zgodne i zatwierdzone przez University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie zarodków

1. Wytwarzanie zarodków poprzez naturalne krycie
   1. Hodowla zarodków do 3 miesiąca życia, dojrzałość reprodukcyjna^5,8.
   2. Oddziel dorosłe samce i samice ryb od pożądanego szczepu do podzielonych zbiorników godowych wieczorem przed pobraniem zarodków i dodaj 2 samce i 3 samice do każdego zbiornika.
      UWAGA: Zastosowanie transgenicznego fluorescencyjnego szczepu reporterowego insuliny2a:mCherry pozwoliło na analizę komórek β trzustki.
   3. Przenieś ryby do zbiornika godowego ze świeżą wodą systemową i wyjmij przegrodę natychmiast po zapaleniu się świateł następnego ranka.
   4. Pozwól rybom łączyć się w pary w sposób naturalny, dopóki zarodki nie zostaną zaobserwowane w dolnym zbiorniku. Zbieraj zarodki w 30-minutowych odstępach, aż do pobrania żądanej ilości. Przechowywać każdy pobrany punkt czasowy na oddzielnych szalkach Petriego w pożywce dla zarodków w temperaturze 28,5 °C.
   5. Wykonaj mikroiniekcję materiału genetycznego lub umieść go w eksperymentalnych pożywkach hodowlanych⁶, jeśli jest to pożądane, i hoduj zarodki na pożywce dla świeżych zarodków Hanka8 na 10-centymetrowych szalkach Petriego w temperaturze 28,5 °C.
      UWAGA: W przypadku analizy ekspresji genów u zwierząt z wstrzyknięciem morfolino (MO) lub zmutowanych, należy pamiętać, że każda manipulacja może mieć przypadkowy wpływ na ekspresję genów. Mutanty mogą wykazywać kompensację genetyczną na poziomie transkrypcji, który nie jest obserwowany przez celowanie genów na podstawie MO⁹.
2. Stadium zarodków
   1. Hoduj zarodki w grupach po 50–75 zarodków na 10-centymetrową szalkę Petriego, aby zapewnić spójny czas rozwoju wszystkich zarodków.
   2. Monitoruj morfologię rozwoju za pomocą mikroskopu preparacyjnego na etapach blastomerów, epibolii i somitów, aby zapewnić postęp rozwoju¹⁰.
      UWAGA: Usuń wszelkie umierające lub zniekształcone zarodki, aby zapobiec opóźnieniu rozwoju w naczyniu.
   3. Oddziel zarodki na podstawie wieku rozwojowego. Zmierz wiek zarodka za pomocą liczby somitycznej po segmentacji (po gastrulacji, 10,33 h po zapłodnieniu (hpf)) do około 24 hpf. Etap zarodków i larw na podstawie całkowitej długości ciała po 24 hpf.
      UWAGA: Somity to tkanka mezodermalna w kształcie szewronu obecna w grzbietowej części zarodka.
   4. Posortowane zarodki umieścić w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C i pozwolić im rozwijać się do pożądanego wieku.

2. Dysocjacja pojedynczych komórek: całe populacje zarodków i posortowane komórki

1. Dysocjacja całego zarodka
   1. Poddaj eutanazji zarodki danio pręgowanego na pożądanym etapie, umieszczając szalkę Petriego na lodzie na 5-15 minut, aż nie zaobserwuje się żadnego ruchu.
   2. Przenieś pulę 20 zarodków do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Usunąć nadmiar pożywki dla zarodków z probówki do mikrowirówki.
   3. Dodać 200 μl odczynnika do lizy (patrz tabela materiałów) do probówki zawierającej zarodki. Homogenizować zarodki w odczynniku do lizy mechanicznie za pomocą tłuczka. Dodać 800 μl odczynnika do lizy, aby uzyskać całkowitą objętość do 1 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
2. Izolacja komórek posortowana przepływowo¹¹
   1. Przenieść zarodki z szalki Petriego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i usunąć jak najwięcej pożywki z zarodków.
      UWAGA: W zależności od wieku zarodka, na tym etapie może być również wymagana dysocjacja mechaniczna. W przypadku zarodków > 48 hpf zalecamy użycie tłuczka w celu zakłócenia integralności zarodka przed kontynuowaniem.
   2. Inkubować zarodki z 1 ml buforu dysocjacyjnego 1 (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Rozcierać roztwór, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki P1000, mieszając co 3-4 minuty na etapie inkubacji. NIE WIROWAĆ.
   3. Zebrać zarodki przez odwirowanie przez 3 minuty przy 300 x g i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić zarodki w 1 ml buforu dysocjacyjnego 2 (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej z regularnym pipetowaniem.
   4. Ocenić trawienie, rozcieńczając 1-2 μl zawiesiny w buforze do sortowania komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) pod mikroskopem.
      UWAGA: Całkowite trawienie nastąpiło, gdy badana porcja wykazuje pojedyncze komórki z minimalnymi skupiskami komórek i kawałkami tkanki embrionalnej.
   5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 1 ml i przefiltrować grawitacyjnie przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę z próbki.
   6. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz buforem FACS do około 1x 10⁶ komórek/ml w probówce FACS.
      UWAGA: W przypadku typów komórek o stosunkowo małej liczbie na zarodek (mniej niż 5% całości), takich jak komórki β trzustki, należy użyć co najmniej 1000 zarodków w odpowiednim stadium.
   7. Zaopatrzyć sortownię FACS w probówki FACS zawierające 1 ml próbek zawiesiny komórek, a także probówkę FACS zawierającą tylko odczynnik do lizy lub bufor FACS. Bramkować sortownik przepływowy FACS, aby zbierać tylko pojedyncze komórki, które wyrażają fluorescencyjny reporter.
   8. Wykonuj sortowanie przepływowe FACS, aż zostaną zebrane żądane numery komórek.
      UWAGA: Aby wykonać RNASeq, wymagana jest minimalna całkowita ilość RNA. Odkryliśmy, że 3000-5000 komórek wystarcza do wyizolowania wysokiej jakości RNA o wysokim stężeniu.
   9. Zebrane komórki należy przechowywać na lodzie i natychmiast przystąpić do przygotowania RNA.

3. Przygotowanie RNA

1. Ekstrakcja RNA
   1. Pobraną próbkę (z etapu 2) inkubować z odczynnikiem do lizy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 0,2 ml chloroformu na każde 1,0 ml użytego odczynnika do lizy i ręcznie odwracać probówki przez 15 s. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Przenieść oddzieloną, wodną fazę do świeżej probówki i dodać 0,5 ml izopropanolu na każde 1,0 ml użytego odczynnika do lizy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Przemyć 75% etanolem i odwirować próbki o stężeniu 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić RNA w 15-30 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).
2. Oczyszczanie wysokiej jakości RNA
   1. Połączyć zawiesinę RNA z 1/10 objętości 3M octanu sodu (pH 5,5) i 1 objętością izopropanolu. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać próbki przy 12 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Przemyć osad lodowatym 70% etanolem w wodzie uzdatnionej metodą DEPC i odwirować próbki o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap płukania jeden raz.
   3. Usunąć supernatant i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić w wodzie uzdatnionej przez DEPC.
   4. Oznaczyć wyekstrahowany RNA pod kątem stężenia (ng/μl) i czystości (stosunek 260/230) za pomocą spektrometru absorpcyjnego. Upewnij się, że wartość 260/230 wynosi ~ 2,0 przed kontynuowaniem RNASeq. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (do 6 miesięcy).
   5. Wyślij próbki RNA do dostawcy lub rdzenia w celu analizy RNASeq i zmiany ekspresji genów na podstawie kwantyfikacji odczytów sekwencjonowania. Wyniki zwracane od dostawcy są zwykle dostarczane jako lista genów wykazujących znaczącą zmianę w odczytach transkryptów między próbkami.
      UWAGA: Kolumna może być użyta, jeśli powyższa metoda daje RNA o niskiej jakości. Ilość, stężenie i numer integralności RNA (RIN) dla próbek RNA należy potwierdzić u dostawcy lub rdzenia. Dostawca lub rdzeń zazwyczaj ocenia również RIN.

4. Analiza terminów ścieżki i GO

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla reprezentatywnych wyników analizy ekspresji genów po RNASeq dostarczonych przez rdzeń lub dostawcę.

1. Sortowanie genów o zróżnicowanej ekspresji
   1. Porównanie pojedynczego warunku eksperymentalnego z kontrolą
      1. Otwarte dane (wyniki) w oprogramowaniu do zarządzania arkuszami kalkulacyjnymi (patrz Spis materiałów).
      2. Wybierz strzałkę listy rozwijanej obok przycisku "Sortuj" i wybierz "Sortowanie niestandardowe" w arkuszu kalkulacyjnym zawierającym geny o zróżnicowanej ekspresji w warunkach eksperymentalnych i kontrolnych.
      3. Zaznacz pole w sekcji "Kolumna" w oknie, które się pojawi, i wybierz sortowanie według kolumny "LFC". Upewnij się, że w kolumnie "Sortuj według" wybrano opcję "Wartości". Wybierz, aby sortować od "Od największego do najmniejszego" w kolumnie "Zamówienie" i kliknij "OK".
         UWAGA: Spowoduje to posortowanie genów o zróżnicowanej ekspresji tak, że te o zwiększonej ekspresji (dodatni LFC) pojawią się na górze listy, podczas gdy te ze zmniejszoną ekspresją (ujemne LFC) pojawią się na dole listy.
   2. Porównaj wiele warunków eksperymentalnych z pojedynczą kontrolą w następujący sposób.
      1. Wybierz pierwszą komórkę w pustej kolumnie w arkuszu kalkulacyjnym Eksperymentalne 1 kontra kontrolne, aby określić geny o zróżnicowanej ekspresji znalezione w dwóch warunkach eksperymentalnych. Wpisz następujące równanie w komórce:
         
         UWAGA: To równanie jest kombinacją funkcji JEŻELI, CZY.BŁĄD i DODAJ.POZYCJĘ. (i) Funkcja PODAJ.POZYCJĘ, PODAJ.POZYCJĘ(A1,Experimental2_vs_Control! A:A,0), będzie szukać wartości w A1 (identyfikator ENSEMBL) w kolumnie A (A:A) arkusza kalkulacyjnego o nazwie Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). "0" wskazuje, że należy szukać dokładnego dopasowania, a jeśli zostanie znalezione dokładne dopasowanie, funkcja zwróci wartość "1", natomiast jeśli nie zostanie znalezione dopasowanie, funkcja zwróci błąd "Nie dotyczy". (ii) Wynik funkcji PODAJ.POZYCJĘ jest następnie wprowadzany do funkcji ISERROR, ISERROR(MATCH(A1,Experimental2_vs_Control! A:A,0)), gdzie, jeśli dane wejściowe to "1" wskazujące, że znaleziono dopasowanie, zwróci "FALSE", a jeśli dane wejściowe to "N/A" wskazujące, że dopasowanie nie zostało znalezione, zwróci "TRUE". (iii) Wynik "PRAWDA" lub "FAŁSZ" jest następnie wprowadzany do funkcji JEŻELI, JEŻELI(ISERROR(MATCH(A1,Experimental2_vs_Control! A:A,0)),"","Duplicate"), gdzie, jeśli dane wejściowe to "TRUE" wskazujące, że nie znaleziono dopasowania, zwróci wartość między pierwszym zestawem cudzysłowów (""), który jest pusty, a zatem komórka będzie pusta. Jeśli dane wejściowe to "FALSE" wskazujące, że znaleziono dopasowanie, zwróci wartość między drugim zestawem cudzysłowów ("Duplikat"), a w komórce pojawi się wartość "Duplikat".
      2. Naciśnij "Enter" lub "Return", aby uruchomić równanie. Zaznacz komórkę zawierającą równanie i kliknij pole w prawym dolnym rogu komórki. Przytrzymaj przycisk myszy i przeciągnij zaznaczony obszar maksymalnie w dół kolumny, aż do ostatniego "Identyfikatora funkcji", aby skopiować równanie do każdej komórki w kolumnie.
      3. Ponownie wybierz "Sortowanie niestandardowe", dodaj drugi poziom sortowania, klikając ikonę "+" w lewym dolnym rogu. Na pierwszym poziomie "Sortuj według", w sekcji Kolumna wybierz "Duplikuj", w obszarze Sortuj według wybierz "Wartości", a w sekcji Kolejność wybierz "Od Z do A". Na drugim poziomie, "Następnie według", w kolumnie wybierz "LFC", w obszarze Sortuj według wybierz "Wartości", a w obszarze Kolejność wybierz "Od największego do najmniejszego" i wybierz "OK".
         UWAGA: Spowoduje to posortowanie listy genów na 4 grupy w oparciu o kierunkowość zmiany ekspresji. Ważne jest, aby sprawdzić geny znalezione w obu warunkach eksperymentalnych, aby upewnić się, że zmiana ekspresji jest w tym samym kierunku w obu lub przeciwnych kierunkach.
      4. Przed kontynuowaniem usuń wszystkie nawiasy z kolumny symboli genów, w przeciwnym razie wyniki nie zostaną znalezione w bazach danych. Zaznacz całą kolumnę zawierającą symbole genów. Wybierz "Edytuj", a następnie "Zamień" z rozwijanego menu "Plik". Wpisz "(*)" w pasku "Znajdź co:" w oknie Zamień i pozostaw pasek "Zamień na:" pusty. Wybierz opcję "Zamień wszystko", aby usunąć wszystkie wystąpienia nawiasów.
         UWAGA: * reprezentuje dowolną liczbę znaków, umieszczając ten znak między dwoma nawiasami, program jest proszony o znalezienie dowolnego wystąpienia w podświetlonych komórkach, a każde wystąpienie nawiasów zostanie zastąpione niczym, usuwając je w ten sposób.
2. Określanie wzbogaconych ścieżek
   1. Skopiuj do schowka symbole genów zestawu, dla którego chcesz określić wzbogacone ścieżki. Przejdź do ConsensusPathDB¹². Wybierz "Analiza zestawu genów" na lewym pasku bocznym strony internetowej, a następnie "Analiza nadreprezentacji".
   2. Wklej listę genów w polu "Wklej listę identyfikatorów genów/białek". Wybierz symbol genu w polu "Typ identyfikatora genu/białka" i kliknij "Kontynuuj". Zaznacz pole "Ścieżki zdefiniowane przez bazy danych ścieżek" w sekcji Zestawy oparte na ścieżkach.
      UWAGA: Pojawi się kilka opcji analizy, w tym lista dostępnych baz danych do przeszukania. Zalecamy usunięcie zaznaczenia wszystkich baz danych z wyjątkiem baz danych Kegg i Reactome, ponieważ są one najbardziej ugruntowane i wszechstronne. Minimalne nakładanie się z listą wejściową i ustawieniami odcięcia wartości p można również dostosować w zależności od potrzeb. Zalecamy pozostawienie tych ustawień na domyślnym minimalnym nakładaniu się 2 genów i wartości odcięcia 0,01 p.
   3. Wybierz opcję "Znajdź wzbogacone zestawy", aby uzyskać listę ścieżek zawierających geny z listy wejściowej.
      UWAGA: Dane wyjściowe będą w formacie tabeli, w tym nazwę każdej ścieżki, po której następuje "Ustawiony rozmiar" (wskazujący całkowitą liczbę genów w ścieżce), "Kandydaci zawarci" (wskazujący liczbę genów na liście wejściowej, które znajdują się w tej ścieżce), a także wartość p i wartość q (FDR) oraz bazę danych, z której zidentyfikowano ścieżkę.
3. Generowanie sieci ścieżek
   1. Określ wzbogacone ścieżki zgodnie z powyższym opisem.
   2. Zaznacz wszystkie wzbogacone ścieżki do wizualizacji w sieci ścieżek, zaznaczając każde pole obok nazw ścieżek, które mają być wizualizowane, lub klikając "Wszystkie" w obszarze "Wybierz" w nagłówku kolumny nad polami wyboru, a następnie wybierz opcję "Wizualizuj wybrane zestawy".
      UWAGA: Zalecamy wizualizację wszystkich ścieżek, jeśli jest ich mniej niż 30; Jeśli istnieje więcej niż 30 ścieżek, zalecamy wybranie 30 najbardziej wzbogaconych ścieżek (zawierających największą liczbę genów z listy wejściowej).
   3. Dostosuj filtry "względne nakładanie się" i "współużytkowani kandydaci", zaznaczając dowolne pole w górnej środkowej części strony i wprowadzając żądany procent względnego nakładania się lub liczbę współdzielonych kandydatów, aby były bardziej rygorystyczne, aby bardziej odpowiednie nakładanie się w sieciach ścieżek było wyraźniejsze, a następnie wybierz "zastosuj".
      UWAGA: Zalecamy minimalne względne nakładanie się wynoszące 0,2, co wskazuje na 20% nakładanie się genów między 2 szlakami łączącymi je i co najmniej 2 wspólnych kandydatów. Legendę wykresu można zobaczyć, klikając legendę wykresu w lewym górnym rogu strony.
4. Określenie warunków wzbogaconego GO
   1. Skopiuj do schowka symbole genów grupy, dla której chcesz określić wzbogacone ontologie genów. Przejdź do narzędzia "GO Enrichment Analysis" w Gene Ontology Consortium¹³. Wklej listę symboli genów w polu po lewej stronie w sekcji "Twoje identyfikatory genów tutaj..."
   2. Wybierz zestaw terminów GO, które mają być używane, wymienionych pod polem identyfikatorów genów: proces biologiczny, funkcja molekularna lub składnik komórkowy. Wybierz (zalecany) "proces biologiczny". Wybierz "Danio rerio" pod polem warunków GO i kliknij "Prześlij".
      UWAGA: Zalecamy użycie domyślnego punktu odcięcia wartości p wynoszącego 0,05.

5. Weryfikacja za pomocą qRT-PCR

UWAGA: Indywidualne geny zidentyfikowane ze znaczącymi zmianami ekspresji genów w RNASeq powinny być weryfikowane za pomocą ukierunkowanego qRT-PCR w eksperymentach replikowanych.

1. Synteza cDNA
   1. Ekstrahować RNA z zarodków metodą opisaną w sekcji 3.1. Ekstrakcja RNA.
   2. Przekształć 1 μg RNA w cDNA za pomocą zestawu do konwersji cDNA (patrz Tabela materiałów). Połącz RNA, dNTP i enzym odwrotnej transkryptazy. Przeprowadzić reakcję termocyklera zgodnie ze specyfikacją producenta.
   3. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:3 w wodzie uzdatnionej DEPC. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1-2 miesięcy.
2. qRT- Weryfikacja PCR
   1. Wybierz geny do weryfikacji za pomocą qRT-PCR na podstawie wyników sekwencjonowania RNA. Zidentyfikuj geny z dużymi zmianami w ekspresji. Określ, które z tych genów zawierają również dużą liczbę odczytów, ponieważ wskazuje to na obfitą ekspresję.
   2. Wybierz 10-12 celów z listy genów o dużej zmianie fałdowania i dużej liczbie odczytów. Zaprojektuj startery do amplifikacji docelowych genów, które obejmują co najmniej 1 granicę intron-ekson.
   3. Wprowadź gen lub region docelowy genu do projektu startera qPCR site¹⁴. Wybierz "zaprojektuj 2 startery qPCR" i poproś witrynę o utworzenie zestawu starterów.
      UWAGA: Pamiętaj, aby dołączyć startery kontroli wewnętrznej, takie jak β-aktyna, aby znormalizować porównania między próbkami. Starterami β-aktyny są F: 5'-TCGAGCTGTCTTCCCATCCA-3' i R: 5'-TCACCAACGTAGCTCTCTCTCTCTG-3'.
   4. Połącz cDNA, starter do przodu, starter odwrotny i polimerazę. Wykonaj amplifikację qRT-PCR, aby określić względną ekspresję genów¹⁵.
   5. Przeanalizuj względną ekspresję mRNA genów będących przedmiotem zainteresowania za pomocą względnego oznaczania ilościowego¹⁵.
   6. Porównaj wyniki qRT-PCR z RNASeq, aby upewnić się, że kierunkowość ekspresji różnicowej jest spójna.

Results

Sortowanie genów o zróżnicowanej ekspresji:

Aby zidentyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji w stadium larwalnym modeli danio pręgowanego i zespołu Bardeta-Biedla (BBS), skupiliśmy się na transkryptach jałmużny1 lub bbs1, wstrzykując wcześniej zatwierdzone MO blokujące splice do zarodków danio pręgowanego typu dzikiego^16,17. Po 5 dniach od zapłodnienia (d...

Discussion

Podejście opisane w tym protokole oferuje stosunkowo szybką i opłacalną strategię analizy na poziomie transkryptomu całych zwierząt lub określonych posortowanych populacji komórek. Danio pręgowany stanowi korzystny model dla tego typu badań ze względu na łatwość i szybkość generowania dużych ilości materiału wyjściowego, łatwość wdrożenia genetycznych lub środowiskowych warunków eksperymentalnych oraz dostępność szerokiego spektrum transgenicznych linii reporterowych pozwalających na izolację populacji specyficznych dla ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial Reagents
TriZol	Thermo Scientific	15596026	odczynnik
TrypLE	Gibco	12604013	bufor dysocjacyjny 1
FACSMax	Genlantis	T200100	bufor dysocjacyjny 2
Woda uzdatniona przez DEPC	Sigma	95284
Konwersja cDNA FirstNici	konwersji cDNA	Thermo Scientific	K1621
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
bufor FACS	Fisher Scientific	50-105-9042
chloroform	Sigma Aldrich	288306
octan sodu	Sigma Aldrich	S2889
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Odmiany danio pręgowanego
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Nazwa	< strong>Firma<	strong>Numer katalogowy	Uwagi
Equipment
40 mikronowy sitko	komórkowe Sigma	CLS431750
rurka FACS	BD Falcon	352063
hemocytometr	Sigma	Z359629
Mikroskop preparacyjny	Zeiss Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Zbiorniki kryjące 1,0 l Zestaw zbiorników krzyżowych	Aquaneering	ZHCT100
probówka FACS 5 ml rurka polipropylenowa	BD Falcon	352063
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
Excel	Microsoft
Consensus Path DB
GO	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis