Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

18.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56189

⸱

28 lipca 2017

 , 
1Department of Chemistry, University of Colorado Denver

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Streszczenie

Synteza fazy stałej została wykorzystana do uzyskania kanonicznych i zmodyfikowanych polimerów kwasów nukleinowych, w szczególności DNA lub RNA, co uczyniło ją popularną metodologią do zastosowań w różnych dziedzinach i do różnych celów badawczych. Opisana w niniejszym dokumencie procedura koncentruje się na syntezie, oczyszczaniu i charakterystyce dodekamerów RNA 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3' zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje zlokalizowane w pozycji C2'-O. Sondy są oparte na grupach 2-tiofenylometylowych, włączonych do nukleotydów RNA poprzez standardową syntezę organiczną i wprowadzonych do odpowiednich oligonukleotydów za pośrednictwem odpowiednich fosforamiditów. W niniejszym raporcie wykorzystano chemię fosforamidytów za pośrednictwem czterech kanonicznych zasad nukleotydowych (urydyna (U), cytozyna (C), guanozyna (G), adenozyna (A)), a także nukleotydy funkcjonalizowane 2-tiofenylometylemetylu zmodyfikowane w pozycji 2'-O; Metodologia ta jest jednak podatna na wiele różnych modyfikacji, które zostały opracowane na przestrzeni lat. Oligonukleotydy zsyntetyzowano na nośniku ze szkła o kontrolowanych porach (CPG), a następnie rozszczepiono z żywicy i zdeprotekowano w standardowych warunkach, tj. mieszaninie amoniaku i metyloaminy (AMA), a następnie fluorowodoru/trietyloaminy/N-metylopirolidynonu. Odpowiednie oligonukleotydy oczyszczono za pomocą elektroforezy poliakrylamidowej (20% denaturacji), a następnie elucji, odsalania i izolacji za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami (Sep-pak,C 18-kolumnowy). Ocenę ilościową i parametry strukturalne oceniono odpowiednio za pomocą analizy fotometrycznej w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis) i dichroizmu kołowego (CD). Niniejszy raport ma służyć jako źródło informacji i przewodnik dla początkujących i doświadczonych badaczy zainteresowanych rozpoczęciem pracy w tej dziedzinie. Oczekuje się, że będzie on służył jako praca w toku w miarę opracowywania nowych technologii i metodologii. Opis metodologii i technik zawartych w tym dokumencie odpowiada syntezatorowi DNA/RNA (odnowionemu i zakupionemu w 2013 r.), który wykorzystuje chemię fosforamidytu.

Wprowadzenie

Synteza fazy stałej w celu uzyskania oligonukleotydów DNA/RNA to potężne narzędzie, które od lat 70. XX wieku ma wiele zastosowań w różnych dziedzinach1,2,3 przy użyciu bloków budulcowych fosforamidytu4. Przykłady jego szerokiego wpływu obejmują: jego wpływ na etykietowanie (poprzez reakcje chemiczne kliknięć)5, sondowanie strukturalne6 i technologie antysensowne7, a także wyjaśnienie mechanizmów biologicznych8,9, źródło jako materiał genetyczny10, oraz badanie różnych naturalnych i/lub chemicznych modyfikacji11,12, wśród wielu innych. Modyfikacja, którą tutaj stosujemy, stanowi pierwszy krok w naszych wysiłkach na rzecz uzyskania oligonukleotydów RNA, które zawierają sondy fotoaktywne, aby umożliwić czasową kontrolę struktury i funkcji tego ważnego biopolimeru.

Synteza dodekamerów RNA z sekwencjami: 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3'/5'-[AUG AUU CCG UAG]-3' (podkreślone pozycje reprezentują włączenie modyfikacji C2'-O-tiofenylometylu) stanowi główny cel tego badania. Sekwencje zostały dobrane tak, aby umożliwić kwantyfikację i pomiar nici RNA jako pojedynczych nici lub jako odpowiadających im struktur dupleksowych (nie przewidywano żadnych innych struktur drugorzędowych jako stabilnych termodynamicznie). CD wykorzystano do wyznaczenia parametrów strukturalnych, tj. powstawania dupleksu i termicznych przemian denaturacyjnych.

Synteza
Ogólna procedura otrzymywania tych oligonukleotydów jest zilustrowana w Rysunek 1 i przedstawia proces krokowy: zautomatyzowana synteza w fazie stałej → deprotekcja → oczyszczanie → kwantyfikacja → charakteryzacja. Rysunek 2 przedstawia jednostki monomeryczne, które są niezbędne w tej procedurze. Synteza RNA w fazie stałej jest podobna do syntezy DNA, ponieważ opiera się na chemii fosforamidytu (Rysunek 2, po lewej) i zastosowaniu labilnych grup ochronnych dla nukleofilowych amin egzocyklicznych na G, A i C, np. acetylu, benzoilu, fenoksyacetylu, t-butylu lub N,N-dimetyloformamidu (Rysunek 2, po prawej). Jeszcze jednym aspektem do rozważenia w RNA, ze względu na obecność grupy C2'-OH (brak w biopolimerach deoksyoligonukleotydowych), jest dodatkowy krok, który należy włączyć w celu ochrony, a następnie deprotekcji tej pozycji nukleofilowej. Pod tym względem, grupy ochronne na bazie krzemu stały się atrakcyjną strategią ze względu na ich potencjał jako ugrupowań biortodolicznych (szczególnie odchronionych w obecności fluoru), z grupami tert-butylodimetylosililosililu (TBDMS) i triizopropylosilosililosmetylu (TOM) jako popularnymi wyborami (Rysunek 2, na dole po lewej).

W tej pracy automatyczna synteza została przeprowadzona na syntezatorze DNA/RNA, który wykorzystuje standardową chemię fosforamidytu. Ustawienia producenta w urządzeniu obejmują automatyczny etap rozcieńczania w przypadku korzystania z komercyjnych wersji fosforoamidynów do DNA lub opcję rozcieńczania w objętościach ustawionych przez użytkownika. Zdecydowaliśmy się jednak zważyć fosforoamidyn RNA i rozcieńczyć go ręcznie, biorąc pod uwagę, że: 1) cena kanonicznych fosforamidynów RNA jest wyższa (w niektórych przypadkach nawet 50-krotnie droższa); 2) modyfikowane fosforamidyty są często otrzymywane w małych ilościach; oraz 3) ilość marnowanego materiału przy użyciu automatycznego etapu rozcieńczania (ustawionego przez producenta) jest duża. Ponadto zastosowaliśmy: 1) dostępne na rynku stałe nośniki (np. CPG) zawierające chronioną zasadę nukleotydową pełniącą funkcję końca 3'; oraz 2) komercyjne fosforamidyty (kanoniczne zasady nukleotydowe) zabezpieczone grupą TBDMS w pozycji C2'-O. Szczegółowa lista etapów syntezy znajduje się w Rysunek 3 i Tabela 1, wraz z dalszym opisem i komentarzami do etapów, które zostały dostosowane do syntezy RNA. Ponadto, Rysunek 4 ilustruje stopniowe plony, które są obserwowane dla każdego kroku po wybraniu opcji 'Trityl Monitor', która określa ilościowo kation trytylu uwalniany z każdego etapu detrytylacji.

Warto zauważyć, że zazwyczaj z naszego doświadczenia wynika, że czynnikiem ograniczającym było uzyskanie fosforamidytu zawierającego pożądaną modyfikację. Oznacza to opracowanie syntetycznej metodologii, która pozwala na wprowadzanie modyfikacji w wybranych lokalizacjach. W niniejszym raporcie skupiamy się na włączeniu zmodyfikowanego nukleotydu, dla którego ustaliliśmy odpowiednią metodologię syntezy, grupę C2'-O-tiofenylometylu. Grupa ta jest niewielkich rozmiarów i w żaden sposób nie wpływa na syntezę w fazie stałej. Ponieważ doniesiono o włączeniu tej grupy do oligonukleotydów RNA, wraz z parametrami strukturalnymi i termodynamicznymi4, żadne aspekty syntezy organicznej prowadzącej do zmodyfikowanych fosforoamidynów nie zostaną opisane w niniejszym dokumencie.

Deprotekcja, Oczyszczanie i Charakteryzacja
Deprotekcja amin egzocyklicznych i grup ß-cyjanoetylowych zachodzi na tym samym etapie, co rozszczepienie z żywicy CPG. Zastosowaliśmy powszechnie stosowane warunki ogrzewania otrzymanej żywicy w obecności wodnego roztworu AMA, a następnie rozszczepienia grup C2'-O-sililowych w obecności jonów fluorkowych, a następnie oczyszczenia za pomocą elektroforezy żelowej. Chociaż w wielu przypadkach stały się one warunkami standardowymi, modyfikacje, które są odporne na warunki podstawowe lub jony fluorkowe, mogą wymagać łagodniejszych warunków13,14, np. metanol/węglan potasu (MeOH/K2CO3) lub butyloamina. W związku z tym konieczny jest inny zestaw grup ochronnych na odpowiadających im fosforamidytach. Ponadto wybraliśmy elektroforezę jako preferowaną alternatywę do oczyszczania odchronionych oligomerów, biorąc pod uwagę nasze wcześniejsze doświadczenia z tą metodą i brak innych oprzyrządowań. Jednak HPLC może być alternatywnie stosowany jako skuteczna metoda15. Charakterystykę oczyszczonych oligonukleotydów przeprowadzono za pomocą spektrometrii mas, matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej czasu lotu (MALDI-TOF), przy użyciu procedury zgłoszonej przez naszą grupę16.

Charakterystyka strukturalna i stabilność termiczna otrzymanych dupleksów została przeprowadzona za pomocą płyty CD. W szczególności wykorzystujemy CD do określania termicznych przejść denaturacyjnych zmodyfikowanych i niemodyfikowanych oligonukleotydów RNA, śledząc spadek eliptyczności pasma przy ok. 270 nm, a także zanik pasma (o ujemnej eliptyczności) przyλ max przy 210 nm. Przedstawiono porównanie widm przed i po hybrydyzacji w celu zilustrowania ich różnic i walidacji zastosowanej metodologii. Zastosowanie CD jest powszechnie akceptowane w określaniu motywów strukturalnych w kwasach nukleinowych i aminokwasach17, a zatem może być stosowane jako narzędzie do określania różnych parametrów strukturalnych i termodynamicznych18; Nie ma jednak wielu przykładów, w których technika ta jest stosowana do oceny przemian denaturacji termicznej. Niektóre przypadki obejmują określenie stabilności termicznej na DNA zawierającym G-kwadrupleksy19,20 lub w dupleksach i spinkach do włosów RNA21.

Ten raport ma na celu dostarczenie czytelnikowi lub widzowi niebędącemu ekspertem zestawu narzędzi, które umożliwiają płynne rozpoczęcie tego typu badań. Będzie on służył do ulepszenia i porównania z metodologiami i technikami w innych laboratoriach badawczych, które są zaangażowane w tę ekscytującą gałąź nauki. Treść tego raportu uzupełnia istniejące protokoły tej technologii z różnych źródeł oraz wzbogaca i ułatwia korzystanie z niej dzięki pomocy wizualnej dla każdego kroku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza oligonukleotydów RNA w fazie stałej

  1. Przygotowanie roztworów zawierających poszczególne fosforamidyty (Tabela 1).
    1. Obliczyć liczbę nukleotydów i podstawić do równania n+1 (gdzie n = liczba nukleotydów) odpowiadającego każdej zasadzie, a następnie uzupełnić tabelę brakującymi wartościami. Objętość = 0,15 mL na nukleotyd przy stężeniu 0,1 M, rozpuszczone w bezwodnym acetonitrylu.
    2. Odważyć każdy fosforamidyt do wysuszonych w piecu bursztynowych fiolek o pojemności 10 mL (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) i natychmiast umieścić pod próżnią w deskrykatorze zawierającym środek osuszający.
    3. Wypełnić deskrykator suchym argonem, wyjąć fiolkę i natychmiast rozcieńczyć odpowiednią ilością acetonitrylu (bezwodnego) przed zamocowaniem w urządzeniu.
      UWAGA: Należy używać strzykawek szczelnych dla gazów i przez cały czas utrzymywać atmosferę bezwodną.
    4. Zdjąć septa z fiolek i umieścić je w urządzeniu za pomocą funkcji wymiany fiolek.
      UWAGA: Proces ten wymaga dodatkowych 0,15 mL (stąd nadmiar objętości w powyższym równaniu n+1) każdego roztworu do zapowietrzenia linii przed syntezą.
  2. Ustawienie sekwencji i synteza na fazie stałej przy użyciu oprogramowania (Rysunek 3).
    1. Kliknąć ikonę oprogramowania (np. OligoNet 1.0.1) i wybrać Nazwa urządzenia>OK. Utworzyć nową syntezę poprzez Plik>Nowa synteza>Zamówienie.
    2. Wypełnić pola: Data; RunID; wybrać urządzenie; nazwa sekwencji; sekwencja (koniec 5'-do-3'). W sekcji |cykl przypisać wcześniej utworzoną metodę (Rysunek 3). Wybrać procedurę końcową, (pozostawia oligonukleotyd związany z żywicą CPG)>manualna.
    3. Wybrać DMT Off >(obałoga TCA w ostatnim kroku w celu uzyskania grupy 5'-OH na końcu syntezy); zapisać Plik>Zapisz jako i podać nazwę eksperymentu.
    4. Wysłać plik, aby rozpocząć syntezę Zamówienie>Wyślij zamówienie do syntezatora i wybrać kolumnę 1-4. Otworzyć okno syntezatora i wybrać trityl monitor|wybierz funkcję|trity>monitoruj każdy krok.
    5. Powtarzać kroki w zależności od liczby oligonukleotydów, które mają zostać zsyntetyzowane jednocześnie (należy pamiętać, że wszystkie zamówienia muszą mieć tę samą metodę, tzn. takie same czasy sprzęgania i sekwencję zdarzeń).
    6. Rozpocząć syntezę Syntezator>Przygotuj do startu. Umieścić kolumny z pożądanym końcem 3' w pozycjach wskazanych na urządzeniu. Na urządzeniu kliknąć Start>Nie (dla przygotowania ABI).
    7. Po zakończeniu syntezy wyjąć kolumnę z urządzenia i umieścić w kolbie okrągłodennej, a następnie suszyć pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 0,5 h.
      UWAGA: Zaleca się sprawdzenie, czy w losowych sprzęganiach (kroki 1.2.4 - 1.2.7) obserwuje się ciemnopomarańczowy kolor, aby uniknąć potencjalnych błędów funkcji monitora tritylowego.
  3. Deprotekcja i oczyszczanie oligonukleotydów RNA.
    1. Otworzyć kolumnę, przekręcając czarną zakrętkę, i przenieść całość (lub połowę, w zależności od potrzeb lub celu) białej żywicy do probówki wirówkowej o pojemności 1,6 mL. Dodać 0,5 mL mieszaniny metyloaminy (40% w wodzie)/amoniaku (40% w wodzie) w stosunku 1:1.
    2. Zabezpieczyć zakrętkę probówki wirówkowej parafilmem i, używając bloku grzewczego, podgrzać do 60 °C przez 1,5 h.
      UWAGA: Na górze probówki można położyć ciężki przedmiot, aby zapewnić stałe stężenie amoniaku wewnątrz probówki reakcyjnej.
    3. Wyjąć z bloku grzewczego i powoli schłodzić do temperatury pokojowej. Krótko odwirować próbkę, aby osadzić zawartość, a następnie przenieść nadnadpłyn do nowej probówki wirówkowej.
    4. Zamrozić próbki, zanurzając probówki w ciekłym azocie (lub kąpieli z suchego lodu i etanolu) i odparować do suchości w wirówce pod zmniejszonym ciśnieniem.
    5. Resuspender ciało stałe w 0,4 mL roztworu trietyloaminy/N-metylopirolidonu/trifluorowodorku trietyloaminy (stosunek 2:2:3). Podgrzać do 60 °C przez 1,5 h, a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej.
    6. Dodać 0,04 mL roztworu NaOAc (3M, pH 5,5 - skorygowane HCl), a następnie delikatnie wymieszać końcówką pipety. Dodać etanol (1 mL) i schłodzić do ok. -70 °C (kąpiel z suchego lodu i etanolu) przez 15 min.
    7. Wirować przy 15 000 rpm i 4 °C przez 10 min. Użyć pipety do pobrania alikwoty i wysuszyć otrzymany osad pod zmniejszonym ciśnieniem.
    8. Resuspender otrzymane ciało stałe w buforze do nakładania (0,2 mL, 90% wodna formamida, 1 mM EDTA) i mieszać do uzyskania homogenicznej mieszaniny.
    9. Nałożyć zawiesinę na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy (20% denaturujący, wymiary otworu: 30 cm x 1 mm)22.
    10. Przyłożyć prąd do żelu, aż marker błękitu bromofenolowego znajdzie się w odległości 1/2-2/3 długości żelu (wymiary żelu: ~ 21,5 cm x 30 cm).
    11. Wyjąć żel ze statywu i przenieść zawartość żelu ze szkła na folię plastikową (pokrytą z obu stron), a następnie położyć na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) pokrytej krzemionką (zawierającą barwnik fluorescencyjny przy 254 nm), aby zwizualizować prążki za pomocą lampy UV (λmax = 254 nm).
    12. Użyć markera do zaznaczenia pozycji górnego prążka i wyciąć go nowym ostrzem żyletki. Umieścić żel zawierający RNA (bez folii plastikowej) w stożkowej probówce 50-mL i rozdrobić na małe kawałki za pomocą szklanej rurki.
    13. Zawiesić pozostałości żelu w wodnym roztworze NaCl (200 mM NaCl i 1 mM EDTA) i wstrząsać zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 12 h. Wirować probówkę stożkową przez 10 min.
    14. Odsolić, używając kartridża C18 w odwróconej fazie.
      1. Przygotować kartridż za pomocą strzykawki 10-mL, przemywając go za pomocą:
        Acetonitrylu (10 mL)
        H2O (dwukrotnie, 10 mL)
        Wodnego roztworu 5 mM NH4OAc (3 mL)
        Roztworu zawierającego RNA, dbając o to, aby nie przelać żadnych pozostałości żelu.
      2. Przemyć H2O (trzykrotnie, 10 mL).
      3. Eluować z kolumny, używając 60% wodnego roztworu metanolu (3 mL)
    15. Skoncentrować pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuścić ponownie w wodzie wolnej od RNaz (0,3 mL)
    16. Przygotować roztwór rozcieńczony (10 µL) i nanieść 1 µL na urządzenie UV-vis (np. Nanodrop), aby zmierzyć widmo UV-vis (200-450 nm).
    17. Użyć prawa Beer-Lambert'a do wyznaczenia stężenia otrzymanego roztworu:
      figure-protocol-1
      gdzie A = otrzymana absorbancja; ε = obliczony molowy współczynnik ekstynkcji; c = stężenie, a l = 0,1 dla długości drogi 1 mm.
    18. Obliczyć molowe współczynniki ekstynkcji dla oligonukleotydów; obliczono je tutaj za pomocą kalkulatora online wykorzystującego oprogramowanie DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)23
  4. Wyznaczanie stężenia i charakterystyka za pomocą MALDI-TOF.
    1. Nałożyć próbki na płytkę MALDI, używając końcówki pipety z końcówką C18 do odsalania, i nanieść każdy oligonukleotyd.
      1. Przemyć końcówkę 50% acetonitrylem (10 µL x 2). Zrównoważyć końcówkę 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA; 10 µL x 2). Nanieść na końcówkę próbkę (zazwyczaj 100-150 pmol).
      2. Przemyć końcówkę 0,1% TFA (10 µL x 2), a następnie wodą (10 µL x 2).
      3. Eluować próbkę do roztworu zawierającego pożądaną matrycę; zastosowano roztwór: 10 µL 25 mM-2,4,6-trihydroksyacetofenonu monohydratu (THAP), 10 mM cytrynianu amonu i 300 mM fluorku amonu w 50% acetonitrylu.
      4. Nanieść bezpośrednio na płytkę MALDI, nakładając 0,9 µL (następnie susząc na powietrzu) i powtarzając procedurę w razie potrzeby.
        UWAGA: Wszystkie widma uzyskano w trybie pozytywnym z reflektorem.

2. Analiza struktury RNA za pomocą CD

  1. Przygotowanie roztworów do CD.
    1. Przygotować 0,25 ml zawierające zmodyfikowane RNA [3 µM], NaCl [10 mM], bufor fosforanowy sodu [10 mM, pH 7,2] oraz MgCl2 [5 mM]. Próbka w tej formie jest gotowa do analizy, szczególnie jeśli reprezentuje ona przejście jednocząsteczkowe.
    2. Jeśli celem jest analiza struktur duplexowych lub przejść bimolekularnych, należy w tym momencie dodać komplementarną sekwencję (1 ekwiwalent molowy, jeśli dotyczy) lub przejść do poniższego kroku.
    3. Umieść próbkę w bloku grzewczym, uprzednio podgrzanym do 90 °Cnastępnie należy wyłączyć ogrzewanie, aby zapewnić powolne chłodzenie do temperatury pokojowej (zazwyczaj przez 2–4 h).
  2. Akwizycja widm
    1. Przygotuj roztwór kontrolny (NaCl 10 mM, fosforan sodu 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), przenieść do mikrokuwety (długość drogi optycznej 1 cm, 250 µL (minimalna objętość) i umieść w gnieździe próbek wewnątrz urządzenia.
    2. Przenieś próbkę zawierającą RNA do innej mikrokuwety i umieść ją w próbniku (sample changer). W przypadku pomiaru przejścia denaturacji termicznej ostrożnie dodaj warstwę oleju, nie naruszając warstwy wodnej, a następnie zabezpiecz zakrętkę kuwety za pomocą taśmy teflonowej.
    3. Otwórz zbiornik z azotem, aby zapewnić przepływ przemieszczający wskaźnik poziomu powietrza znajdujący się w urządzeniu do wartości ok. 40. Włącz chłodziarkę.
    4. Włącz urządzenie i uruchom oprogramowanie Menedżer Widm ikona, a następnie otwórz okno akwizycji Pomiar widma.
    5. Przed rozpoczęciem akwizycji należy przepłukać instrument azotem przez 5 min.
    6. Należy pozyskać widma, stosując następujące parametry Pomiar>Parametry i dostosować parametry w następujący sposób:
      1. Pod Ogólnewybierz: Skanowanie 200-350 nm; Kanały CD i HT: Interwał danych (data pitch) 0,1 nm; prędkość skanowania 100 nm/min; szerokość pasma 1 nm; liczba akumulacji 5.
      2. Pod jednostka komórkowawybierz 20 °CPod kontrolawybierz opcję „Shutter is opened and closed automatically” (Migawka otwiera się i zamyka automatycznie). W sekcji informacjewybierz nazwę, stężenie, operatora.
      3. Pod Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.przejdź do wybranego folderu. Kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
    7. Pozyskaj widma Pomiar>Pomiar próbki, zidentyfikuj pozycję (pozycje) kuwet w wymienniku próbek 1-6 odpowiednio kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
  3. W przypadku pomiaru przejścia denaturacji termicznej:
    1. Zamknij oprogramowanie akwizycyjne Plik>Wyjście i otwórz nowy program Pomiar zmiennej temperatury>Pomiar>Parametry.
    2. Zastosuj następujące parametry w celu zarejestrowania przejścia termicznego, które można dostosować według uznania:
      1. Pod Temperatura, wybierz temperaturę początkową: 4 °C; odstęp: 0,2; cel: 90 °Cgradient: 1 °C/min; odczekać 0 s. Pod Start/Koniecwybierz warunek startowy & warunek końcowy zgodnie z potrzebami.
      2. Pod Ogólnewybrać 3 kanały: CD/HT/Abs; szerokość pasma: 1 nm; długość fali: 270 nm (lub według uznania). W sekcji Kontrola, nie zaznaczono niczego. Pod Informacjewybierz nazwę, stężenie, operatora.
      3. Pod Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia., przejdź do wybranego folderu. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
    3. Schładzać próbki do 4 °C należy odczekać 5 min w tej temperaturze przed wykonaniem pomiaru widma.
  4. Opracowanie danych dla widm.
    1. Korzystając z funkcji w oprogramowaniu, należy odjąć widmo tła od widma próbki w celu skorygowania sygnałów tła pochodzących ze stosowanego systemu buforowego: Analiza widm>Plik>Otwórz.
    2. Po otwarciu pustego pliku oraz pliku ze widmem, należy przeciągnąć okno View 2 pod okno View 1 (po lewej stronie ekranu).
    3. Kliknij w Przetwarzanie>odjęcie>Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. lub wymiana danych>Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
    4. Wyeksportuj dane do pliku ASCII: Plik>Eksport i wybierz ASCII.
    5. Należy użyć oprogramowania do wykreślenia odpowiadającego widma. W przypadkach, gdy stosunek sygnału do szumu jest niższy od oczekiwanego, dopuszczalne jest wygładzanie danych. Transformację tę można przeprowadzić, wybierając opcję wygładzania danych.
  5. Opracowanie danych dla przejść termicznej denaturacji.
    1. Wyeksportuj dane z pliku JASCO do pliku ASCII.
    2. Nanieś punkty eliptyczności w funkcji temperatury. Zazwyczaj, w zależności od badanej długości fali, konieczne jest wygładzenie danych. W niektórych przypadkach zastosowanie długości fali 210 nm wykazało większe różnice między wykresami, co wymagało wygładzenia. Niemniej jednak, w zależności od próbki i stężeń, część obliczeń przeprowadzono z wykorzystaniem surowych danych.
    3. Aby obliczyć przejścia denaturacji termicznej (Tm) wartości, wyznaczono pierwszą pochodną krzywej. Maksima lub minima stanowiły wskazanie tego parametru. Podobnie jak w poprzednim kroku, w niektórych przypadkach wymagane było wygładzenie danych w celu uzyskania najdokładniejszej wartości.
      UWAGA: Eksperymenty przeprowadzano zazwyczaj w trzech powtórzeniach, co pozwoliło na wyznaczenie odpowiedniej średniej oraz odchylenia standardowego dla danego pomiaru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisano syntezę dodekamerów RNA zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje 2-tiofenylometylowe w pozycji C2'-O, wraz z odpowiadającym im oczyszczaniem i charakterystyką. Ponadto zamieszczono szczegółowy opis analizy strukturalnej przeprowadzonej za pomocą CD.

Cztery nici RNA (w tym nić o sekwencji komplementarnej) otrzymano za pomocą syntezy na fazie stałej, po której nastąpiło oczyszczanie, dając wydajność od 300 d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Intencją tego manuskryptu jest służenie jako przewodnik dla badaczy w tej dziedzinie, początkujących lub ekspertów, w celu pomyślnego osiągnięcia lub zwiększenia syntezy oligonukleotydów DNA lub RNA. Opisana metodologia koncentruje się na wykorzystaniu syntezy fazy stałej przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora DNA/RNA za pomocą standardowej chemii fosforoamidytu. Raport opisuje krok po kroku proces syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA. Ponadto zastosowanie CD jest wykorzystywane do identyfikacji dru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Przygotowanie tego manuskryptu było wspierane przez fundusze start-up z University of Colorado Denver (JMRE). AF pragnie podziękować za wsparcie ze strony nagrody za badania i działalność twórczą (RaCAS, CU Denver). Potwierdza się finansowanie z Biura Usług Badawczych Uniwersytetu Kolorado w Denver na pokrycie kosztów publikacji. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium, pani Cassandrze Herbert i panu Yannickowi K. Dzowo, za ich wkład w część wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AbsolveTMPerkinElmer6NE9711
Acetonitryl 99,9%, Klasa HPLCFisher Scientific75-05-8
Acetonitryl 99,9%, bezwodny do sekwencjonowania DNAFisher BioReagents75-05-8
Akrylamid, 99+%ACROS Organics164850025
Chlorek amonu 98+%Alfa Aesar12125-02-9
Cytrynian amonu, dwuzasadowy 98%Sigma Aldrich3012-65-5
Fluorek amonu  98,0%, klasa ACSAlfa Aesar12125-01-8
Wodorotlenek amonu 28 - 30% w wodzie, ACS PlusFisher Chemical1336-21-6
Nadsiarczan amonuACROS Organics1444
Argon-ultra wysoka czystość  Airgas7440-37-1
Bis-akryloamid Ultra czystyVWR-Amresco172
Kwas borowyFisher ScientificA73-1
Pirowęglan dietylu, 97%ACROS OrganicsA0368487
Etanol, bezwodny, klasy histologicznejFisher Chemical64-17-5
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa odwodnienie 100,2%Fisher Chemical6381-92-6
Formamid Thermo Scientific75-12-7
Kwas solny, 36,5 - 38,0%, Certyfikowany ACS PlusFisher Chemical7647-01-0
Sześciowodny chlorek magnezu, 99%Fisher Scientific7786-30-3
Metanol, 99,9%,  HPLC GradeFisher Chemical67-56-1
Metyloamina 40% w wodzieSigma Aldrich74-89-5
1-metylo-2-pirolidynon, iwodny, 99,5%Aldrich872-50-4
Opti-TOFTM 96 Wkład studzienkowy (123 x 81 mm) MDS SCIEX1020157
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11
Octan sodu, bezwodny 99,2%, Certyfikowany ACSFisher Chemical127-09-3
Chlorek sodu, 100,5%, Certyfikowany ACSFisher Chemical7647-14-5
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny 99,0%Sigma13472-35-0
2',4' Trietyloamina, 99+%Alfa Aesar121-44-8
TEMEDAmresco761
Trihydrofluorek trietyloaminy, 98%Aldrich73602-61-6
Kwas trifluorooctowy, 99%Alfa Aesar76-05-1
6'-trihydroksyacetofenon monohydrat 98%Sigma Aldrich480-66-0
Tris BaseFisher ScientificBP154-3
MocznikFisher ScientificU15-3
Odczynniki do syntezy RNA:
Mieszanka deblokująca, 3% kwas trichlorooctowy w dichlorometanieGlen Research  40-4140-57
Cap Mix A, THF/pirydyna/bezwodnik octowyGlen Research40-4110-52
Cap Mix B, 10% 1-metyloimidazol w THFGlen Research40-4120-52
Aktywator, 0,25 M 5-etylotio-1H-tetrazol w bezwodnym acetonitryluGlen Research  30-3140-52
Roztwór utleniający, 0,02 M jod w THF/pirydynie/wodzieGlen Research40-4330-52
U-RNA-CPGGlen Research20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG Glen Research20-3324-xx
Ac-G-CE Fosforoamidyt Glen Research10-3025-xx
U-CE FosforoamidynGlen Research10-3030-xx
Ac-C-CE FosforoamidynGlen Research10-3015-xx
Bz-A-CE Fosforoamidyt Badania Glena10-3003-xx

Bibliografia

  1. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
  2. Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
  3. Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
  4. Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
  5. El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
  6. Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
  7. Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
  8. Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
  9. Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
  10. Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
  11. Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
  12. Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
  13. Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
  14. Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
  15. Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
  16. Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
  17. Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
  18. Mergny, J. -L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  19. Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
  20. Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
  21. Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
  22. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
  23. Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
  24. Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
  25. Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
  26. AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
  27. Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie oligonukleotyd wanaliza dichroizmu ko owegochemia fosforamidytowasynteza oligomer w RNAelektroforeza w elu poliakrylamidowymchromatografia w fazie odwr conejspektroskopia UV visanaliza MALDI TOF
Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.