Method Article

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

DOI:

10.3791/56189

⸱

July 28th, 2017

 , 
1Department of Chemistry, University of Colorado Denver

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza fazy stałej została wykorzystana do uzyskania kanonicznych i zmodyfikowanych polimerów kwasów nukleinowych, w szczególności DNA lub RNA, co uczyniło ją popularną metodologią do zastosowań w różnych dziedzinach i do różnych celów badawczych. Opisana w niniejszym dokumencie procedura koncentruje się na syntezie, oczyszczaniu i charakterystyce dodekamerów RNA 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3' zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje zlokalizowane w pozycji C2'-O. Sondy są oparte na grupach 2-tiofenylometylowych, włączonych do nukleotydów RNA poprzez standardową syntezę organiczną i wprowadzonych do odpowiednich oligonukleotydów za pośrednictwem odpowiednich fosforamiditów. W niniejszym raporcie wykorzystano chemię fosforamidytów za pośrednictwem czterech kanonicznych zasad nukleotydowych (urydyna (U), cytozyna (C), guanozyna (G), adenozyna (A)), a także nukleotydy funkcjonalizowane 2-tiofenylometylemetylu zmodyfikowane w pozycji 2'-O; Metodologia ta jest jednak podatna na wiele różnych modyfikacji, które zostały opracowane na przestrzeni lat. Oligonukleotydy zsyntetyzowano na nośniku ze szkła o kontrolowanych porach (CPG), a następnie rozszczepiono z żywicy i zdeprotekowano w standardowych warunkach, tj. mieszaninie amoniaku i metyloaminy (AMA), a następnie fluorowodoru/trietyloaminy/N-metylopirolidynonu. Odpowiednie oligonukleotydy oczyszczono za pomocą elektroforezy poliakrylamidowej (20% denaturacji), a następnie elucji, odsalania i izolacji za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami (Sep-pak,C 18-kolumnowy). Ocenę ilościową i parametry strukturalne oceniono odpowiednio za pomocą analizy fotometrycznej w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis) i dichroizmu kołowego (CD). Niniejszy raport ma służyć jako źródło informacji i przewodnik dla początkujących i doświadczonych badaczy zainteresowanych rozpoczęciem pracy w tej dziedzinie. Oczekuje się, że będzie on służył jako praca w toku w miarę opracowywania nowych technologii i metodologii. Opis metodologii i technik zawartych w tym dokumencie odpowiada syntezatorowi DNA/RNA (odnowionemu i zakupionemu w 2013 r.), który wykorzystuje chemię fosforamidytu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza fazy stałej w celu uzyskania oligonukleotydów DNA/RNA to potężne narzędzie, które od lat 70. XX wieku ma wiele zastosowań w różnych dziedzinach1,2,3 przy użyciu bloków budulcowych fosforamidytu4. Przykłady jego szerokiego wpływu obejmują: jego wpływ na etykietowanie (poprzez reakcje chemiczne kliknięć)5, sondowanie strukturalne6 i technologie antysensowne7, a także wyjaśnienie mechanizmów biologicznych8,9, źródło jako materiał genetyczny10, oraz badanie różnych naturalnych i/lub chemicznych modyfikacji11,12, wśród wielu innych. Modyfikacja, którą tutaj stosujemy, stanowi pierwszy krok w naszych wysiłkach na rzecz uzyskania oligonukleotydów RNA, które zawierają sondy fotoaktywne, aby umożliwić czasową kontrolę struktury i funkcji tego ważnego biopolimeru.

Synteza dodekamerów RNA z sekwencjami: 5'-[CUA CGG AAU CAU]-3'/5'-[AUG AUU CCG UAG]-3' (podkreślone pozycje reprezentują włączenie modyfikacji C2'-O-tiofenylometylu) stanowi główny cel tego badania. Sekwencje zostały dobrane tak, aby umożliwić kwantyfikację i pomiar nici RNA jako pojedynczych nici lub jako odpowiadających im struktur dupleksowych (nie przewidywano żadnych innych struktur drugorzędowych jako stabilnych termodynamicznie). CD wykorzystano do wyznaczenia parametrów strukturalnych, tj. powstawania dupleksu i termicznych przemian denaturacyjnych.

Synteza
Ogólna procedura otrzymywania tych oligonukleotydów jest zilustrowana w Rysunek 1 i przedstawia proces krokowy: zautomatyzowana synteza w fazie stałej → deprotekcja → oczyszczanie → kwantyfikacja → charakteryzacja. Rysunek 2 przedstawia jednostki monomeryczne, które są niezbędne w tej procedurze. Synteza RNA w fazie stałej jest podobna do syntezy DNA, ponieważ opiera się na chemii fosforamidytu (Rysunek 2, po lewej) i zastosowaniu labilnych grup ochronnych dla nukleofilowych amin egzocyklicznych na G, A i C, np. acetylu, benzoilu, fenoksyacetylu, t-butylu lub N,N-dimetyloformamidu (Rysunek 2, po prawej). Jeszcze jednym aspektem do rozważenia w RNA, ze względu na obecność grupy C2'-OH (brak w biopolimerach deoksyoligonukleotydowych), jest dodatkowy krok, który należy włączyć w celu ochrony, a następnie deprotekcji tej pozycji nukleofilowej. Pod tym względem, grupy ochronne na bazie krzemu stały się atrakcyjną strategią ze względu na ich potencjał jako ugrupowań biortodolicznych (szczególnie odchronionych w obecności fluoru), z grupami tert-butylodimetylosililosililu (TBDMS) i triizopropylosilosililosmetylu (TOM) jako popularnymi wyborami (Rysunek 2, na dole po lewej).

W tej pracy automatyczna synteza została przeprowadzona na syntezatorze DNA/RNA, który wykorzystuje standardową chemię fosforamidytu. Ustawienia producenta w urządzeniu obejmują automatyczny etap rozcieńczania w przypadku korzystania z komercyjnych wersji fosforoamidynów do DNA lub opcję rozcieńczania w objętościach ustawionych przez użytkownika. Zdecydowaliśmy się jednak zważyć fosforoamidyn RNA i rozcieńczyć go ręcznie, biorąc pod uwagę, że: 1) cena kanonicznych fosforamidynów RNA jest wyższa (w niektórych przypadkach nawet 50-krotnie droższa); 2) modyfikowane fosforamidyty są często otrzymywane w małych ilościach; oraz 3) ilość marnowanego materiału przy użyciu automatycznego etapu rozcieńczania (ustawionego przez producenta) jest duża. Ponadto zastosowaliśmy: 1) dostępne na rynku stałe nośniki (np. CPG) zawierające chronioną zasadę nukleotydową pełniącą funkcję końca 3'; oraz 2) komercyjne fosforamidyty (kanoniczne zasady nukleotydowe) zabezpieczone grupą TBDMS w pozycji C2'-O. Szczegółowa lista etapów syntezy znajduje się w Rysunek 3 i Tabela 1, wraz z dalszym opisem i komentarzami do etapów, które zostały dostosowane do syntezy RNA. Ponadto, Rysunek 4 ilustruje stopniowe plony, które są obserwowane dla każdego kroku po wybraniu opcji 'Trityl Monitor', która określa ilościowo kation trytylu uwalniany z każdego etapu detrytylacji.

Warto zauważyć, że zazwyczaj z naszego doświadczenia wynika, że czynnikiem ograniczającym było uzyskanie fosforamidytu zawierającego pożądaną modyfikację. Oznacza to opracowanie syntetycznej metodologii, która pozwala na wprowadzanie modyfikacji w wybranych lokalizacjach. W niniejszym raporcie skupiamy się na włączeniu zmodyfikowanego nukleotydu, dla którego ustaliliśmy odpowiednią metodologię syntezy, grupę C2'-O-tiofenylometylu. Grupa ta jest niewielkich rozmiarów i w żaden sposób nie wpływa na syntezę w fazie stałej. Ponieważ doniesiono o włączeniu tej grupy do oligonukleotydów RNA, wraz z parametrami strukturalnymi i termodynamicznymi4, żadne aspekty syntezy organicznej prowadzącej do zmodyfikowanych fosforoamidynów nie zostaną opisane w niniejszym dokumencie.

Deprotekcja, Oczyszczanie i Charakteryzacja
Deprotekcja amin egzocyklicznych i grup ß-cyjanoetylowych zachodzi na tym samym etapie, co rozszczepienie z żywicy CPG. Zastosowaliśmy powszechnie stosowane warunki ogrzewania otrzymanej żywicy w obecności wodnego roztworu AMA, a następnie rozszczepienia grup C2'-O-sililowych w obecności jonów fluorkowych, a następnie oczyszczenia za pomocą elektroforezy żelowej. Chociaż w wielu przypadkach stały się one warunkami standardowymi, modyfikacje, które są odporne na warunki podstawowe lub jony fluorkowe, mogą wymagać łagodniejszych warunków13,14, np. metanol/węglan potasu (MeOH/K2CO3) lub butyloamina. W związku z tym konieczny jest inny zestaw grup ochronnych na odpowiadających im fosforamidytach. Ponadto wybraliśmy elektroforezę jako preferowaną alternatywę do oczyszczania odchronionych oligomerów, biorąc pod uwagę nasze wcześniejsze doświadczenia z tą metodą i brak innych oprzyrządowań. Jednak HPLC może być alternatywnie stosowany jako skuteczna metoda15. Charakterystykę oczyszczonych oligonukleotydów przeprowadzono za pomocą spektrometrii mas, matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej czasu lotu (MALDI-TOF), przy użyciu procedury zgłoszonej przez naszą grupę16.

Charakterystyka strukturalna i stabilność termiczna otrzymanych dupleksów została przeprowadzona za pomocą płyty CD. W szczególności wykorzystujemy CD do określania termicznych przejść denaturacyjnych zmodyfikowanych i niemodyfikowanych oligonukleotydów RNA, śledząc spadek eliptyczności pasma przy ok. 270 nm, a także zanik pasma (o ujemnej eliptyczności) przyλ max przy 210 nm. Przedstawiono porównanie widm przed i po hybrydyzacji w celu zilustrowania ich różnic i walidacji zastosowanej metodologii. Zastosowanie CD jest powszechnie akceptowane w określaniu motywów strukturalnych w kwasach nukleinowych i aminokwasach17, a zatem może być stosowane jako narzędzie do określania różnych parametrów strukturalnych i termodynamicznych18; Nie ma jednak wielu przykładów, w których technika ta jest stosowana do oceny przemian denaturacji termicznej. Niektóre przypadki obejmują określenie stabilności termicznej na DNA zawierającym G-kwadrupleksy19,20 lub w dupleksach i spinkach do włosów RNA21.

Ten raport ma na celu dostarczenie czytelnikowi lub widzowi niebędącemu ekspertem zestawu narzędzi, które umożliwiają płynne rozpoczęcie tego typu badań. Będzie on służył do ulepszenia i porównania z metodologiami i technikami w innych laboratoriach badawczych, które są zaangażowane w tę ekscytującą gałąź nauki. Treść tego raportu uzupełnia istniejące protokoły tej technologii z różnych źródeł oraz wzbogaca i ułatwia korzystanie z niej dzięki pomocy wizualnej dla każdego kroku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza oligonukleotydów RNA w fazie stałej

  1. Przygotowanie roztworów zawierających każdy fosforoamidyn (tabela 1).
    1. Policz liczbę nukleotydów i dopasuj się do równania n+1 (gdzie n = liczba nukleotydów) odpowiadających każdej zasadzie i wypełnij tabelę brakującymi wartościami. Objętość = 0,15 ml na nukleotyd o stężeniu 0,1 M, rozpuszczony w bezwodnym acetonitrylu.
    2. Odważyć każdy fosforoamidyn do wysuszonych w piecu bursztynowych butelek o pojemności 10 ml (Septum Top, Amber 394, Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) i natychmiast umieścić w próżni za pomocą eksykatora zawierającego środek suszący.
    3. Napełnij eksykator suchym argonem, wyjmij butelkę i natychmiast rozcieńcz odpowiednią ilością acetonitrylu (bezwodnego) przed przymocowaniem do urządzenia.
      UWAGA: Upewnij się, że używasz gazoszczelnych strzykawek i przez cały czas utrzymuj bezwodną atmosferę.
    4. Wyjmij przegrodę z butelki i umieść ją w maszynie za pomocą funkcji wymiany butelki.
      UWAGA: Proces ten wymaga dodatkowego 0,15 ml (stąd nadmiar objętości w powyższym równaniu n + 1) każdego roztworu, aby zagruntować linię przed syntezą.
  2. Konfiguracja syntezy sekwencyjnej i syntezy w fazie stałej za pomocą oprogramowania (Rysunek 3).
    1. Kliknij ikonę oprogramowania (np. OligoNet 1.0.1) i wybierz Nazwa urządzenia>OK. Utwórz nową syntezę według File>New Synthesis>Order.
    2. Wypełnij: Data; Identyfikator biegu; wybierz instrument; nazwa sekwencji; sekwencja (koniec od 5' do 3'). W obszarze |cycle przypisz wcześniej utworzoną metodę (Rysunek 3). Wybierz procedurę końcową (pozostawia oligonukleotyd związany z żywicą CPG) > instrukcję.
    3. Wybierz DMT Off >(leczenie TCA w ostatnim kroku, aby uzyskać grupę 5'-OH na końcu syntezy); zapisz Plik>Zapisz jako i podaj nazwę eksperymentu.
    4. Wyślij plik, aby rozpocząć syntezę Zamów>Wyślij zamówienie do syntezatora i wybierz kolumnę 1-4. Otwórz okno syntezatora i wybierz trityl monitor|wybierz funkcję|trity>monitor każdego kroku.
    5. W razie potrzeby powtórz kroki w zależności od liczby oligonukleotydów, które mają być zsyntetyzowane jednocześnie (należy pamiętać, że wszystkie zamówienia muszą mieć tę samą metodę, tj. te same czasy sprzęgania i sekwencję zdarzeń).
    6. Rozpocznij syntezę Syntezator>Przygotuj się do rozpoczęcia. Umieść kolumny z żądanym końcem 3' w miejscach wskazanych na instrumencie. Na instrumencie kliknij Start>No (aby przygotować ABI).
    7. Po zakończeniu syntezy wyjąć kolumnę z przyrządu i umieścić w kolbie okrągłodennej, a następnie suszyć pod zmniejszonym ciśnieniem przez około 0,5 godziny
      UWAGA: Zaleca się sprawdzenie, czy w sprzęgach losowych obserwuje się głęboki pomarańczowy kolor (kroki 1.2.4 - 1.2.7), aby uniknąć potencjalnych błędów funkcji monitora trytylowego.
  3. Deprotekcja i oczyszczanie oligonukleotydów RNA.
    1. Otwórz kolumnę, przekręcając czarną nakrętkę i przenieś całość (lub połowę, w zależności od potrzeby lub celu) białej żywicy do probówki wirówkowej o pojemności 1,6 ml. Dodaj 0,5 ml metyloaminy (40% w wodzie)/amoniaku (40% w wodzie) w stosunku 1:1.
    2. Zabezpieczyć nakrętkę probówki wirówkowej parafilmem i za pomocą bloku grzewczego podgrzać do 60 °C przez 1,5 h.
      UWAGA: Ciężki przedmiot można umieścić na górze probówki, aby zapewnić, że stężenie amoniaku pozostanie stałe wewnątrz probówki reakcyjnej.
    3. Wyjmij z bloku grzewczego i powoli schładzaj do temperatury pokojowej. Krótko odwirować próbkę, aby odwirować zawartość, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej.
    4. Próbki należy zamrozić, zanurzając probówki w ciekłym azocie (lub kąpieli suchego lodu/etanolu) i zagęścić do sucha, wirując w wirówce pod zmniejszonym ciśnieniem.
    5. Zawiesić ciała stałe w 0,4 ml roztworu trietyloaminy/N-metylopirolidynonu/trihydrofluorku trietyloaminy (w stosunku 2:2:3). Podgrzewać do 60 °C przez 1,5 godziny, a następnie powoli schładzać do temperatury pokojowej.
    6. Dodać 0,04 ml roztworu NaOAc (3M, pH 5,5 - dostosowany HCl), a następnie delikatnie wymieszać końcówką pipety. Dodać etanol (1 ml) i schłodzić do temperatury ok. -70 °C (kąpiel suchego lodu/etanolu) przez 15 min.
    7. Wirować przy 15 000 obr./min i w temperaturze 4 °C przez 10 min. Za pomocą pipety wyekstrahować podwielokrotność i wysuszyć powstały osad pod zmniejszonym ciśnieniem.
    8. Otrzymaną substancję stałą zawiesić ponownie w buforze ładującym (0,2 ml, 90% aq formamidu, 1 mM EDTA) i mieszać do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
    9. Załadować zawiesinę na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy (20% denaturacji, wymiary studzienki: 30 cm x 1 mm)22.
    10. Przeciągnij prąd przez żel, aż niebieski marker bromofenolowy znajdzie się między 1/2-2/3 w dół żelu (wymiary żelu: ~ 21,5 cm x 30 cm).
    11. Wyjmij żel ze stojaka i przenieś zawartość żelu ze szkła na plastikową folię (pokrytą z obu stron) i umieść na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) pokrytej krzemionką (zawierającą barwnik fluorescencyjny o długości fali 254 nm) w celu uwidocznienia prążków za pomocą lampy UV (λmax = 254 nm).
    12. Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję, w której znajduje się górny pasek i odetnij go za pomocą nowej żyletki. Umieść żel zawierający RNA (bez plastikowej folii) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zmiażdż na małe kawałki za pomocą szklanej pałeczki.
    13. Zawiesić pozostałości żelu w roztworze NaCl aq. (200 mM NaCl i 1 mM EDTA) i wstrząsać zawiesiną w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Odwirować stożkową probówkę przez 10 minut.
    14. Odsalić za pomocą wkładu C18 z odwróconą fazą.
      1. Przygotować wkład za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, przemywając za pomocą:
        Acetonitryl (10 ml)
        H2O (dwukrotnie, 10 ml)
        5 mM roztwór NH4OAc aq (3 ml)
        Roztwór zawierający RNA, uważając, aby nie wlać żadnych pozostałości żelu.
      2. Przemyć H2O (trzy razy po 10 ml).
      3. Eluować z kolumny za pomocą 60% roztworu metanolu o wysokiej jakości wody (3 ml)
    15. Zagęścić pod zmniejszonym ciśnieniem i ponownie rozpuścić w wodzie wolnej od RNaz (0,3 ml)
    16. Przygotować rozcieńczony roztwór (10 μl) i umieścić 1 μl na przyrządzie UV-vis (np. Nanodrop) w celu zmierzenia widma UV-vis (200-450 nm).
    17. Użyj prawa Piwa Lamberta, aby określić stężenie otrzymanego roztworu:
      figure-protocol-1
      gdzie A = uzyskana absorbancja; ε = obliczony molowy współczynnik ekstynkcji; c = stężenie, a l = 0,1 dla długości drogi 1 mm.
    18. Oblicz współczynniki ekstynkcji molowej dla oligonukleotydów; obliczone tutaj za pomocą kalkulatora on-line, który korzysta z oprogramowania DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)23
  4. Oznaczanie i charakterystyka stężenia za pomocą MALDI-TOF.
    1. Załaduj próbki na płytkę MALDI za pomocą końcówki pipety wyposażonej w końcówkę C18 w celu odsolenia i znajdź każdy oligonukleotyd.
      1. Umyj końcówkę 50% acetonitrylem (10 μl x 2). Zrównoważyć końcówkę 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA; 10 μl x 2). Załaduj końcówkę próbką (zwykle 100-150 pmol).
      2. Umyj końcówkę 0,1% TFA (10 μL x 2), a następnie wodą (10 μL x 2).
      3. Eluować próbkę do roztworu zawierającego pożądaną matrycę; użyliśmy roztworu: 10 μL 25 mM-2,4,6-trihydroksyacetofenonu monohydratu (THAP), 10 mM cytrynianu amonu i 300 mM fluorku amonu w 50% acetonitrylu.
      4. Umieścić bezpośrednio na płytce MALDI, narzucając 0,9 μl (a następnie susząc na powietrzu) i powtarzając procedurę w razie potrzeby.
        UWAGA: Wszystkie widma uzyskano w trybie dodatnim reflektora.

2. Analiza struktury RNA za pomocą płyty CD

  1. Przygotowanie roztworów na płytę CD.
    1. Przygotować 0,25 ml zawierające zmodyfikowany RNA [3 μM], NaCl [10 mM], bufor fosforanu sodu [10 mM, pH 7,2] i MgCl2 [5 mM]. Próbka jest gotowa do analizy w takim stanie, w jakim się znajduje, szczególnie jeśli reprezentuje przejście jednocząsteczkowe.
    2. Jeśli celem jest analiza struktur dupleksowych lub przejść dwumolekularnych, dodaj dopełniacz (odpowiednik 1 mola, jeśli dotyczy) w tym momencie lub kontynuuj wykonywanie poniższego kroku.
    3. Umieścić próbkę na bloku grzewczym, wstępnie podgrzanym do 90 °C, i wyłączyć ogrzewanie, aby kontrolować powolne chłodzenie do temperatury pokojowej (zwykle 2 - 4 godziny).
  2. Akwizycja widm
    1. Przygotować roztwór próby ślepej (NaCl 10 mM, fosforan sodu 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), przenieść do mikrokuwety (długość ścieżki 1 cm, minimalna objętość 250 μl) i umieścić na uchwycie podajnika próbek w przyrządzie.
    2. Przenieść próbkę zawierającą RNA do innej mikrokuwety i umieścić w podajniku próbek. Jeśli mierzysz termiczne przejście denaturacji, ostrożnie dodaj złoże oleju, nie naruszając warstwy wodnej i zabezpiecz nakrętkę kuwety za pomocą kawałka taśmy teflonowej.
    3. Otwórz zbiornik azotu, aby zapewnić przepływ, który przesuwa pływak powietrza znajdujący się na przyrządzie do ok. 40. Włącz chłodnicę.
    4. Włącz instrument i otwórz ikonę oprogramowania Spectra Manager, a następnie otwórz okno akwizycji Pomiar widm.
    5. Przedmuchuj instrument azotem przez 5 minut przed pobraniem.
    6. Uzyskaj widma za pomocą następujących parametrów: Zmierz>Parametry i dostosuj parametry w następujący sposób:
      1. W obszarze Ogólne wybierz: Skanowanie 200–350 nm; Kanały CD i HT: Wysokość dźwięku przy 0,1 nm; prędkość skanowania przy 100 nm/min; szerokość pasma przy 1 nm; liczba akumulacji na poziomie 5.
      2. W obszarze Jednostka ogniwa wybierz 20 °C. W obszarze Sterowanie wybierz opcję Migawka jest otwierana i zamykana automatycznie. W obszarze Informacje wybierz nazwę, stężenie, operatora.
      3. W obszarze Dane przejdź do żądanego folderu. Kliknij przycisk OK.
    7. Uzyskaj widma Pomiar >Próbka, zidentyfikuj odpowiednio pozycje kuwet w podajniku próbek 1-6, kliknij OK.
  3. W przypadku przejścia denaturacji termicznej:
    1. Zamknij oprogramowanie do akwizycji File>Exit i otwórz nowy program Variable Temperature Measurement>Measure>Parameters.
    2. Zastosuj następujące parametry, aby zarejestrować przemianę termiczną, którą można dostosować zgodnie z potrzebami:
      1. W polu Temperatura wybierz temperaturę początkową: 4 °C; interwał: 0,2; cel: 90 °C; nachylenie: 1 °C/min; odczekaj 0 s. W obszarze Rozpoczęcie/Koniec wybierz Warunek początkowy i Warunek końcowy zgodnie z potrzebami.
      2. W obszarze Ogólne wybierz 3 kanały, CD/HT/Abs; szerokość pasma: 1 nm; długość fali: 270 nm (lub według potrzeb). W obszarze Kontrola wybierz opcję brak. W obszarze Informacje wybierz nazwę, stężenie, operatora.
      3. W obszarze Dane przejdź do żądanego folderu. Kliknij przycisk OK.
    3. Schłodzić próbki do temperatury 4 °C i odczekać 5 minut w tej temperaturze przed uzyskaniem pomiaru widma.
  4. Przetwarzanie danych dla widm.
    1. Korzystając z funkcji w oprogramowaniu, odejmij ślepe widmo od akwizycji celu, aby uwzględnić sygnały tła powstające z używanego systemu buforowego: Analiza widm>Plik>Otwarty.
    2. Po otwarciu pustego pliku i pliku widm przeciągnij Widok 2 pod Widok 1 (po lewej stronie ekranu).
    3. Kliknij Przetwarzanie>odejmowanie>OK lub wymień dane>OK.
    4. Wyodrębnij dane jako plik ASCII: Plik>Eksport i wybierz ASCII.
    5. Użyj oprogramowania, aby wykreślić odpowiednie widmo. Wygładzanie danych jest opcjonalne w przypadkach, gdy stosunek sygnału do szumu jest niższy niż oczekiwano. Tę transformację można zastosować, stosując opcję wygładzania danych.
  5. Opracowywanie danych dla przemian termicznych denaturacji.
    1. Wyodrębnij dane z pliku JASCO jako plik ASCII.
    2. Wykreśl punkty eliptyczności w funkcji temperatury. Zazwyczaj wygładzenie danych jest konieczne w zależności od badanej długości fali. W niektórych przypadkach użycie długości fali przy 210 nm powodowało większe różnice między wykresami, które wymagały wygładzenia. Jednak w zależności od próbki i stężeń przeprowadzono szereg obliczeń na podstawie danych surowych.
    3. Aby obliczyć wartość przejść denaturacji termicznej (Tm), należy uzyskać pierwszą pochodną krzywej. Maksima lub minima były wskazówką tego parametru. Podobnie jak w poprzednim kroku, niektóre przypadki wymagały wygładzenia danych w celu uzyskania najdokładniejszej wartości.
      UWAGA: Eksperymenty przeprowadzano zazwyczaj w trzech egzemplarzach, co dawało odpowiednią średnią i odchylenie standardowe dla pomiaru.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza dodekamerów RNA zawierających zero, jedną lub dwie modyfikacje 2-tiofenylometylometylu w pozycji C2'-O jest opisana wraz z odpowiadającym jej oczyszczaniem i charakterystyką. Ponadto dołączony jest szczegółowy opis analizy statyczno-wytrzymałościowej, która została przeprowadzona za pomocą płyty CD.

Cztery nici RNA (w tym nić o komplementarnej sekwencji) uzyskano poprzez syntezę w fazie stałej, po której nastąpi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intencją tego manuskryptu jest służenie jako przewodnik dla badaczy w tej dziedzinie, początkujących lub ekspertów, w celu pomyślnego osiągnięcia lub zwiększenia syntezy oligonukleotydów DNA lub RNA. Opisana metodologia koncentruje się na wykorzystaniu syntezy fazy stałej przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora DNA/RNA za pomocą standardowej chemii fosforoamidytu. Raport opisuje krok po kroku proces syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA. Ponadto zastosowanie CD jest wykorzystywane do identyfikacji dru...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie tego manuskryptu było wspierane przez fundusze start-up z University of Colorado Denver (JMRE). AF pragnie podziękować za wsparcie ze strony nagrody za badania i działalność twórczą (RaCAS, CU Denver). Potwierdza się finansowanie z Biura Usług Badawczych Uniwersytetu Kolorado w Denver na pokrycie kosztów publikacji. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium, pani Cassandrze Herbert i panu Yannickowi K. Dzowo, za ich wkład w część wideo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AbsolveTMPerkinElmer6NE9711
Acetonitryl 99,9%, Klasa HPLCFisher Scientific75-05-8
Acetonitryl 99,9%, bezwodny do sekwencjonowania DNAFisher BioReagents75-05-8
Akrylamid, 99+%ACROS Organics164850025
Chlorek amonu 98+%Alfa Aesar12125-02-9
Cytrynian amonu, dwuzasadowy 98%Sigma Aldrich3012-65-5
Fluorek amonu  98,0%, klasa ACSAlfa Aesar12125-01-8
Wodorotlenek amonu 28 - 30% w wodzie, ACS PlusFisher Chemical1336-21-6
Nadsiarczan amonuACROS Organics1444
Argon-ultra wysoka czystość  Airgas7440-37-1
Bis-akryloamid Ultra czystyVWR-Amresco172
Kwas borowyFisher ScientificA73-1
Pirowęglan dietylu, 97%ACROS OrganicsA0368487
Etanol, bezwodny, klasy histologicznejFisher Chemical64-17-5
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa odwodnienie 100,2%Fisher Chemical6381-92-6
Formamid Thermo Scientific75-12-7
Kwas solny, 36,5 - 38,0%, Certyfikowany ACS PlusFisher Chemical7647-01-0
Sześciowodny chlorek magnezu, 99%Fisher Scientific7786-30-3
Metanol, 99,9%,  HPLC GradeFisher Chemical67-56-1
Metyloamina 40% w wodzieSigma Aldrich74-89-5
1-metylo-2-pirolidynon, iwodny, 99,5%Aldrich872-50-4
Opti-TOFTM 96 Wkład studzienkowy (123 x 81 mm) MDS SCIEX1020157
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11
Octan sodu, bezwodny 99,2%, Certyfikowany ACSFisher Chemical127-09-3
Chlorek sodu, 100,5%, Certyfikowany ACSFisher Chemical7647-14-5
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny 99,0%Sigma13472-35-0
2',4' Trietyloamina, 99+%Alfa Aesar121-44-8
TEMEDAmresco761
Trihydrofluorek trietyloaminy, 98%Aldrich73602-61-6
Kwas trifluorooctowy, 99%Alfa Aesar76-05-1
6'-trihydroksyacetofenon monohydrat 98%Sigma Aldrich480-66-0
Tris BaseFisher ScientificBP154-3
MocznikFisher ScientificU15-3
Odczynniki do syntezy RNA:
Mieszanka deblokująca, 3% kwas trichlorooctowy w dichlorometanieGlen Research  40-4140-57
Cap Mix A, THF/pirydyna/bezwodnik octowyGlen Research40-4110-52
Cap Mix B, 10% 1-metyloimidazol w THFGlen Research40-4120-52
Aktywator, 0,25 M 5-etylotio-1H-tetrazol w bezwodnym acetonitryluGlen Research  30-3140-52
Roztwór utleniający, 0,02 M jod w THF/pirydynie/wodzieGlen Research40-4330-52
U-RNA-CPGGlen Research20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG Glen Research20-3324-xx
Ac-G-CE Fosforoamidyt Glen Research10-3025-xx
U-CE FosforoamidynGlen Research10-3030-xx
Ac-C-CE FosforoamidynGlen Research10-3015-xx
Bz-A-CE Fosforoamidyt Badania Glena10-3003-xx

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
  2. Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
  3. Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
  4. Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
  5. El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
  6. Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
  7. Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
  8. Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
  9. Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
  10. Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
  11. Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
  12. Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
  13. Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
  14. Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
  15. Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
  16. Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
  17. Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
  18. Mergny, J. -L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  19. Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
  20. Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
  21. Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
  22. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
  23. Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
  24. Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
  25. Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
  26. AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
  27. Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Solid phase SynthesisOligonucleotide PurificationCircular Dichroism AnalysisPhosphoramidite ChemistryRNA Oligomer SynthesisPolyacrylamide ElectrophoresisReversed phase ChromatographyUV vis SpectroscopyMALDI TOF Analysis2 O thiophenylmethyl Modification

Related Articles