Artykuł metodologiczny

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

24.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56191

⸱

9 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Streszczenie

W obrębie wrodzonego układu odpornościowego, limfocyty efektorowe znane jako komórki NK odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed nieprawidłowymi komórkami, w szczególności eliminując komórki nowotworowe i wirusowo zakażone. Około 30 znanych defektów monogenowych, wraz z wieloma innymi stanami patologicznymi, powoduje funkcjonalny lub klasyczny niedobór komórek NK, objawiający się zmniejszoną aktywnością cytotoksyczną lub jej brakiem. Historycznie rzecz biorąc, cytotoksyczność była badana metodami radioaktywnymi, które są uciążliwe, drogie i potencjalnie niebezpieczne. W artykule opisano uproszczoną, mającą zastosowanie kliniczne metodę opartą na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej komórek NK. W tym teście komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) lub oczyszczone preparaty komórek NK są inkubowane w różnych proporcjach z docelową linią komórek nowotworowych, o której wiadomo, że jest wrażliwa na cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK (NKCC). Komórki docelowe są wstępnie znakowane barwnikiem fluorescencyjnym, aby umożliwić ich odróżnienie od komórek efektorowych (komórek NK). Po okresie inkubacji zabite komórki docelowe są identyfikowane za pomocą barwienia kwasem nukleinowym, który specyficznie przenika do martwych komórek. Metoda ta nadaje się zarówno do zastosowań diagnostycznych, jak i badawczych, a dzięki wieloparametrowym możliwościom cytometrii przepływowej ma dodatkową zaletę, jaką jest potencjalne umożliwienie głębszej analizy fenotypu i funkcji komórek NK.

Wprowadzenie

Komórki NK są wyrafinowanym podzbiorem ludzkich wrodzonych limfocytów, które są krytycznie zaangażowane w eliminację komórek zakażonych wirusem, komórek transformowanych i innych zagrożeń chorobotwórczych 1,2. Granulki lityczne komórek NK zawierają białka cytotoksyczne, takie jak perforyna i granzymy. Po aktywacji komórki NK tworzą złożoną interakcję ze swoimi celami, znaną jako synapsa immunologiczna, w wyniku której te cząsteczki cytolityczne są lokalnie uwalniane, co powoduje bezpośrednią lizę i apoptozę komórek docelowych, wraz z uwalnianiem cytokin i chemokin, a ostatecznie indukcją stanu zapalnego 1,3,4.

Aktywacja komórek NK obejmuje złożony ciąg aktywujących i hamujących interakcji między receptorami komórek NK a ligandami wyrażającymi się na powierzchni komórek docelowych, tworząc ściśle regulowany system. Jednym z najlepiej zbadanych mechanizmów aktywacji komórek NK jest "brakujące ja". Rzeczywiście, brak wykrycia głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub cząsteczek ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) na zakażonych lub transformowanych komórkach wyzwala cytotoksyczność komórek NK. Komórki zakażone nowotworem i wirusem na ogół obniżają poziom tych antygenów, aby uniknąć odporności za pośrednictwem limfocytów T, stając się w ten sposób głównymi celami komórek NK 1,3,4.

Ocena funkcji komórek NK jest przede wszystkim podzielona na testy degranulacji lub cytotoksyczności. Jednak testy degranulacji, takie jak cytometryczne wykrywanie markera CD107a związanego z degranulacją, wskazują jedynie na aktywację komórek NK, a nie na ich ostateczną funkcję, bezpośrednie zabijanie komórek docelowych 5,6,7,8. W związku z tym to ograniczenie skłoniło badaczy do testów cytotoksyczności jako bardziej wymownej i bardziej bezpośredniej alternatywy.

Długotrwałym "złotym standardem" do oceny cytotoksycznej aktywności komórek T i NK za pośrednictwem komórek jest test uwalniania chromu (CRA). CRA polega na radioaktywnym znakowaniu komórek docelowych za pomocą 51Cr i współinkubowaniu ich z komórkami efektorowymi. Test ten opiera się na zasadzie, że liza komórek powoduje uwolnienie związanego z białkiem 51Cr do supernatantu, co można zmierzyć za pomocą zliczania promieni gamma. Ten test, choć skuteczny, jest problematyczny z wielu powodów: wysokie koszty materiałów, obchodzenie się i usuwanie radioaktywnego 51Cr, spontaniczne uwalnianie 51Cr i trudna standaryzacja - co czyni go całkowicie niepraktycznym 9,10.

Od tego czasu opracowano szereg testów nieradioaktywnych, obejmujących znakowanie fluorescencyjne, uwalnianie enzymów, a nawet bioluminescencję, jako alternatywy dla CRA 11,12,13,14. Opisujemy tutaj opartą na cytometrii przepływowej metodę pomiaru aktywności cytotoksycznej komórek NK na komórkach docelowych K562, która jest prosta, czuła i powtarzalna. Komórki K562 to ludzka erytroreukemiczna linia komórkowa o zmniejszonej ekspresji HLA klasy I i podwyższonej ekspresji ligandów dla aktywujących receptorów NK, co czyni je szczególnie podatnymi na cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK 15. W tym teście komórki K562 są wstępnie znakowane estrem sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) i współhodowane w różnych proporcjach z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) lub oczyszczonymi komórkami NK 1. CFSE jest stabilnym, wiążącym białka barwnikiem fluorescencyjnym, który umożliwia odróżnienie komórek docelowych od efektorowych komórek NK 16,17. Po koinkubacji do identyfikacji zabitych komórek docelowych stosuje się barwienie kwasem nukleinowym, specyficznie przenikającym przez błonę martwych komórek (patrz tabela materiałów). Próbki są następnie pobierane na cytometrze przepływowym w celu określenia procentu martwych (tj. barwiących +) komórek docelowych CFSE +.

Ten test może być używany jako rutynowe badanie diagnostyczne dla monogenowych defektów wpływających na przedział komórek NK, z których istnieje około 30 znanych defektów powodujących funkcjonalny lub klasyczny niedobór komórek NK, oraz dla pierwotnej lub wtórnej limfohistiocytozy hemofagocytarnej. Jest również przydatny do badania aktywności komórek NK u pacjentów z nawracającymi, ciężkimi infekcjami wirusowymi opryszczki, do oceny rekonstytucji immunologicznej po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych lub po terapii immunomodulującej 18,19,20 oraz do wielu podstawowych zastosowań badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki zostały pobrane zgodnie z wytycznymi etycznymi ustanowionymi przez UCLA Human Research Protection Program i zatwierdzone przez IRB.

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie odczynniki powinny mieć możliwość zrównoważenia w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wszystkie odczynniki muszą pozostać sterylne.

  1. Przygotuj 2x roztwór roboczy Tween-20 (tj. 0,2%), dodając 10 μl roztworu Tween-20 do 5 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) bez wapnia i magnezu za pomocą pipety p20.
    1. Biorąc pod uwagę wysoką lepkość Tween-20, należy podjąć następujące kroki, aby zapewnić dokładność: zbieraj powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, nie zanurzaj całej końcówki, aby uniknąć przenoszenia, i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół w PBS, aby wypłukać cały Tween-20 z końcówki.
  2. Dodać 2 μl roztworu podstawowego IL-2 (2,1E6 j.m./ml) do 198 μl kompletnej pożywki (tj. rozcieńczenie 1:100), czyli RPMI z 1% penicyliną-streptomycyną i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), a następnie przystąpić do dodatkowego rozcieńczenia 1:100, dodając 2 μl roztworu pośredniego IL-2 do 198 μl kompletnej pożywki, aby przygotować 7x roztwór roboczy (210 j.m./ml).
  3. Dodać 2 μl roztworu podstawowego CFSE (5 mM) do 500 μl zwykłej pożywki (RPMI). Wirować, odwirować w dół, aby usunąć krople z nakrętki, a następnie przystąpić do dodatkowego rozcieńczenia 1:20, dodając 50 μl roztworu pośredniego CFSE do 950 μl zwykłego RPMI, aby uzyskać 2x roztwór roboczy 1 μM. Dobrze wirować i chronić przed światłem.

2. Izolacja PBMC jako komórek efektorowych

UWAGA: Ten test został zatwierdzony do skutecznego użycia z całkowitą liczbą PBMC od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Zaleca się jednak, aby zawartość komórek NK była weryfikowana przy każdym preparacie PBMC (Rysunek 1). Ponadto objętość krwi pełnej do pobrania zależy od częstości występowania komórek NK w obwodowej krwi pełnej i może się ona różnić w zależności od osoby, szczególnie między zdrowymi dawcami a pacjentami.

  1. Zebrać co najmniej 4 ml ludzkiej krwi pełnej w probówkach do pobierania krwi w heparynizacji sodu lub litu. Próbki krwi należy przechowywać w temperaturze pokojowej po pobraniu i zużyć w ciągu 30 godzin od pobrania.
  2. Rozcieńczyć krew pełną 4 ml PBS (tj. równą objętość PBS w stosunku do krwi pełnej).
  3. Dodać 4 ml roztworu gradientu gęstości (patrz tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew pełną na roztwór gradientu gęstości, przechylając probówkę.
  4. Wirować przy 650 x g przez 24 minuty przy wyłączonym hamulcu.
  5. Ostrożnie zebrać warstwę komórek jednojądrzastych, która jest cienką białą warstwą poniżej górnej warstwy osocza i płytek krwi, do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość do 15 ml za pomocą PBS.
  6. Wirować przy 450 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml kompletnego podłoża.
  7. Użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby policzyć komórki i dostosuj stężenie PBMC do 5x106 komórek/ml z kompletną pożywką.
  8. Sprawdź zawartość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej (patrz krok 4).
  9. Test należy rozpocząć w ciągu 30 minut. Komórki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 10 minut lub umieścić w nawilżonym inkubatorze z 5% sprężonym stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia.

3. Izolacja komórek NK jako komórek efektorowych

UWAGA: Ta część protokołu jest alternatywą dla używania całkowitych PBMC jako komórek efektorowych. Typowa wydajność z 4 ml pełnej krwi od zdrowej osoby wynosi około 4x105 komórek NK, czyli około 5-15% PBMC, chociaż częstotliwość ta różni się w zależności od dawcy 21. Zaleca się przeprowadzenie kontroli czystości po izolacji.

  1. Zebrać co najmniej 4 ml ludzkiej krwi pełnej w probówkach do pobierania krwi w heparynizacji sodu lub litu. Weź 50 μl krwi pełnej do barwienia jako próbkę wstępnego wzbogacania.
  2. Dodać koktajl wzbogacający do próbek krwi w stężeniu 50 μl/ml (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać równą objętość PBS + 2% FBS, aby rozcieńczyć próbkę i delikatnie wymieszać.
  4. Dodać 4 ml roztworu gradientu gęstości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną próbkę na podłoże o gradiencie gęstości.
  5. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut przy wyłączonym hamulcu.
  6. Ostrożnie zbierz warstwę wzbogaconych komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj komórki, zwiększając objętość do 50 ml za pomocą PBS + 2% FBS.
  7. Wirować przy 300 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant i powtórzyć mycie.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml kompletnego podłoża.
  9. Za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru policz komórki i dostosuj stężenie do 5x105 komórek/ml. Pobrać 50 μl oczyszczonej zawiesiny komórkowej do barwienia jako próbkę po wzbogaceniu.
  10. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej do 10 minut lub umieść w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia.

4. Immunofenotypowanie do oceny zawartości komórek NK

  1. Używając łącznie 50 μl wyizolowanych PBMC, wstępnie wzbogaconej krwi pełnej lub oczyszczonych komórek NK, wybarwić przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem anty-CD56 jako markerem komórek NK. Markery dla innych typów komórek i linii genetycznych (tj. limfocytów T CD3+, limfocytów B CD19+) mogą być również włączone w celu oceny pochodzenia zanieczyszczenia, jeśli takie istnieje.
  2. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przemyć, dodając 2 ml PBS + 2% FBS.
  3. Wirować przy 450 x g przez 5 min.
  4. W przypadku komórek PBMC lub komórek NK należy odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS + 2% FBS.
  5. W przypadku próbek krwi pełnej należy przeprowadzić lizę krwinek czerwonych (RBC):
    1. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (31,75 g chlorku amonu + 4,16 g zasady Tris + 6,65 g EDTA, rozpuszczone w 5000 ml wody dejonizowanej).
    2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, odessać supernatant i ponownie zawiesić zlizowaną próbkę w 100 μl PBS + 2% FBS.
      UWAGA: Liza RBC może być również wykonana przed barwieniem.
    4. Kontynuuj analizę cytometrii przepływowej.

5. Rozmrażanie, hodowla i zbieranie komórek docelowych K562

  1. Porcję 10 ml kompletnej pożywki przelać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozostawić do ogrzania w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do rozmrażania i hodowli komórek K562 należy używać wyłącznie pożywki wstępnie podgrzanej do temperatury 37 °C na wszystkich etapach.
  2. Umieścić jedną fiolkę z zamrożonymi komórkami K562 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż większość z nich zostanie rozmrożona.
  3. Przenieść częściowo rozmrożone komórki K562 do kompletnej pożywki, wstępnie podgrzanej do 37 °C, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umyj wnętrze fiolki kriogenicznej wstępnie podgrzanym podłożem i dodaj płyn do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Wirować przy 140 x g przez 7 minut z włączonym hamulcem. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki.
  5. Podwielokrotnić odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej w celu zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
  6. Dostosuj stężenie do 1x10 5-2x105 komórek/ml i hoduj w nawilżanym inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 dni przed użyciem. Utrzymuj kulturę w tym zakresie gęstości nie dłużej niż 3 miesiące, a następnie rozmrozić nową podwielokrotność. Nigdy nie przekraczaj stężenia komórek 1x106 komórek/ml w hodowli.
  7. Do użycia w teście należy dobrze wymieszać kulturę komórkową K562 z pipetą serologiczną o pojemności 10 ml i usunąć podwielokrotność w celu policzenia i oceny żywotności komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym.
    1. Jeśli żywotność jest mniejsza niż 85%, wykonaj następujące kroki usuwania martwych komórek.
      1. W razie potrzeby dodać 15 ml roztworu gradientu gęstości do 50-mililitrowych probówek stożkowych. Zbierz wszystkie komórki z hodowli i powoli nakładaj zawiesinę komórek na roztwór gradientu gęstości, przechylając probówkę.
      2. Wirować przy 650 x g przez 24 minuty z wyłączonym hamulcem. Ostrożnie zebrać warstwę żywych komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą PBS.
      3. Wirować przy 450 x g przez 10 minut z włączonym hamulcem. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki. Policz komórki i sprawdź ich żywotność (jak w ppkt 5.7).
      4. Hodowla w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 dni przed użyciem.
  8. Zebrać 5x105 komórek docelowych K562 i odwirować przy 140 x g przez 7 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 500 μl w pożywce z 1% FBS.

6. Etykietowanie komórek docelowych K562

UWAGA: Upewnij się, że komórki K562 są dobrze zawieszone przed dodaniem roztworu roboczego CFSE.

  1. Odpipetować 500 μl roztworu roboczego CFSE do 500 μl komórek K562 w celu uzyskania końcowego stężenia 0,5 μM. Używając tej samej końcówki o pojemności 1000-1250 μl, natychmiast wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 3-5 razy.
  2. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut w ciemności.
    UWAGA: Ponieważ czas opóźnienia wyrównania temperatury w inkubatorze jest dłuższy w porównaniu z łaźnią wodną, może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji szczególnie dla objętości > 1 ml.
  3. Ugasić reakcję etykietowania za pomocą 10 ml kompletnej pożywki przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować znakowane komórki K562 przy 140 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml kompletnej pożywki.
  5. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i doprowadź stężenie do 1x105 komórek/ml w kompletnym pożywce.
  6. Umieść komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia. Komórki można przechowywać w temperaturze pokojowej do 10 minut lub w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do użycia. Nie przechowywać w lodówce.

7. Poszycie

UWAGA: Jeśli komórki NK są ograniczone, stężenie komórek K562 i NK może być zmniejszone o połowę, tak aby połowa komórek była posiewana w teście. Test daje porównywalne wyniki przy połowie liczby komórek (o ile proporcje są utrzymywane na stałym poziomie).

  1. W przypadku stosowania całkowitych PBMC, należy oznaczyć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, poddaną kulturze tkankowej, dla następujących warunków na studzienkę: (1) Efektor (E): Cel (T) = 50 : 1 + IL-2 - kontrola pozytywna cytotoksyczności komórek NK; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - tylko komórki docelowe - kontrola ujemna dla śmierci K562; (7) E - tylko ogniwa efektorowe; (8) T + Tween - Kontrola pozytywna dla zgonu z powodu K562
  2. W przypadku stosowania oczyszczonych komórek NK należy oznaczyć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, poddaną działaniu kultury tkankowej, dla następujących warunków na basenik: (1) Efektor (E): Cel (T) = 5: 1 + IL-2 - kontrola pozytywna cytotoksyczności komórek NK; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625: 1; (6) T - tylko komórki docelowe - kontrola ujemna dla śmierci K562; (7) E - tylko ogniwa efektorowe; (8) T + Tween - kontrola pozytywna w przypadku zgonu z powodu K562
  3. Dodać 100 μl kompletnej pożywki do warunków 3, 4, 5, 6, 7. Do tego i wszystkich kolejnych kroków (zalecane) należy używać pipety wielokanałowej.
  4. Dodać 100 μl komórek efektorowych (PBMC przy 5x106 komórek/ml lub oczyszczonych komórek NK przy 5x105 komórek/ml) do warunków 1, 2, 3. Dodać ogniwa efektorowe dla warunków 4-7 przez seryjne rozcieńczenie. Nie zmieniaj końcówek z warunku na warunek.
    1. Wymieszaj warunek 3, weź 100 μl i przenieś do warunku 4.
    2. Wymieszać warunek 4, pobrać 100 μl i przenieść do warunku 5.
    3. Wymieszać warunek 5, pobrać 100 μl i przenieść do warunku 7; Warunek 6 nie ma komórek efektorowych.
  5. Dodać 100 μL przygotowanego roztworu roboczego 2x 0,2% Tween do warunku 8 (stężenie końcowe: 0,1% Tween-20); warunek 8 nie posiada komórek efektorowych.
  6. Dodać 30 μl roztworu roboczego IL-2 do warunku 1. IL-2 należy dodać do zawiesiny komórek efektorowych przed dodaniem zawiesiny komórek docelowych (stężenie końcowe: 27 j.m./ml).
  7. Dodaj 100 μl komórek docelowych (oznaczonych komórkami K562 o wymiarach 1x105 komórek/ml) do warunków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. Warunek 7 nie ma komórek docelowych.
  8. Wymieszać wszystkie studzienki pipetą wielokanałową i odwirować płytkę o masie 120 x g przez 2 min.
  9. Inkubować w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Pod koniec inkubacji umieścić płytkę na lodzie i w ciągu 30 minut przystąpić do barwienia żywotności.

8. Barwienie dla rentowności i przejęcia

  1. Przygotować barwienie martwych komórek (patrz tabela materiałów), dodając 3 μl roztworu podstawowego 5 μM do 600 μl PBS.
  2. Dodać 50 μl rozcieńczonego barwienia martwych komórek do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 250 μl i końcowe stężenie 0,005 μM. Dobrze wymieszać pipetą wielokanałową.
  3. Kontynuuj analizę cytometrii przepływowej. Korzystając z cytometru przepływowego, zbierz co najmniej 1000 zdarzeń w bramce komórki docelowej (Rysunek 2), aby uzyskać statystycznie znaczące wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed przystąpieniem do analizy wysoce zaleca się ocenę zawartości komórek NK w wybranej populacji efektorowej. Rycina 1 przedstawia typowe barwienie CD56 przed (jasnoniebieski) i po (czerwony) wzbogaceniu populacji komórek NK. Komórki NK stanowią do 15% PBMC i po wzbogaceniu powinny charakteryzować się czystością na poziomie co najmniej 80%.

Analiza cytometryczna w tym teście obejmuje detekcję dwóc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda stanowi prostą i opłacalną alternatywę dla tradycyjnego testu uwalniania 51Cr w celu oceny aktywności cytotoksycznej komórek NK. Ta metoda jest czuła, powtarzalna i mniej czasochłonna niż poprzednie standardowe metody, takie jak CRA, i może być stosowana zarówno do zastosowań klinicznych, jak i badawczych.

Chociaż test działa zarówno z całkowitymi PBMC, jak i wzbogaconymi komórkami NK, opcja użycia PBMC bez konieczności oczyszczania populacji komórek jest wielką...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Jill Narciso, Centrum Immunogenetyki UCLA, za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x, bez Ca2+ i Mg2+)Corning (Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaOmega ScientificFB-02
Penicylina StreptomycynaLife Technologies15140-163Roztwór podstawowy o stężeniu 10 000 U/ml
IL-2R& D Systems202-IL-050Liofilizowany od 0,2 μ m przefiltrowany roztwór w acetonitrylu i TFA z BSA jako białkiem nośnikowym. Rozpuść w 500 ul przy 100 μ g/ml w sterylnym 100 mM kwasie octowym zawierającym co najmniej 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (2,1x10E6 IU/ml)
Komórki K562ATCCCCL-243Linia komórek rakowych 
Kolby do hodowli komórkowych T-75Zestaw do
CFSELife Technologies (CellTrace)C34554Rozpuścić fiolkę I za pomocą 18 ul DMSO, aby przygotować roztwór podstawowy 5 mM. Nie zamrażać/nie rozmrażać.
Sytox RedLife TechnologiesS34859Roztwór podstawowy jest dostępny pod adresem 5 μ M w 1 ml DMSO. Roztwór DMSO może być poddawany wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania bez degradacji odczynnika.
Probówki do pobierania krwi z heparyną sodowo-litowąBD02-687-95
Płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery UCorningCLS3897
Pipety serologiczneBD Falcon
Probówki okrągłodenne z polistyrenu (5 ml)BD Falcon14959-5
50 ml polipropylenowa rurka stożkowaBD Falcon352070
15 ml polipropylenowa rurka stożkowaBD Falcon352097
Zbiornik odczynnikaUSA Scientific2321-2230
Koktajl wzbogacający ludzkie komórki NKStemCell Technologies (RosetteSep)15065
proliferacji komórek Corning 431464

Bibliografia

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357(2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152(2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578(2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1(2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

Tagi

kom rki Natural Killermononuklearne kom rki krwi obwodowejseparacja w gradiencie g sto ciznakowanie kom rek docelowychstosunek efektor w do kom rek docelowychbarwienie martwych kom rekkom rki docelowe K562

Powiązane artykuły