W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy film przeprowadzi Państwa przez proces generowania kultur neuronów korowych z mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym oraz wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowaniu wapnia i sodu oraz w izolacji białek i/lub RNA. Stanowią one również platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających letalną mutację genu w późnym stadium embrionalnym lub w okresie postnatalnym. Procedura jest stosunkowo prosta, wymaga pewnego doświadczenia w technikach hodowli tkankowych i nie powinna zająć więcej niż od dwóch do trzech godzin przy odpowiednim przygotowaniu. Staranna separacja kory mózgowej od traktu włókien wzgórzowo-korowych pozwoli ograniczyć liczbę niepożądanych komórek nieneuronalnych. Aby zwiększyć wydajność uzyskiwania komórek neuronalnych, należy delikatnie utrzeć fragmenty tkanki korowej po etapie inkubacji z enzymem. Jest to niezbędne, aby zapobiec niepotrzebnemu uszkodzeniu komórek i przedwczesnej śmierci neuronów. Ponieważ kultury te są utrzymywane bez dodatku komórek zasilających (feeder cells) z gleju, oferują one dodatkową zaletę w postaci wzrostu kultur wzbogaconych w neurony.
Protokół
Przygotowania przed dniem hodowli:
- Przygotować sterylny roztwór do sekcji (DS).
- Przygotować NBM/B27 (pożywkę Neurobasal z dodatkami B27).
- Autoklawować ddH2O i wysterylizować szkiełka podstawowe, jeśli jest to konieczne.
- Pokryć naczynia do hodowli tkankowej lub szkiełka podstawowe poli-D-lizyną.
Powlekanie poli-D-lizyną:
Przygotować dzień przed hodowlą w warunkach sterylnych.
- Odmrozić alikwot 10X PDL i umieścić na lodzie.
- Do 1 ml PDL dodać 9 ml sterylnej wody ultrafiltrowanej i dokładnie wymieszać (1X).
- Powierzchnie pokryć 1X PDL pr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5-fluoro-2’-deoksyurydyna | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Vibraslicer | Campden Instruments | ||
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | S0876 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D (+)-glukoza | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Poli-D-lizyna | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Suplement B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pożywka Neurobasal (NBM) | Invitrogen | 21103-049 | |
| Kwas 2-amino-5-fosfonopentanowy | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Albumin wołowa | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Inhibitor trypsyny | Sigma-Aldrich | T9253 | |
| Wodorotlenek sodu, roztwór 1N | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| L-cysteina | Sigma-Aldrich | C7755 | |
| Bacto Agar | Difco Laboratories | 0140-01 | |
| Papaina | Worthington Biochemical | LS 03126 | |
| Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm | Fisher Scientific | DDA02025S0 | |
| Szklane laminki, nr 1, 12 mm | Bellco Glass | 1943-00012 | |
| Minimalna pożywka niezbędna (MEM) | Invitrogen | 11090-081 | z solami Earle’a, bez L-glutaminy, wymagana do hodowli kultur nieneuronalnych |
| Penicylina/streptomycyna | Invitrogen | 15070-063 | do kultur nieneuronalnych |
| Płodowa surowica wołowa | Invitrogen | 16140-071 | wymagana do kultur nieneuronalnych |
| Butelka do hodowli tkankowej Nunclon "Triple Flask" | Fisher Scientific | 12-565-25 | Stosowana do kultur nieneuronalnych. Butelki te są bardzo wygodne przy przygotowywaniu "kondycjonowanej pożywki Neurobasal/B27", jednak można użyć dowolnych innych butelek lub naczyń do hodowli tkankowej. |
| Szklane naczynia "do obrazowania" | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Naczynia hodowlane o średnicy 35 mm ze szklanym dnem, idealne do obrazowania wapnia lub sodu przy użyciu odwróconego układu obrazowania. Jednakże są kosztowne! |
Przedruki i uprawnienia
