Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Podsumowanie

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.

Streszczenie

Niniejszy film przeprowadzi Państwa przez proces generowania kultur neuronów korowych z mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym oraz wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowaniu wapnia i sodu oraz w izolacji białek i/lub RNA. Stanowią one również platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających letalną mutację genu w późnym stadium embrionalnym lub w okresie postnatalnym. Procedura jest stosunkowo prosta, wymaga pewnego doświadczenia w technikach hodowli tkankowych i nie powinna zająć więcej niż od dwóch do trzech godzin przy odpowiednim przygotowaniu. Staranna separacja kory mózgowej od traktu włókien wzgórzowo-korowych pozwoli ograniczyć liczbę niepożądanych komórek nieneuronalnych. Aby zwiększyć wydajność uzyskiwania komórek neuronalnych, należy delikatnie utrzeć fragmenty tkanki korowej po etapie inkubacji z enzymem. Jest to niezbędne, aby zapobiec niepotrzebnemu uszkodzeniu komórek i przedwczesnej śmierci neuronów. Ponieważ kultury te są utrzymywane bez dodatku komórek zasilających (feeder cells) z gleju, oferują one dodatkową zaletę w postaci wzrostu kultur wzbogaconych w neurony.

Protokół

Przygotowania przed dniem hodowli:

• Przygotować sterylny roztwór do sekcji (DS).
• Przygotować NBM/B27 (pożywkę Neurobasal z dodatkami B27).
• Autoklawować ddH₂O i wysterylizować szkiełka podstawowe, jeśli jest to konieczne.
• Pokryć naczynia do hodowli tkankowej lub szkiełka podstawowe poli-D-lizyną.

Powlekanie poli-D-lizyną:

Przygotować dzień przed hodowlą w warunkach sterylnych.

• Odmrozić alikwot 10X PDL i umieścić na lodzie.
• Do 1 ml PDL dodać 9 ml sterylnej wody ultrafiltrowanej i dokładnie wymieszać (1X).
• Powierzchnie pokryć 1X PDL przez noc w temperaturze pokojowej w następujący sposób:
  • szklane szkiełka nakrywkowe (Bellco Glass, Inc. Kat. nr 1943-00012): 75 µl/szkiełko
     LUB
  • płytka hodowlana 24-dołkowa: 300 µl/dołek
     LUB
  • szalka hodowlana 35 mm: 1 ml/szalka
• Przepłukać 5 razy sterylną wodą (do odsysania cieczy użyć sterylnych pipet Pasteura).
• Usunąć wodę, aż powierzchnia będzie całkowicie sucha.

Procedura hodowli (wykonywana w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych)

1. Wytnij blok agaru i przyklej go do bloku podporowego mikrotomu Vibraslicer (Campden Instruments Ltd.) za pomocą superglue.
2. W przypadku użycia płodów myszy z późnego etapu embrionalnego (E17-18), uśmierć samicę, usuń macicę i wyjmij poszczególne płody z worków płodowych. Umieść płody w sterylnej szalce Petriego i kontynuuj zgodnie z opisem poniżej.
3. Wykonaj dekapitację płodu lub szczenięcia myszy (zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez lokalną komisję ds. etyki doświadczeń na zwierzętach).
4. Usuń skórę oraz czaszkę i umieść mózg na dysku z papieru filtrującego Whatman w 60-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej zimnym DS.
5. Odetnij móżdżek za pomocą sterylnego ostrza do golenia.
6. Podnieś mózg za pomocą szpatułki i odsącz nadmiar płynu na papierze filtrującym, a następnie przenieś mózg na blok podporowy Vibraslicer i przyklej go (stroną ogonową do góry, a częścią brzuszną skierowaną w stronę agaru).
7. Wypełnij komorę zimnym DS. Ustaw przełącznik prędkości na 8-9.
8. Wycinaj sekcje o grubości 200-400 µm, zaczynając od opuszki węchowej. Gdy ostrze Vibraslicera wejdzie w korę, zacznij wycinać koronalne sekcje o grubości 600µm. Mózg myszy E17-18 zazwyczaj daje 3-4 użyteczne plastry, natomiast mózg myszy P0 daje 4-5 użytecznych plastrów.
9. Przenieś plastry mózgu do 35-milimetrowej szalki Petriego oznaczonej jako DS 2, używając odwrotnego końca niepodłączonej szklanej pipety Pasteura o pojemności 10 ml.
10. Wypreparuj korę i usuń opony mózgowe za pomocą szklanych igieł wykonanych z rurek kapilarnych.
11. Pokrój fragmenty kory na małe kawałki o długości 0,5-1 mm.
12. Przefiltruj ES przez filtr 0,2 µm przymocowany do strzykawki 5 cc do 35-milimetrowej szalki Petriego.
13. Przenieś fragmenty tkanki korowej do szalki Petriego zawierającej przefiltrowany ES.
14. Inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 min.

W międzyczasie:

1. Wyczyścić dygestorium, Vibraslicer oraz narzędzia do sekcji.
2. Dodać 5 ml ciepłego pożywki NBM/B27 do szalki Petriego o średnicy 60 mm.

Po 30 min. inkubacji:

1. Przenieś tkankę do 10 ml DS. Pozostaw do osiadania przez 1 min.
2. Przenieś tkankę do pierwszej probówki Hi, wymieszaj ruchem wirowym i pozostaw do osiadania przez 2-3 min.
3. Przenieś do drugiej probówki Hi. Powtórz czynności opisane powyżej.
4. Przenieś do pierwszej probówki Li. Powtórz czynności opisane powyżej.
5. Przenieś do drugiej probówki Li. Powtórz czynności opisane powyżej.
6. Przenieś do trzeciej probówki Li. Powtórz czynności opisane powyżej.
7. Przenieś tkankę do szalki 60 mm z medium.

Pod mikroskopem stereoskopowym:

1. Oczyścić tkankę z zanieczyszczeń i utrzeć każdy fragment, delikatnie przepuszczając go przez dociąganą pipetę szklaną (stosując coraz mniejsze średnice otworu), aby rozluźnić tkankę.
2. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml zawierającej pozostałą część NBM+B27 (przygotować łącznie 13 ml dla płytki 24-dołkowej lub 11 ml dla 5 naczyń hodowlanych 35 mm. Wymieszać delikatnie i odczekać, aż większe fragmenty tkanki opadną na dno).
3. Przenieść zawiesinę komórkową (0,5 ml/dołek dla płytki 24-dołkowej lub 2 ml/naczynie hodowlane 35 mm).
4. W przypadku użycia szklanych lamellek, dodać 80 µl zawiesiny komórkowej na jedną lamelkę i pozostawić na 1 h w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby komórki przylgnęły, przed zalaniem komory dodatkową pożywką NBM/B27.
5. Hodowle utrzymywać w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

Następnego dnia

Płytka 24-dołkowa: Do każdego dołka dodać 0,5 ml pożywki NBM/B27 kondycjonowanej przez komórki nieneuronalne (cNBM/B27; protokół przygotowania pożywki cNBM/B27 znajduje się poniżej)

Szalki 35 mm: zastąpić 0,5 ml pożywką cNBM/B27.

Utrzymuj kulturę, wymieniając 0.5ml pożywki na świeże cNBM/B27 co 2-3 dni.

Choć pożywka nie sprzyja proliferacji komórek glejowych, w razie potrzeby w 3.–5. dniu hodowli można traktować kultury 5µM FDU (5-fluoro-2’-deoksyurydyna, Sigma F0503), aby dodatkowo zredukować liczbę komórek glejowych.

PRZYGOTOWANIE do sekcji i hodowli

Sterylizować narzędzia sekcyjne w 70% EtOH lub poddać je autoklawowaniu:

• Nożyczki (średnie i małe) Szpatułki (średnie i małe)
• Pincety (średnie i małe) Żyletka
• Ostrze do wibrotomu Kąpiel buforowa
• Mały metalowy klin do ostrza Podpora do mózgu

Pozostałe materiały:

• Szalki Petriego (60 mm)
• Szalki Petriego (35 mm)
• Papier filtracyjny
• Pipeta szklana 10 ml
• Sterylne pipety jednorazowe, 5, 10 i 25 ml
• Filtr strzykawkowy, 0.2 µm
• Strzykawka 5 cc
• Probówki do wirowania, 15 ml
• Sterylne szklane pipety Pasteura
• Naczynia hodowlane pokryte PDL lub szklane szkiełka nakrywki

Oznakuj sześć probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i przygotuj je zgodnie z poniższą instrukcją:

Probówka nr 1: Roztwór enzymu:

Dodaj 50 U papainy (Worthington LS 03126) do 5 ml DS zawierającego:

• 100µl L-cysteiny (0,8mg)
• 7 µl 0,1N NaOH
• 50 µl APV (5mM)

Pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej do czasu, aż stanie się przejrzysty. Należy pamiętać, że roztwór enzymu początkowo będzie mętny i musi stać się przejrzysty przed użyciem.

 

Probówki nr 2 i 3: Inhibitor enzymu Hi:

3 ml DS + 300 µl BSA/Ti + 30 µl APV (5mM).

Mieszaj delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, a następnie podziel na dwie alikwoty po 1.5ml.

 

Probówki nr 4 - 6: Niskie stężenie inhibitora enzymu:

8 ml DS + 80 µl BSA/Ti + 80 µl APV (5mM).

Mieszaj delikatnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie podziel na trzy aliquoty po 2,6 ml.

 

Umieść probówki ponumerowane od #2 do #6 w lodzie. Probówkę #1 (roztwór enzymu) pozostaw w temperaturze pokojowej.

ROZTWORY I ALIKWOTY

• Roztwór A (bufor solny) Sigma Formuła waga 500 ml [stęż.]
• Chlorek sodu NaCl S-9625 58,45 80,0g 137mM
• Chlorek potasu KCl P-4504 74,56 4,0g 5,4mM
• Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny Na₂HPO₄ S-0876 142,0 0,24g 0,17mM
• Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny KH₂PO₄ P-5379 136,09 0,3g 0,22mM

Odważyć wszystkie składniki i mieszać do całkowitego rozpuszczenia w 400 ml ultrafiltrowanej wody. Doprowadzić objętość końcową do 500 ml. Przenieść do czystej butelki i autoklawować. Przechowywać w temperaturze 4°C i oznaczyć jako „DS Solution A”.

• Roztwór B (Hepes) Formuła Sigma waga 250 ml [stęż.]
• Hepes Hepes H-3375 283.3 20.97g 9.9mM

Dodać wodę ultrafiltrowaną do objętości 200 ml. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie uzupełnić objętość końcową do 250 ml. Przenieść do czystej butelki i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4°C i oznakować jako „DS Solution B”.

• Roztwór roboczy 500 ml [stęż.]
• Woda ultrafiltrowana 400 ml
• Roztwór stokowy A 25 ml
• Roztwór stokowy B 14 ml
• D (+)-Glucose Sigma G-8270 3.0 g 33.3mM
• Sacharoza Sigma S-0389 7.5 g 43.8 mM

Dostosować pH do 7.4 za pomocą 1N NaOH. Uzupełnić końcową objętość do 500 ml wodą ultrafiltrowaną. Przelać do czystej szklanej butelki i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4°C. Oznakować jako „Roztwór do sekcji”.

Przygotowanie poli-D-lizyny:

1. Przygotować 10-krotny roztwór zapasu poli-D-lizyny (PDL; Sigma P-7280) w sterylnym H₂O o stężeniu 1mg/ml.
2. Przygotować alikwoty po 1,0 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20°C do 3 miesięcy.

POŚRZYWKI

1. Dodać 10ml suplementu B-27 (Gibco 17504-044) do butelki zawierającej 500 ml NBM (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049).
2. Przygotować alikwoty po 40 ml i przechowywać w temperaturze 4°C.

APV

1. Do fiolki zawierającej 10 mg APV (kwas 2-amino-5-fosfonopentanowy, Sigma A-5282) dodać 10 ml sterylnej H₂O i dokładnie wymieszać.
2. Przygotować aliquoty o objętości 180 µl i przechowywać w temperaturze -20°C.

BSA/Ti

1. Rozpuścić 1 g BSA (albuminy wołowej, Sigma A-7030) oraz 1 g inhibitora trypsyny (Sigma T-9253) w 10 ml DS.
2. Dostosować pH do wartości 7.4 za pomocą 1N NaOH.
3. Zsterylizować, filtrując przez filtr strzykawkowy 0.2 µm.
4. Podzielić na aliquoty po 400 µl i przechowywać w temperaturze -20°C.

L-CYSTEINA

W probówce Eppendorfa rozpuścić 0,6 mg L-Cysteine (Sigma C-7755) w 200 µl DS.

AGAR (4%)

1. Rozpuścić 4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) w 100 ml sterylnej wody. Przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia do hodowli.
2. Podgrzać agar w kuchence mikrofalowej do stopienia, a następnie przelać do 35 mm szalki Petriego. Pozostawić do ostygnięcia i spolimeryzowania.

PAPAINA (Worthington LS 03126)

KULTURY NIE-NEURONALNE W BUTELKACH HODOWLANYCH NUNC

POKRYWANIE BUTELEK KULTUROWYCH (4 butelki Nunc)

1. Do każdej z 3 probówek zawierających 10X PDL dodać 9 mL sterylnej wody, aby przygotować 1X PDL.
2. Przenieść 30 ml 1X PDL do pierwszej butelki.
3. Delikatnie poruszać naczyniem, aż wszystkie powierzchnie wzrostu zostaną pokryte. Pozostawić na 1 min.
4. Przenieść 1X PDL do drugiej butelki. Pozostawić na 1 min.
5. Powtórzyć czynność z trzecią i czwartą butelką.
6. Wypłukać wszystkie cztery butelki 2 razy, używając 150 ml sterylnej H₂O.

PRZYGOTOWANIE ROZTWORU ENZYMU (ES):

1. W probówce wirówkowej o pojemności 0,6 ml odważyć 0,8 mg L-Cysteine (Sigma C7755), dodać 150ml DS i mieszać w wortexie aż do rozpuszczenia kryształów.
2. Przenieść 5 ml DS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodać 150ml L-Cysteine.
3. Dodać 50 jednostek Papain (Worthington LS 03126).
4. Dodać 7ml 0,1N NaOH.

PRZYGOTOWAĆ MEM (GIBCO # 11090-081)

1. Odbierz 65 ml z butelki 500 ml MEM. Odstaw 10 ml do przygotowania glukozy.
2. Dodaj 5 ml Pen/Strep (Gibco #15070-063).
3. Dodaj 10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1.8 g/ 10 ml MEM)
4. Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (Gibco # 16140-071) lub surowicy z cieląt (Omega BC-04).
5. Dokładnie wymieszaj, podziel na alikwoty i przechowuj w temperaturze 4°C.

PODŁOŻE NEUROBASAL/SUPLEMENT B-27 (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco #21103-049); B-27 (50X), 10 ml (Gibco #17504-044)

1. Przenieś całą zawartość ampułki z B-27 do butelki z NBM i wymieszaj.
2. Rozdziel na alikwoty i przechowuj w temperaturze 4°C.

DYSEKCJA TKANKI MÓZGOWEJ

1. Osuszyć narzędzia sekcyjne z 70% EtOH przed przystąpieniem do sekcji.
2. Przenieść 10 ml DS do każdej z probówek o pojemności 3-15 ml.
3. Wybrać szczenięta myszy (P0 – P3); do 4 butelek potrzebne będą trzy mózgi.
4. Dodać zimny DS do szalki Petriego o średnicy 35 mm.
5. Dokonać dekapitacji szczenięcia myszy i wypreparować mózgi.
6. Umieścić mózgi w szalce Petriego zawierającej zimny DS.
7. Posiekać tkankę na kawałki wystarczająco małe, aby mogły przejść przez szklaną pipetę.

DYSOCJACJA ENZYMÓW

1. Za pomocą pipety Pasteura usunąć z szalki jak najwięcej DS.
2. Przefiltrować ES przez filtr 0,2 µm i strzykawkę 5 cc.
3. Przenieść ES do szalki z tkanką.
4. Inkubować tkankę w inkubatorze w temperaturze 37°C (bez CO₂) przez 30 min.

PRANIE TKANKI

1. Przenieś tkankę za pomocą pipety szklanej do pierwszej probówki z DS, dbając o to, aby pobrać jak najmniej ES.
2. Wiruj przez 30 sec przy 1500 rpm.
3. Przenieś tkankę i powtórz procedurę jeszcze dwa razy.

TRYTURACJA

1. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml nalać 38 ml MEM/FBS
2. Do szalki 35 mm dodać 3 ml MEM/FBS i przenieść do niej tkankę.
3. Rozdzielić tkankę poprzez delikatne triturowanie jej za pomocą końcówki do pipety eppendorfa o pojemności 1000µl.
4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki zawierającej 38 ml MEM/FBS i dokładnie wymieszać.

WYSIEWANIE

1. Ustaw butelki hodowlane pionowo, aby uzyskać równe ilości zawiesiny komórkowej i pożywki w każdej butelce.
2. Wlej 90 ml MEM/FBS do każdej butelki hodowlanej.
3. Dodaj 10 ml zawiesiny komórkowej do każdej butelki.
4. Oznacz: Non-Neuronal, inicjały i data. Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

KARMIENIE

1. W 3. lub 4. dniu zasil komórki ciepłym MEM/FBS (odlej całą pożywkę i zastąp ją 100 ml MEM/FBS). Hodowle mogą potrzebować od 7 do 10 dni, aby osiągnąć konfluencję.
2. W 7.–10. dniu wymień pożywkę na NBM/B27.
3. Następnego dnia zbierz pożywkę. Przefiltruj ją przez filtr 0.22µm.
4. Przygotuj aliquoty po 40 ml i zasil hodowlę MEM/FBS.
5. Przez kolejne 2 lub 3 dni wymieniaj pożywkę na NBM/B27.
6. Następnego dnia zbierz pożywkę i powtórz procedurę.
7. Zbieraj pożywkę przez około 2 tygodnie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-fluoro-2’-deoksyurydyna	Sigma-Aldrich	F0503
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P4504
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	S0876
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	P7280
Suplement B27	Invitrogen	17504-044
Pożywka Neurobasal (NBM)	Invitrogen	21103-049
Kwas 2-amino-5-fosfonopentanowy	Sigma-Aldrich	A5282
Albumin wołowa	Sigma-Aldrich	A7030
Inhibitor trypsyny	Sigma-Aldrich	T9253
Wodorotlenek sodu, roztwór 1N	Fisher Scientific	SS266-1
L-cysteina	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papaina	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm	Fisher Scientific	DDA02025S0
Szklane laminki, nr 1, 12 mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimalna pożywka niezbędna (MEM)	Invitrogen	11090-081	z solami Earle’a, bez L-glutaminy, wymagana do hodowli kultur nieneuronalnych
Penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15070-063	do kultur nieneuronalnych
Płodowa surowica wołowa	Invitrogen	16140-071	wymagana do kultur nieneuronalnych
Butelka do hodowli tkankowej Nunclon "Triple Flask"	Fisher Scientific	12-565-25	Stosowana do kultur nieneuronalnych. Butelki te są bardzo wygodne przy przygotowywaniu "kondycjonowanej pożywki Neurobasal/B27", jednak można użyć dowolnych innych butelek lub naczyń do hodowli tkankowej.
Szklane naczynia "do obrazowania"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Naczynia hodowlane o średnicy 35 mm ze szklanym dnem, idealne do obrazowania wapnia lub sodu przy użyciu odwróconego układu obrazowania. Jednakże są kosztowne!