Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56200

⸱

1 września 2017

 , 
1Department of Craniofacial Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Streszczenie

Fenotypy mutantów danio pręgowanego są często nie w pełni penetrujące, przejawiają się tylko u niektórych mutantów. Interesujące fenotypy, które pojawiają się niespójnie, mogą być trudne do zbadania i mogą prowadzić do mylących wyników. Opisany tutaj protokół jest prostym paradygmatem hodowlanym mającym na celu zwiększenie i zmniejszenie penetracji śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego. Ponieważ śmiertelne mutanty nie mogą być selektywnie hodowane bezpośrednio, stosuje się klasyczną strategię hodowli selektywnej polegającą na testowaniu potomstwa. Metoda ta obejmuje również protokoły genotypowania genotypowania genengura i barwienia larw danio pręgowanego swoistego dla alleli (KASP) oraz barwienia larw chrząstki i kości danio pręgowanego. Zastosowanie opisanej tutaj strategii hodowlanej może zwiększyć penetrację interesującego fenotypu szkieletu, umożliwiając uzyskanie bardziej powtarzalnych wyników w dalszych zastosowaniach. Ponadto, zmniejszenie penetracji mutantów poprzez tę selektywną strategię hodowli może ujawnić procesy rozwojowe, które co najważniejsze wymagają funkcji zmutowanego genu. Chociaż szkielet jest tutaj szczegółowo rozważony, sugerujemy, że ta metodologia będzie przydatna dla wszystkich linii mutantów danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Danio pręgowany to potężny system modelowy do zrozumienia rozwoju szkieletu. W przypadku zmutowanych szczepów danio pręgowanego biolodzy mogą rozszyfrować funkcję genów podczas skeletogenezy. Jednak zmutowane fenotypy szkieletu danio pręgowanego mogą charakteryzować się zmienną penetracją1,2,3,4, co może utrudniać analizy rozwojowe i genetyczne. Cel tej metody jest trojaki. Po pierwsze, generowanie linii mutantów danio pręgowanego, które konsekwentnie wytwarzają ciężkie fenotypy, umożliwia dalsze badania rozwojowe, takie jak nagrywanie poklatkowe5 i transplantation6. Tego rodzaju badania mogą zostać sparaliżowane przez próby badania fenotypów, które manifestują się tylko niespójnie. Po drugie, chów wsobny odmian danio pręgowanego może zmniejszyć zmienność tła genetycznego, promując w ten sposób spójność i odtwarzalność eksperymentalną. Na przykład przeprowadzenie wszystkich analiz hybrydyzacji in situ na jednym selektywnie wsobnym szczepie może zmniejszyć mylącą zmienność i wzmocnić wnioski. Po trzecie, wygenerowanie ciężkich i łagodnych szczepów ujawni całą serię fenotypową, która może wynikać z określonej mutacji.

Na pierwszy rzut oka, selektywna hodowla śmiercionośnych mutantów wydaje się niemożliwa. Jak można rozmnażać się w celu penetracji, gdy zwierzęta, które są oceniane do selekcji, są martwe? Na szczęście metody selektywnej hodowli przez dobór rodzinny, w szczególności badanie potomstwa, od wielu lat wykazują skuteczność w programach hodowli zwierząt gospodarskich7,8. Programy te są stosowane głównie do selektywnej hodowli cech, które są obecne tylko u jednej płci, takich jak produkcja mleka u krów lub produkcja jaj u kur. Samce tych gatunków nie mogą być oceniane bezpośrednio, ale ich potomstwo jest oceniane, a następnie przypisuje się wartość rodzicom. Zapożyczając z tej strategii, przedstawiony tutaj protokół polega na ocenie utrwalonego i wybarwionego zmutowanego potomstwa z pary danio pręgowanego, które są heterozygotyczne pod względem zmutowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Penetracja fenotypu u homozygotycznego letalnego zmutowanego potomstwa jest przypisywana rodzicom przy podejmowaniu decyzji, które osobniki wydadzą następne pokolenie w linii. Odkryliśmy, że ta metoda jest skutecznym sposobem na zmianę penetracji u letalnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego1.

Podobnie jak w innych badaniach, ten protokół selektywnej hodowli bierze pod uwagę takie kryteria jak rozmiar lęgu, przeżywalność potomstwa, prawidłowy rozwój zarodków i stosunek płci9. Jednak wszystkie te czynniki są rozpatrywane w kontekście tła mutantów w celu przesunięcia penetracji mutantów. W związku z tym protokół ten rozszerza poprzednie paradygmaty hodowli selektywnej, oferując metodę wzmacniającą analizy rozwojowe mutantów, a także zwiększającą jednorodność tła.

Ten protokół wymaga obszernego genotypowania, dlatego ważne jest, aby zawczasu opracować niezawodny, szybki protokół genotypowania. Dostępnych jest wiele protokołów genotypowania10,11, jednak znajdziemy genotypowanie KASP 12,13,14 jest szybszy, bardziej opłacalny i bardziej niezawodny niż metody oparte na enzymatycznym rozszczepianiu amplifikowanych sekwencji za pomocą enzymu restrykcyjnego10. Dlatego w tej pracy uwzględniamy protokół KASP. Dodatkowo w tym protokole skupiamy się na zmutowanych fenotypach szkieletowych i uwzględniamy procedurę barwienia Alcian Blue/Alizarin Red zmodyfikowaną w stosunku do poprzednich protokołów15.

Opisana tutaj metoda to prosta strategia przesuwania penetracji śmiercionośnych mutantów w górę lub w dół. Chociaż protokół ten koncentruje się na zmutowanych fenotypach szkieletowych, uważamy, że będzie to przydatna strategia do hodowli wszystkich linii zmutowanych danio pręgowanego. W rzeczywistości użyteczność tej strategii hodowlanej prawdopodobnie wykracza poza danio pręgowanego. Przewidujemy, że protokół ten może zostać zmodyfikowany w celu zmiany penetracji w szerokim zakresie organizmów. Zmiana penetracji śmiertelności poprzez testowanie potomstwa może pomóc w przyspieszeniu postępu każdego genetyka rozwojowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie i zgodnie z Komitetami ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Oregonu (IACUC).

1. Przygotowanie niewybranego zapasu początkowego

  1. Zidentyfikuj heterozygotycznych nosicieli interesującego nas zmutowanego allelu za pomocą fin clip11 i genotypowania stada zwierząt o pełnym rodzeństwie za pomocą wybranej metody, takiej jak KASP12,13,14. Protokół ten został przeprowadzony na szczepie zebry mef2cab1086.
  2. Genotypowanie KASP
    UWAGA: Startery specyficzne dla alleli dla KASP są projektowane przez firmę, która dostarcza odczynniki (patrz Tabela materiałów). Aby uzyskać odpowiednie stężenie barwnika 6-karboksylo-X-rodaminy (ROX) dla konkretnej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, odwiedź stronę internetową firmy.
    1. Umieść tkankę ogona danio pręgowanego w 50 μl buforu do lizy (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,3% niejonowy środek powierzchniowo czynny, 0,3% glikol oktylofenylopolietylenowy). Dodać 10 μl 10 mg/ml proteinazy-K do dołka 96-dołkowej płytki PCR i trawić w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez 2 - 5 godzin, a następnie 20 minut etap inaktywacji w temperaturze 94 °C. Po strawieniu produkt lizy przechowywać w lodówce.
      UWAGA: Produkty Lysis można z powodzeniem stosować przez kilka miesięcy po przygotowaniu. Gdy tkankę poddano lizie przy użyciu 50 mM NaOH, reakcje KASP zakończyły się niepowodzeniem. Wyniki te sugerują, że metoda przygotowania genomowego DNA NaOH nie jest kompatybilna z KASP.
    2. Określić ilościowo genomowe DNA za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć matrycę genomowego DNA za pomocą wody klasy biologii molekularnej, tak aby każda reakcja zawierała około 20-30 ng.
      UWAGA: Określ ilościowo 4 lub 5 próbek, połącz je, a następnie przygotuj rozcieńczenia dla wszystkich próbek na podstawie średniej. W przypadku stosowania tego protokołu dla tkanek dorosłego ogona często wystarczające jest rozcieńczenie 1:100. Dokładne określenie ilościowe stężenia DNA nie jest wymagane.
    3. Dodać 0,14 μl mieszanki startera KASP i 5 μl mieszanki głównej KASP na próbkę na lodzie do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszać przed krótkim odwirowaniem w celu zebrania zawartości na dnie probówki.
      UWAGA: Mieszanka główna KASP jest wrażliwa na ciepło i światło, trzymaj bulion na lodzie i unikaj bezpośredniego światła.
    4. Odpipetować 5 μl roztworu startera/mastera do dołków 96-dołkowej płytki optycznej do PCR, odpowiedniej dla używanej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym.
    5. Odmierzyć pipetą 5 μl rozcieńczonych (około 5 - 7 ng/μl) próbek matrycy DNA do każdego dołka i odessać pipetą do wymieszania.
    6. Dodaj 5 μl wody wolnej od nukleaz do 3 studzienek, aby służyły jako kontrole bez matrycy (NTC) i dodaj 5 μl rozcieńczonej potwierdzonej homozygotycznej matrycy DNA typu dzikiego, heterozygotycznego i homozygotycznego do kontroli pozytywnych.
    7. Umieść optycznie przezroczystą folię uszczelniającą na płycie, upewniając się, że folia jest całkowicie uszczelniona w każdym dołku.
    8. Krótko odwirować płytkę o masie 600 x g, aby zebrać zawartość na dnie i usunąć pęcherzyki z mieszanki.
      UWAGA: Trzymaj talerz na lodzie i chroń przed światłem, aż będzie gotowy do kontynuowania.
    9. Użyj programu cyklicznego pokazanego w Tabeli 1, aby przeprowadzić główną reakcję KASP.
    10. Wyświetl wynikowy wykres punktowy utworzony przez komputer analizujący. Udana reakcja pokaże 4 odrębne grupy punktów na wykresie (Rysunek 3): trzy grupy próbek odpowiadające genotypowi i jedno zgrupowanie NTC w pobliżu początku dostawy. Kontrole dodatnie powinny być segregowane z odpowiednim podziałem próbek.
    11. Jeżeli program komputerowy nie rozpoznaje grup działek jako odpowiadających określonym genotypom, mogą być wymagane dodatkowe zestawy cykliczne (tabela 2). Powtarzaj dodatkowy program, aż komputer rozpozna ścisłe grupowanie według genotypu.
    12. Eksportuj wyniki genotypowania do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby ułatwić korzystanie i analizę.
  3. Trzymaj zidentyfikowane heterozygotyczne zwierzęta razem w głównym systemie wodnym.

2. Pierwsza runda punktacji potomstwa

  1. Heterozygoty krzyżowe między rodzeństwem parami
    1. Po tym, jak zwierzęta dojdą do siebie z klipsa płetwy, ustaw krzyżowanie parami. Użyj separatorów, aby upewnić się, że zarodki są synchroniczne16.
    2. Zbierz zarodki i trzymaj pary rodzicielskie w izolacji w klatkach hodowlanych.
    3. Monitoruj odizolowane dorosłe osobniki, aby agresywne ryby mogły zostać oddzielone lub zapewnione im schronienie (dobrze sprawdzają się rozdrobnione sieci na ryby). Ryby powinny być karmione, a ich woda zmieniana zgodnie z wytycznymi IACUC podczas przebywania w wodzie statycznej.
  2. Hodowla zarodków
    1. Etapowanie i hodowla zarodków danio pręgowanego do postaci larw w standardowych warunkach17.
    2. Zbierz fenotypowo dzikie zwierzęta za pomocą szklanej pipety w 5 lub 6 dniu, gdy pęcherz pławny jest napompowany w 75% sprzęgła. Umieść fenotypowe dzikie typy w odchowalni, w którym zapisano, które rodzice je przynieśli.
      Uwaga: W przypadku zmutowanych alleli, które są recesywnie śmiertelne, co jest prawdą w przypadku wielu mutantów szkieletowych, homozygotyczne mutanty nie tworzą pęcherzy pławnych18,19. Dlatego fenotypowe dzikie typy można łatwo odróżnić od ich zmutowanego rodzeństwa na podstawie napompowanych pęcherzy pławnych.
  3. Barwienie chrząstki i kości Alcian Blue/Alizarin Red
    1. Larwy, które nie napełniają pęcherzy pławnych, należy znieczulić za pomocą 0,17 g/l Tricaine-S w pożywce zarodkowej. Zbierz zwierzęta do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze. Dodaj nie więcej niż 100 larw w tubie.
    2. Usuń wodę z zarodków z każdej probówki i umieść zwierzęta w 1 ml 2% paraformaldehydu w 1x PBS na probówkę.
      ostrożność: Wodny roztwór PFA jest łatwopalny i powoduje poważne podrażnienie skóry i oczu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i okulary ochronne, a po użyciu dokładnie umyć ręce.
    3. Kołysz się przez 1 godzinę; dłuższe mocowanie pogarsza barwienie kości. Regularnie sprawdzaj rurki podczas tego i wszystkich kolejnych etapów kołysania, aby upewnić się, że żadne larwy nie przykleiły się do boku lub nie zbiły się w dnie rurki.
    4. Usuń utrwalacz z probówek za pomocą szklanej pipety, dodaj 1 ml 50% etanolu i kołysz przez 10 minut.
    5. Przygotować świeży roztwór barwiący, dodając 20 μl 0,5% czerwieni alizarynowej na 1 ml premiksu Alcian (0,04% błękitu alckiego/10 mM MgCl2/80% etanolu). Usuń 50% etanolu, dodaj 1 ml roztworu barwiącego do każdej probówki i kołysz się przez noc. Larwy mogą pozostawać w plamie do 5 dni.
    6. Usuń roztwór plamy z probówek i dodaj 1 ml 80% roztworu etanolu/10 mM MgCl2 do każdej probówki. Kołysz rurkami przez co najmniej 1 godzinę; spłukiwanie przez noc może spowodować wyraźniejszą plamę Alcian Blue.
    7. Usunąć 80% roztwór etanolu/10 mM MgCl2 z probówek i dodać 1 ml 50% etanolu; miażdżyć przez 5 minut.
    8. Usuń 50% roztwór etanolu z probówek i dodaj 1 ml 25% etanolu i kołysz przez 5 minut.
    9. Usuń 50% roztwór etanolu z probówek i dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielającego 3% H2O2/0,5% KOH. Pozostaw nakrętki otwarte i pozostaw probówki w stojaku na mikroprobówki na około 10 minut lub do momentu, gdy w górnej części roztworu będzie widoczne delikatne brązowe zabarwienie.
      UWAGA: Na wierzchu roztworu tworzy się warstwa bąbelków. Na tym etapie wymagane jest ostrożne wyczucie czasu, ponieważ nadmierne wybielanie spowoduje słabą podwójną plamę.
    10. Usuń roztwór wybielający i dodaj 1 ml 25% glicerolu/0,1% KOH; kołysz przez 10 minut do 1 godziny.
    11. Usuń 25% roztworu glicerolu/0,1% KOH z probówek, dodaj 1 ml 50% roztworu glicerolu/0,1% KOH do każdej probówki, kołysz przez 10 minut do nocy.
    12. Usuń 50% roztworu glicerolu/0,1% KOH z probówek i ponownie dodaj 50% roztworu glicerolu/0,1% KOH do każdej probówki. Kołysanie przez noc pomoże usunąć pęcherzyki powietrza, które mogą gromadzić się wewnątrz larw. Barwione preparaty kostne przechowywać w temperaturze 4 °C, gdy nie są używane.
  4. Ocena fenotypu
    1. Oceń barwione zmutowane potomstwo pod kątem penetracji wybranego fenotypu. W Nichols i wsp.1 mutantów zostało ocenionych za każde wystąpienie kości ektopowej.
      Uwaga: Ponieważ rodzice danio pręgowanego znajdują się w statycznej wodzie, a czerwona plama Alizarin może z czasem blaknąć, ważne jest, aby naciąć szkielety w ciągu kilku dni od zakończenia przygotowania szkieletu.
    2. Penetracja to proporcja genotypu, która ma fenotyp. Oblicz procentową penetrację według następującego wzoru:
      % penetracji = (mutanty z fenotypem)/(całkowita liczba mutantów) × 100

3. Wybór rodziny

  1. Wybierz dwie rodziny o wysokiej penetracji i dwie rodziny o niskiej penetracji dla następnej generacji. Oprócz penetracji ważne jest, aby wziąć pod uwagę płodność i wigor przy wyborze rodzin do rozmnażania; zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na ten temat.
  2. Nadaj każdej parze rodzicielskiej identyfikator zapasów podrzędnych: rodzina .01, .02 itd.
  3. Trzymanie w domu par rodzicielskich w głównym systemie z kilkoma rybami "towarzyszącymi" płci mieszanej. Rybą towarzyszącą może być dowolna linia danio pręgowanego z trwałymi, oczywistymi cechami wyróżniającymi, takimi jak zmieniona pigmentacja lub struktura płetw.
    UWAGA: Podczas gdy wielu badaczy z powodzeniem utrzymuje w zbiorniku tylko pary lęgowe, korzystne wyniki obserwuje się po trzymaniu par z kilkoma rybami towarzyszącymi. Ten opcjonalny krok pozwala na trzymanie par hodowlanych zwierząt w większych ławicach i łatwe odzyskiwanie, dzięki czemu można je wielokrotnie krzyżować w razie potrzeby. Pary rodzicielskie mogą być wielokrotnie krzyżowane, aby wygenerować duże rodziny z pełnym rodzeństwem; Odczekaj co najmniej tydzień przed ponownym krzyżowaniem tej samej pary rodzicielskiej.
  4. Należy usunąć rodziny larw z kroku 2.2.2, które nie zostały wybrane do następnego pokolenia.
  5. Oznacz zbiorniki zawierające larwy rodzeństwa typu dzikiego z wybranych rodzin penetracją ich zmutowanego rodzeństwa i wychowuj do dorosłości w normalny sposób.
  6. Następne pokolenie będzie miało co najmniej cztery rodziny z pełnym rodzeństwem, dwie dla linii wznoszącej i dwie dla linii spadkowej.
  7. Gdy larwy osiągną dojrzałość płciową, powtórz protokół, zaczynając od kroku pierwszego z nowym pokoleniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje długoterminową technikę hodowli, która jest przydatna w badaniu mutantów szkieletowych rybek danio pręgowanych (Rycina 1). Dobór selekcyjny oparty na testowaniu potomstwa powinien doprowadzić w ciągu kilku pokoleń do przesunięcia ogólnej penetracji zarówno w dół, jak i w górę (Rycina 2). W naszej poprzedniej pracy dwie rundy doboru selekcyjnego obniżyły średnią penetrację z 17% do 3%1<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hodowla selektywna odsłania subtelności funkcji genów

Zmiana zmutowanych fenotypów tak, aby były mniej lub bardziej dotkliwe poprzez selektywną hodowlę, jest prostym sposobem na uzyskanie nowego wglądu w funkcję genów. W porównaniu ze standardowymi metodami hodowli niewyselekcjonowanej, przedstawiony tutaj protokół może zapewnić znacznie pełniejsze zrozumienie zmutowanych fenotypów. W szczególności, generując szczepy, które są ciężkie, można ujawnić pełen zakres zmutowanych fe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Chuckowi Kimmelowi za wskazówki, Johnowi Dowdowi za pomoc w opracowaniu tej strategii hodowlanej, Macie Walker za jej pracę nad doskonaleniem plam szkieletowych, oraz Charline Walker i Bonnie Ullmann za pomocne rady. Prace te były wspierane przez K99/R00 DE024190 do JTN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Paraformaldehyd, granulowany, stałyTed Pella Co.18501Granulowany PFA jest bezpieczniejszą alternatywą dla sproszkowanego
chlorku magnezu PFA, stałegoAcros Organics223210010
10x PBS, AwaterousFisherBP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solidAnatech Ltd.867Musi pochodzić z Anatech
Alizarin Red, solidSigmaA5533-25G
Glicerol, płynnyFisherBP229 1
Nadtlenek wodoru, płynnyFisherBP263500
Wodorotlenek potasu,  solidnyFisherP250 500
StepOnePlus Maszyna do PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym (0,1 ml)Applied Biosystems4346906
Uszczelka Microseal 'B'BioRadMSB1001
KASP Master Mix, High ROXLGCKBS-1016-022https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer MixLGCKBS-2100-100
Tris HCl, ciało stałeFisherBP153 500
chlorek potasu, ciało stałeFisherBP366 500
Tween-20, płynFisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
Trikaina-SWestern Chemicals
Proteinaza KFisherBP1700 100
Termocykler T100Pipety Pasteura z
BioRad Fisher13-678-30
NanodropThermoFisherdo oznaczania ilościowego DNA
kontrolowanym spadkiem 1861096

Bibliografia

  1. Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
  2. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
  3. Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).
  4. DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
  5. McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  6. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
  7. Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
  8. Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
  9. Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
  10. Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
  11. Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).
  12. He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
  13. Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
  14. Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
  15. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
  16. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  18. Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
  19. McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
  20. Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
  21. Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
  22. McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39(2015).
  25. Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).
  26. Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
  27. Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Penetracja mutacji u danio pr gowanegostrategia testowania potomstwaprotok genotypowania KASPbarwienie czerwieni Alcianletalne mutanty szkieletowemetoda selektywnej hodowlianaliza chrz stki i ko cizrozumienie serii fenotypowychszczepy o wysokiej i niskiej penetracjiutrzymanie linii danio pr gowanego
Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.