Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56212

⸱

22 sierpnia 2017

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę bezpośredniego pomiaru poziomów ładowania transferowego RNA z oczyszczonego RNA Escherichia coli, a także sposób porównywania względnych poziomów transferowego RNA, lub dowolnego innego krótkiego RNA, w różnych próbkach na podstawie dodania komórek impulsowych wyrażających gen odniesienia.

Streszczenie

Transfer RNA (tRNA) jest istotną częścią maszynerii translacyjnej w każdym organizmie. tRNA wiążą i przenoszą aminokwasy do translującego rybosomu. Względne poziomy różnych tRNA oraz stosunek aminoacylowanego tRNA do całkowitego tRNA, znany jako poziom ładowania, są ważnymi czynnikami określającymi dokładność i szybkość translacji. Dlatego obfitość i poziomy naładowania tRNA są ważnymi zmiennymi do pomiaru podczas badania syntezy białek, na przykład w różnych warunkach stresowych. W tym miejscu opisujemy metodę zbierania tRNA i bezpośredniego pomiaru zarówno względnej obfitości, jak i bezwzględnego poziomu naładowania określonych gatunków tRNA w Escherichia coli. tRNA jest zbierane w taki sposób, aby zachować labilne wiązanie między tRNA a jego aminokwasem. RNA jest następnie poddawane elektroforezie żelowej i Northern blot, w wyniku czego dochodzi do oddzielenia naładowanych i nienaładowanych tRNA. Poziomy specyficznych tRNA w różnych próbkach można porównać dzięki dodaniu komórek kolców w celu normalizacji. Przed oczyszczeniem RNA do każdej próbki dodajemy 5% komórek E. coli, które nadprodukują rzadkie tRNAselC. Ilość interesujących gatunków tRNA w próbce jest następnie normalizowana do ilości tRNAselC w tej samej próbce. Dodanie komórek z kolcami przed oczyszczeniem RNA ma tę przewagę nad dodawaniem oczyszczonych kolców RNA, że uwzględnia również wszelkie różnice w wydajności lizy komórek między próbkami.

Wprowadzenie

Poniżej przedstawiamy metodę ilościowego określania konkretnych tRNA i mierzenia ich poziomu naładowania za pomocą Northern blot. Metoda opiera się na technice opracowanej po raz pierwszy przez Varshneya i wsp.1. Poprzez pobieranie komórek do kwasu trichlorooctowego (TCA) i utrzymywanie próbek w temperaturze 0 °C przez cały czas oczyszczania RNA, wiązanie estrowe między tRNA a aminokwasem jest zachowane2,3,4. Aminoacylowane tRNA można odróżnić od ich nieacylowanych odpowiedników za pomocą elektroforezy żelowej i Northern blot, ze względu na zmniejszoną ruchliwość aminoacylowanego tRNA w żelu, spowodowaną kowalencyjnie związanym aminokwasem5. Dodatkowo przedstawiamy protokół normalizacji ilości tRNA poprzez dodanie komórek kolców powodujących nadekspresję rzadko używanegoselC tRNA 4.

tRNA są jednymi z najliczniejszych cząsteczek w komórce bakteryjnej i absolutnie istotną częścią maszynerii translacyjnej. tRNA wiążą aminokwasy i przenoszą je do translujących rybosomów. Wiązanie aminokwasów z tRNA (aminoacylacja lub ładowanie) jest ułatwione przez syntetazy aminoacylo-tRNA. Względna obfitość różnych naładowanych tRNA jest ważna dla zapewnienia wierności syntezy białek, ponieważ niedostateczna reprezentacja pokrewnego naładowanego tRNA dla danego kodonu informacyjnego RNA (mRNA) zwiększa prawdopodobieństwo, że prawie pokrewne tRNA błędnie dostarczy swój aminokwas do rosnącego łańcucha polipeptydowego na rybosomie6. Znaczenie naładowanego tRNA znajduje odzwierciedlenie w rozległej odpowiedzi komórki E. coli na poważny spadek poziomu ładunku tRNA; rygorystycznej reakcji. Podczas rygorystycznej odpowiedzi synteza tRNA, rybosomalnych RNA i większości mRNA jest obniżona na rzecz transkrypcji specyficznych mRNA związanych z biosyntezą aminokwasów i przetrwaniem stresu, a tempo wzrostu komórek jest dramatycznie obniżone7. Co więcej, ostatnie prace przeprowadzone przez nas i innych wykazały, że E. coli aktywnie degraduje większość swojego tRNA w odpowiedzi na stresy, które ograniczają translację4,8, co sugeruje, że dostosowanie poziomów tRNA może być ważne dla radzenia sobie z takimi stresami. W związku z tym wiarygodne pomiary obfitości tRNA i poziomów ładunku będą ważnym narzędziem do pełnego zrozumienia reakcji bakterii na stres.

E.coli jest powszechnie używana do ekspresji białka rekombinowanego, a ze względu na różnice w użyciu kodonów między gatunkami, często spotykanym problemem jest nieoptymalna ekspresja9. Można to obejść poprzez ekspresję dodatkowych tRNA potrzebnych do translacji rekombinowanego mRNA10. Pomiary poziomów ładowania tRNA w takich szczepach mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów i pomóc w optymalizacji ekspresji białek.

Ta metoda umożliwia również wykrycie "nieprawidłowego ładowania"; cząsteczki tRNA aminoacylowanej przez niepokrewny aminokwas. Aminoacylacja przez różne aminokwasy może powodować migrację tRNA z nieco innymi prędkościami przez żele poliakrylamidowe1,11. W niektórych przypadkach metoda ta może być również wykorzystana do rozróżnienia różnych wzorców modyfikacji na identycznych tRNAs3.

Inną uznaną procedurą biochemiczną do badania poziomów ładowania tRNA jest okresowe utlenianie. Metoda opiera się na obserwacji, że aminoacylowane tRNA jest chronione przed utlenianiem periodycznym, a nienaładowane tRNA nie. Po okresowym utlenianiu dodaje się ponowne ładowanie tRNA w celu oszacowania poziomów naładowania zebranego RNA. Wykazano jednak, że leczenie ma wpływ na ładowanie kilku tRNA, co powoduje pewne niedokładności12. Przedstawiona tutaj metoda mierzy ładowanie bezpośrednio z oczyszczonego RNA, wykluczając w ten sposób wszelkie odchylenia wynikające z reakcji chemicznych lub enzymatycznych. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że w danym momencie wykrywany jest tylko jeden gatunek tRNA, więc chociaż ten sam Northern blot może być usunięty i ponownie zbadany pod kątem wielu tRNA, zbieranie danych na temat wielu tRNA jest czasochłonne i nieco pracochłonne.

Niezawodny sposób normalizacji próbek względem siebie jest niezbędny w badaniach, których celem jest porównanie względnych poziomów cząsteczki w różnych próbkach. Tutaj wprowadzamy procedurę normalizacji RNA, w której niewielka porcja komórek E. coli z nadekspresją rzadkiego tRNAselC jest dodawana jako impuls do wszystkich próbek eksperymentalnych przed oczyszczaniem RNA. Metoda ta jest przydatna nie tylko przy badaniu tRNA, ale także przy względnym oznaczaniu ilościowym dowolnego gatunku RNA, gdy konfiguracja doświadczalna jest taka, że nie można ufać, że żadne endogenne RNA nie jest obecne w tym samym stężeniu komórkowym we wszystkich próbkach. Na przykład, poziom rybosomalnego RNA podobnego do RNA jest często używany jako endogenne odniesienie do porównywania względnych ilości innego RNA między różnymi próbkami13. Jest to jednak mało przydatne, jeśli stężenie komórkowe referencyjnego RNA różni się między próbkami, jak może to mieć miejsce w przypadku rybosomalnego RNA, jeśli próbkowanie następuje podczas reakcji na stres15,16,17 lub podczas wejścia w fazę stacjonarną17. Dodanie komórek kolczastych do próbek eksperymentalnych przed oczyszczaniem RNA zapewnia solidny i dokładny sposób normalizacji niezależnie od konfiguracji próbkowania. Innym sposobem standaryzacji jest dodanie jednego lub więcej kolców RNA do próbek eksperymentalnych po oczyszczeniu RNA. Jednak metoda ta nie uwzględnia żadnych różnic w odzyskiwaniu RNA między próbkami.

Używanie komórek E. coli, które nadmiernie wyrażają referencyjne RNA jako komórki impulsowe (patrz Rysunek 1) w eksperymencie na E. coli ma tę wadę, że skutkuje dodatkiem niewielkiej ilości egzogennego całkowitego RNA E. coli do próbek. Korygujemy ten dodatek, analizując próbkę zawierającą tylko komórki kolczaste równolegle z próbkami eksperymentalnymi (patrz Northern blot w Rysunek 2, pas oznaczony jako "selC"). Przedstawiony protokół został opracowany dla E. coli K-12, ale prawdopodobnie będzie miał zastosowanie do większości gatunków bakterii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie kultur bakteryjnych.

  1. Wszystkie hodowle należy prowadzić w kolbach Erlenmeyera przy stosunku objętości hodowli do objętości kolby nieprzekraczającym 1/6. W typowym układzie eksperymentalnym hodowle prowadzi się w temperaturze 37.0 °C przy wytrząsaniu z prędkością 160 rpm w minimalnym medium z kwasem morfolinopropanosulfonowym (MOPS)18 uzupełnionym o preferowane źródło węgla, na przykład 0.2% glukozy, przez co najmniej 10 kolejnych generacji przed zbiorem RNA.
  2. Dzień przed zbiorem RNA należy rozcieńczyć przerośniętą hodowlę pożądanego szczepu w minimalnym medium MOPS w taki sposób, aby osiągnęła ona pożądaną wartość OD436 w wyznaczonym czasie następnego dnia. Objętość przerośniętej hodowli do szczepienia należy obliczyć według wzoru:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Tutaj ODnew oznacza pożądaną wartość OD436 po inkubacji, Vnew oznacza objętość rozcieńczonej hodowli, ODold oznacza OD436 przerośniętej hodowli, z której dokonuje się rozcieńczenia, G oznacza liczbę generacji, o które przyrośnie hodowla od momentu rozcieńczenia (t1) do momentu pobrania próbek następnego dnia (t2), co można obliczyć jako: różnicę czasu (w min) między t1 a t2 podzieloną przez czas generacji (w min). Aby zapewnić wzrost w stanie stacjonarnym w momencie pobierania próbek, G powinno być ≥10; Vold oznacza objętość przerośniętej hodowli, którą należy przenieść do świeżego medium. Równanie to jest przybliżeniem, które nie uwzględnia fazy adaptacji (lag phase), zjawiska często obserwowanego po rozcieńczeniu przerośniętej hodowli w świeżych mediach.
    1. Warunki wzrostu będą się różnić w zależności od celu eksperymentu, jednak aby ograniczyć zmienność poziomu tRNA między poszczególnymi komórkami i zwiększyć powtarzalność wyników, (zaleca się) doprowadzenie hodowli do stanu stacjonarnego przed pobraniem próbek19.

2. Przygotowanie komórek kontrolnych (spike-in)

UWAGA: Szczep E. coli MAS1074, który wykazuje ekspresję genu selC kodującego tRNAselC pod kontrolą promotora indukowanego przez izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG), jest wykorzystywany jako szczep do analizy spike-in.

  1. Rozcieńczyć przerośniętą kulturę MAS1074 do OD436 wynoszącej 0,05 w minimalnym medium MOPS uzupełnionym o 100 µg/mL ampicyliny i 0,2% glukozy. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 160 rpm.
    UWAGA: W kwestii zastosowania alternatywnego szczepu referencyjnego należy zapoznać się z sekcją Dyskusja.
  2. Przy OD436 ~0,1 dodać IPTG do stężenia końcowego 1 mM, aby indukować ekspresję tRNAselC. Hodować kulturę do OD436 ~0,5 (ok. 3-4 h wzrostu), a następnie przenieść kolbę z kulturą do kąpieli lodowej. Przechowywać kulturę komórek spike-in na lodzie do czasu zebrania wszystkich próbek do oczyszczania RNA.

3. Pobieranie próbek eksperymentalnych.

  1. Podgrzej wstępnie (37 °C) jedną zamkniętą kolbę Erlenmeyera o pojemności 100 mL (lub podobną) zawierającą 4 mL 10 % (w/v) kwasu trichlorooctowego (TCA) dla każdej próbki, umieszczając ją w łaźni wodnej.
    UWAGA: OSTRZEŻENIE, TCA rozkłada się podczas podgrzewania, wydzielając toksyczne i żrące opary, w tym chlorek wodoru i chloroform. Roztwór w wodzie jest silnym kwasem; reaguje gwałtownie z zasadami i jest żrący dla wielu metali. Podczas posługiwania się tą cieczą należy zachować odpowiednie środki ostrożności.
  2. Bezpośrednio przed zbiorem komórek zmierz i zapisz OD436 hodowli.
  3. Aby zebrać komórki, przenieś 4 mL hodowli do wstępnie podgrzanej kolby zawierającej TCA.
  4. Wymieszaj próbkę, delikatnie obracając kolbą w dłoni przez 5 s. Mieszanie z TCA natychmiastowo blokuje wszelkie aktywności enzymatyczne, a tym samym utrwala poziom naładowania tRNA.
    UWAGA: Jeśli planowane jest pobranie wielu próbek, przechowuj zebrane próbki w TCA na lodzie aż do momentu pobrania wszystkich próbek.

4. Dodanie komórek spike-in

UWAGA: Przygotowanie komórek spike-in opisano w kroku 2.

  1. Po zebraniu wszystkich próbek do preparacji RNA, do każdej próbki należy dodać 5% komórek spike-in (na podstawie OD).
    UWAGA: Wymaganą objętość hodowli komórek spike-in oblicza się według wzoru:
    figure-protocol-2
    gdzie Vspike oznacza wymaganą objętość hodowli komórek spike-in, Vexp oznacza objętość zebranej eksperymentalnej hodowli komórek (bez TCA), a ODexp oznacza OD436 eksperymentalnej hodowli komórek w momencie zbioru do TCA. ODspike oznacza OD436 hodowli komórek spike-in. Jeśli wiele próbek jest zbieranych przy różnych wartościach OD, objętość dodawanych komórek spike-in powinna zostać dostosowana zgodnie z powyższym wzorem dla każdej próbki.
  2. Aby określić wkład komórek spike-in w analizowane gatunki RNA, należy przygotować próbkę zawierającą wyłącznie komórki spike-in, mieszając 4 mL komórek spike-in z 4 mL TCA. RNA z tej próbki należy przygotować w ten sam sposób, co w przypadku pozostałych próbek.
  3. Opcjonalnie można pobrać kolejną kolbę zawierającą wyłącznie próbkę eksperymentalną, bez komórek spike-in, i uwzględnić ją w celu określenia wkładu próbki eksperymentalnej w poziomy tRNAselC; endogenne poziomy tRNAselC w E. coli K-12 są pomijalnie niskie.

5. Przygotowanie RNA

UWAGA: Protokół przygotowania RNA opisany w niniejszym materiale jest w zasadzie taki sam, jak ten opisany przez Varshney et al.1; Aby uniknąć deacylacji aminoacylowanych tRNA podczas oczyszczania, ważne jest utrzymywanie próbek przy kwaśnym pH i w temperaturze 0 °C przez cały proces oczyszczania. Do przechowywania próbek i roztworów należy używać czystych, sterylnych probówek/kolb, a wszystkie roztwory należy przygotowywać z wody ultraczystej (oporność 18,2 MΩ·cm).

  1. Nalać 8 mL każdej próbki do schłodzonej w lodzie probówki wirówkowej. Wirować próbki przez 10 min przy 9,500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć nadosad i resuspender w 0,3 mL zimnego 0,3 M octanu sodu, pH 4,5 oraz 10 mM EDTA.
  2. Przenieść każdą próbkę do schłodzonej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL i dodać 0,3 mL fenolu zrównoważonego tym samym buforem.
    UWAGA: OSTRZEŻENIE, fenol emituje toksyczne opary i jest silnie żrący dla skóry.
  3. Mieszać każdą próbkę na vortexie 10 razy po 15 s, zachowując co najmniej 1 min odstępu między każdym mieszaniem. Pomiędzy etapami vortexowania przechowywać próbki w temperaturze 0 °C. Wykorzystać częste przerwy, aby upewnić się, że próbki pozostają zimne.
  4. Wirować próbki przez 15 min przy 20,000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną (fazę górną) do nowych probówek do mikrowirowania 1,5 mL. Dodać 0,3 mL zimnego fenolu i wymieszać na vortexie 4 razy po 15 s, analogicznie jak wcześniej.
  5. Wirować przez 10 min przy 20,000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do nowych, schłodzonych probówek do mikrowirowania 1,5 mL zawierających 2,5-krotną objętość 96% etanolu (~750 µL). Wytrącić RNA poprzez inkubację probówek przez 1 h w temperaturze -20 °C lub przez noc w -80 °C.
  6. Wirować próbki przez 30 min przy 20,000 x g w temperaturze 4 °C. Odlać nadosad i ostrożnie dodać 1 mL zimnego 70% etanolu, nie naruszając osadu RNA. Delikatnie odwrócić probówkę raz, aby przemyć jej ścianki wewnętrzne etanolem.
    UWAGA: Na tym etapie osad może być trudny do zauważenia.
  7. Wirować przez 10 min przy 20,000 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć nadosad i suszyć osad na powietrzu, aż do całkowitego odparowania etanolu. Resuspender osad poprzez intensywne mieszanie na vortexie w 20 µL zimnego 10 mM octanu sodu pH 4,5 i 1 mM EDTA.
    UWAGA: Nie należy przesuszyć osadu, ponieważ utrudni to jego resuspensję.
  8. Opcjonalnie ocenić stężenie RNA poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm.
  9. Opcjonalnie ocenić jakość oczyszczonego RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym20.
  10. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Na tym etapie protokół można przerwać.

6. Przygotowanie kontrolnej próbki chemicznie deacylowanej

UWAGA: Aby odróżnić prążek tRNAy aminocylowanego od jego odpowiednika deacylowanego w analizie Northern blot, przygotowuje się alikwot chemicznie deacylowany poprzez traktowanie zasadowe. W większości przypadków wystarczy deacylować jedną próbkę dla każdego Northern blot.

  1. Próbkę RNA rozmrozić na lodzie. Alikwot 4 µL próbki RNA przenieść do nowej probówki. Dodać 46 µL Tris-HCl pH 9.0. Inkubować przez 2 h w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać 15 µL 0,3 M octanu sodu o pH 4,5, a następnie dodać 125 µL 96% etanolu. RNA wytrącić w temperaturze -20 °C przez 1 h.
  3. Wirować przez 30 min przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant i resuspender w 4 µL schłodzonego 10 mM octanu sodu pH 4,5 i 1 mM EDTA.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, jeśli próbka zostanie przechowywana w temperaturze -80 °C.

7. Elektroforeza w żelu i Northern blotting

  1. Wymieszać 4 µL próbki (niepoddanej działaniu odczynników lub chemicznie deacylowanej) z 6 µL buforu do nakładania (0,1 M octanu sodu (pH 5,0), 8 M mocznika, 0,05% błękitu bromofenolowego i 0,05% cyjanolu ksylenowego).
    UWAGA: Należy pamiętać o uwzględnieniu próbki zawierającej wyłącznie komórki spike-in, próbki chemicznie deacylowanej (oraz próbki bez komórek spike-in, jeśli została przygotowana).
  2. Nałożyć próbki na żel poliakrylamidowy o grubości 0,4 mm i stężeniu 6,5% (stosunek akrylamidu do bisakrylamidu 19:1), zawierający 8 M mocznika w buforze 0,1 M octanu sodu (pH 5,0). W celu prawidłowej separacji gatunków tRNA należy stosować żele o długości 60 cm.
  3. Rozdzielić RNA za pomocą elektroforezy przy napięciu 10 V/cm w temperaturze 4 °C, aż błękit bromofenolowy dotrze do dolnej krawędzi żelu (~20 h).
  4. Obszar od barwnika cyjanolu ksylenowego do 20 cm poniżej, w kierunku barwnika błękitu bromofenolowego, jest wykorzystywany do transferu (odległość między dwoma barwnikami powinna wynosić 25-30 cm). Ostrożnie rozdzielić dwie szklane płytki tak, aby żel pozostał na jednej z nich. Cienki kawałek papieru filtracyjnego wyciąć do rozmiaru pożądanego obszaru transferu i położyć na części żelu, która będzie wykorzystana do transferu. Części żelu niezakryte papierem filtracyjnym należy odciąć i usunąć.  Używając papieru filtracyjnego, ostrożnie odnieść fragment żelu od szklanej płytki.
    UWAGA: Duży żel jest bardzo kruchy, dlatego należy z nim obchodzić się ostrożnie.
  5. Na wierzch żelu nałożyć dodatnio naładowaną membranę nylonową (np. membranę Hybond N+) i przeprowadzić elektrotransfer przy napięciu 20 V przez 90 min, stosując 40 mM Tris-octanu (pH 8,1) i 2 mM EDTA jako bufor transferowy.
  6. Utrwalić RNA na membranie za pomocą światła UV (0,12 J/cm2).
    UWAGA: Membrana może być teraz przechowywana w temperaturze pokojowej, a protokół można w tym miejscu przerwać.

8. Projektowanie i weryfikacja sond

UWAGA: Staranne zaprojektowanie i weryfikacja sond do analizy Northern blot jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników i uniknięcia niepożądanej hybrydyzacji krzyżowej z innymi gatunkami RNA.

  1. W качестве sond przeciwczułych należy zastosować krótkie syntetyczne oligonukleotydy. Sekwencję sondy należy zaprojektować tak, aby była komplementarna do najbardziej unikalnej części sekwencji badanego tRNA – najczęściej jest to pętla antykodonowa.
    UWAGA: Listę przewidywanych sekwencji tRNA z różnych organizmów można znaleźć w bazie Genomic tRNA Database (GtRNAdb)21.
  2. Należy dostosować długość sekwencji, aby uzyskać przewidywaną temperaturę topnienia w zakresie 55-65 °C.
  3. Wybraną sekwencję należy poddać analizie BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) względem sekwencji genomu szczepu bakteryjnego użytego w eksperymencie, aby zweryfikować, czy sekwencja jest unikalna dla wybranego tRNA, zgodnie z opisem w22.
    UWAGA: W Tabeli 1 wymieniono sugerowane sekwencje sond dla kilku różnych tRNA E. coli K12. Jeśli sonda jest specyficzna dla badanego tRNA, na analizie Northern blot widoczne są tylko dwa prążki (tRNA naładowany i nienaładowany), a w ścieżce z próbką deacylowaną widoczny jest tylko jeden prążek (tRNA nienaładowany). W przypadku obecności więcej niż dwóch prążków lub chęci dalszej walidacji specyficzności sondy, należy zapoznać się z sekcją Dyskusja.

9. Hybrydyzacja w technice Northern blot

UWAGA: W następnych krokach membrana jest sekwencyjnie hybrydyzowana z sondami komplementarnymi do pożądanych specyficznych tRNA, w tym z sondą specyficzną dla referencyjnego tRNAselC.

  1. Umieść membranę w probówce do hybrydyzacji i dodaj 6 mL roztworu do hybrydyzacji (0,9 M NaCl, 0,05 M NaH2PO4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (w/v) SDS, 100 mg/mL rozdrobnionego i zdenaturowanego DNA z nasadnika i 5x roztwór Denhardta (roztwór Denhardta 100x = 2% albuminy surowicy bydlęcej, 2% poliwinylopirolidonu 40 oraz 2% Ficollu)).
  2. Przeprowadź prehybrydyzację membrany w buforze przez 1 h w temperaturze 42 °C przy ciągłym obracaniu. Dodaj 30 pmol radioaktywnej sondy oligo-DNA znakowanej 32P z końcem 5' (przygotowanej zgodnie z opisem Sambrooka et al.23)
    UWAGA: OSTROŻNIE, wysokoenergetyczna emisja beta z 32P może stanowić znaczne zagrożenie dla skóry i oczu. Podczas pracy z 32P należy zachować odpowiednie środki ostrożności. Odpady radioaktywne należy utylizować zgodnie z odpowiednimi instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa.
  3. Inkubuj sondę z membraną przez noc w temperaturze 42 °C przy ciągłym obracaniu. Usuń sondę za pomocą jednorazowej pipety 10 mL.
    UWAGA: Sonda przechowywana w zamrażarce może zostać użyta ponownie.
  4. W probówce do hybrydyzacji krótko przemyj membranę w 50 mL roztworu 0,3 M NaCl, 30 mM cytrynianu sodu, 0,1% (w/v) SDS w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Pierwsze przemywanie zawiera dużą ilość niezwiązanej sondy i musi być traktowane jako silnie radioaktywne.
  5. Powtórz krok 9.4 raz, a następnie przenieś membranę do płaskiego plastikowego pojemnika lub tacy z pokrywką. Przykryj membranę roztworem piorącym (0,3 M NaCl, 30 mM cytrynianu sodu, 0,1% (w/v) SDS) i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  6. Wymień roztwór piorący i kontynuuj płukanie, aż do uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu (często 3–4 wymiany roztworu piorącego). Użyj licznika Geigera-Müllera, aby monitorować zmiany stosunku szumu do sygnału, mierząc promieniowanie z pustego obszaru membrany i porównując je z obszarem, w którym sonda swojście zhybrydyzowała z tRNA.
  7. Aby móc usunąć sondę z membrany po ekspozycji, upewnij się (ważne), że membrana nie wyschnie przed procedurą usuwania. Umieść membranę w cienkiej plastikowej torebce lub szczelnie owiń folią spożywczą i zabezpiecz przed dostępem powietrza taśmą lub poprzez zgrzewanie. Umieść zamkniętą membranę na ekranie fosforowym.
    UWAGA: Wymagany czas ekspozycji na ekranie fosforowym zależy od aktywności swoistej sondy, ilości badanego RNA oraz wydajności hybrydyzacji sondy i może się on znacznie różnić: od kilku minut do kilku dni. Na podstawie doświadczenia intensywność promieniowania wykryta na membranie licznikiem Geigera-Müllera daje dobrą orientację co do wymaganego czasu ekspozycji. Dla wiarygodnej kwantyfikacji ważne jest, aby nie doprowadzić do prześwietlenia ekranu.
  8. Zeskanuj ekran fosforowy za pomocą skanera laserowego i zapisz plik w formacie „.gel”.
    UWAGA: Wysoki stosunek sygnału do szumu jest niezbędny do wiarygodnej kwantyfikacji. Detekcja tRNA powinna skutkować pojawieniem się dwóch prążków: jednego zawierającego aminoacylowane tRNA (wolniejsza migracja) i jednego zawierającego deacylowane tRNA (szybsza migracja). Patrz Rycina 2.

10. Płukanie błony (stripping)

UWAGA: Zanim membrana zostanie poddana detekcji innego tRNA, poprzednią sondę należy najpierw usunąć poprzez stripping membrany.

  1. Podgrzać wystarczającą ilość buforu do strippingu (15 mM NaCl, 1,5 mM cytrynianu sodu, 0,1% (w/v) SDS), aby przykryć membranę, a następnie wlać go na membranę. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  2. Powtarzać krok 10.1 do momentu, aż licznik Geigera-Müllera nie będzie wykrywał promieniowania; membranę można teraz poddać ponownej hybrydyzacji zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 9.

11. Ilościowe oznaczanie tRNA oraz poziomów załadowania

  1. Wczytaj plik .gel do oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Narysuj linię pionową wzdłuż każdej z próbek w taki sposób, aby obejmowała większość szerokości ścieżki, ale wykluczała krawędzie prążków, gdzie sygnał może być nierównomierny, jak pokazano na Rysunku 3A.
  2. Zwizualizuj liczbę zliczeń z każdej ścieżki, klikając "Analysis" -> "Create Graph". Ręcznie zdefiniuj dwa piki reprezentujące naładowane i nienaładowane tRNA z każdej ścieżki, jak pokazano na Rysunku 3B.
  3. Uzyskaj liczbę zliczeń z każdego piku, klikając "Analysis" -> "Area Report", i zapisz pole powierzchni pod każdym z dwóch pików.
  4. Po przeprowadzeniu hybrydyzacji blotu z sondami dla tRNAselC oraz co najmniej jednego badanego tRNA, znormalizuj poziomy badanego tRNA względem tRNAselC.
    1. Oblicz proporcję tRNA pochodzącego z komórek spike-in w każdej ścieżce i odejmij ją od całkowitego sygnału w tej ścieżce, korzystając z równania:
      figure-protocol-3
      UWAGA: W tym przypadku SampletRNA = sygnał uzyskany z pojedynczej ścieżki membrany poddanej hybrydyzacji z pożądanym tRNA; SampleselC = sygnał uzyskany z tej samej ścieżki tej samej membrany poddanej hybrydyzacji z tRNAselC; ReftRNA = sygnał uzyskany ze ścieżki zawierającej wyłącznie RNA komórek spike-in z tej samej membrany poddanej hybrydyzacji z pożądanym tRNA; RefselC = sygnał uzyskany ze ścieżki zawierającej wyłącznie RNA komórek spike-in z tej samej membrany poddanej hybrydyzacji z tRNAselC.
    2. Aby znormalizować dane, podziel skorygowaną wartość tRNA z każdej ścieżki przez sygnał tRNAselC z tej samej ścieżki.
      UWAGA: Wkład komórek pobranych w sygnał tRNAselC jest pomijalny (patrz Rysunek 2, ścieżka oznaczona jako "-selC").
  5. Oblicz poziom naładowania tRNA dla każdej ścieżki, dzieląc sygnał piku reprezentującego naładowane tRNA przez sumę sygnałów z obu pików (naładowane + nienaładowane).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisaną tutaj procedurę, zmierzono poziom obfitości oraz stopień naładowania trzech tRNAs w szczepie E. coli K-12 przed i w trakcie głodowania aminokwasowego.

Szczep NF915, aukstrotrof argininy4 (thr leu his argH thi mtl supE44) hodowano przez co najmniej dziesięć generacji w minimalnym medium MOPS uzupełnionym o 0,4% glicerolu, 50 µg/mL treonina, leucyna, arginina i 5 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, jak jednocześnie mierzyć poziom naładowania określonych tRNA E. coli i porównywać względne poziomy tRNA w różnych próbkach. Krytycznymi punktami protokołu są: 1) obchodzenie się z próbkami w taki sposób, aby poziomy ładowania tRNA w komórkach zostały zachowane, 2) normalizacja ilości tRNA w taki sposób, aby można było wiarygodnie porównać względne poziomy tRNA w różnych próbkach, oraz 3) zapewnienie specyficzności wybranych sond dla interesujących nas tRNA. Kwestie te zostały omówione oddzi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Marit Warrer za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Duńską Radę ds. Niezależnych Badań Naukowych | Nauk Przyrodniczych [1323-00343B] oraz Duńskiej Narodowej Fundacji Badawczej [DNRF120].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MocznikMerck57-13-6Czystość >99%
PoliakryloamidServa79-06-7
Bis (N,N'-metyleno-bis-akrylamid)BIO-RAD161-0201
Kwas trichlorooctowy (TCA)Sigma76-03-9
FenolMerck108-95-2
IPTG
Glukoza
Octan
EDTA
Etanol
Tris
Kwas
Chlorek
NaH2PO4
Cytrynian
SDS
Śledź Plemniki DNASigma100403-24-5
BSA
Poliwinylopirolidon
Ficoll
P32 i gamma; ATPPerkin Elmer
DNA oligonukleotydy (sondy)TAG Kopenhaga
Hybond Membrana N+GE HealthcareRPN203B
Crosslinker
ElectroblotterBIO-RAD
Typhoon FLA 7000 GEHealthcare28955809
Spektrofotometr
Piec
Geiger-Mü probówka
ller Ekran do obrazowania luminoforowegoGE Healthcare
Probówka
Kolby hodowlane Probówki
do mikrowirówek 1,5
ml Probówki
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
ImageQuantGE Healthcare
ExcelMicrosoft
sodusolnysodusodudo hydrydyzacjihybrydyzacyjna wirówkowe 20 ml

Bibliografia

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tRNAadowanie tRNAoczyszczanie RNAelektroforeza w eluNorthern blottingkom rki z dodatkiem wewn trznym spike inkwantyfikacja RNAtRNA aminokwasowyzawarto tRNA
Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.