Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Summary

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Abstract

Mutageneza transpozonów to metoda, która pozwala na zakłócenie genu poprzez losowe wstawianie genomu fragmentu DNA zwanego transpozonem. Poniższy protokół przedstawia metodę wysokowydajnego transferu między szczepami bakteryjnymi plazmidu zawierającego transpozon zawierający marker oporności na kanamycynę. Transpozaza przenoszona przez plazmid jest kodowana przez wariant genu tnp, który wprowadza transpozon do genomu szczepu biorcy z bardzo niskim odchyleniem insercyjnym. Metoda ta pozwala zatem na stworzenie dużych zmutowanych bibliotek, w których transpozony zostały wstawione w unikalne pozycje genomowe w biorcy szczepu bakterii Escherichia coli lub Shigella flexneri. Dzięki zastosowaniu koniugacji bakteryjnej, w przeciwieństwie do innych metod, takich jak elektroporacja czy transformacja chemiczna, można tworzyć duże biblioteki z setkami tysięcy unikalnych klonów. W ten sposób uzyskuje się biblioteki insercyjne o dużej gęstości, w których insercje występują tak często, jak co 4-6 par zasad w nieistotnych genach. Ta metoda jest lepsza od innych metod, ponieważ pozwala na niedrogą, łatwą w użyciu i wysokowydajną metodę tworzenia gęstej biblioteki wstawiania transpozonów. Biblioteka transpozonów może być wykorzystywana w dalszych zastosowaniach, takich jak sekwencjonowanie transpozonów (Tn-Seq), do wnioskowania o sieciach interakcji genetycznych lub prościej, w badaniach przesiewowych mutacji (genetyki do przodu).

Introduction

Tworzenie bibliotek mutagenezy transpozonów u bakterii jest przydatne dla szerokiej gamy zastosowań, począwszy od odkryć genów wirulencji w patogenach bakteryjnych^1,2, do badań nad niezbędnymi genami^3,4,5^,6, do identyfikacji sieci interakcji genetycznych^7,8,9. Kluczowe znaczenie dla tych badań ma możliwość stworzenia dużej biblioteki mutantów. Użycie transpozonów (krótkich fragmentów DNA, które losowo wstawiają się do genomu) jest prostym sposobem zakłócenia funkcji genu, ponieważ wprowadzenie transpozonu w otwartej ramce odczytu lub regionie regulatorowym genu często zakłóca funkcję lub ekspresję genu.

Opisana tutaj jest metoda tworzenia biblioteki transpozonów u E. coli lub S. flexneri poprzez koniugację bakteryjną przy użyciu plazmidu pJA1¹⁰. Istnieją dwie główne zalety stosowania tego plazmidu. Pierwszą zaletą jest to, że wariant transpozazy Tn10 wyrażony z plazmidu pJA1 jest indukowalny i ma niską stronniczość insercji^11,12, co oznacza, że transpozon losowo zintegruje się z genomem, gdy do pożywki zostanie dodany izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG). Transpozon zawiera marker oporności na kanamycynę, co pozwala na selekcję mutantów z wstawkami transpozonu do chromosomu szczepu biorcy. Drugą zaletą plazmidu pJA1 jest to, że zawiera on zmutowane pochodzenie replikacji R6K. Zmutowane pochodzenie replikacji R6K wymaga genu lambda pir w celu utrzymania plazmidu¹³. Ponieważ plazmid nie może replikować się w szczepach pir-, zostanie utracony w szczepie biorcy (Rysunek 1). Gwarantuje to, że transpozaza Tn10 zostanie usunięta z komórki i nie będzie już aktywna, co zmniejszy dalsze mutacje po początkowym zdarzeniu transpozycji.

Użycie koniugacji bakteryjnej do przeniesienia plazmidu pJA1 ze szczepu dawcy do szczepu biorcy jest korzystne z kilku powodów. Koniugacja jest prosta i niedroga do wykonania i nie wymaga specjalnego sprzętu, takiego jak elektroporator. Dodatkowo, wysoka wydajność koniugacji bakteryjnej pozwala na uzyskanie bardzo dużej biblioteki (>2 x 10⁵ unikalnych insercji) przy użyciu zaledwie kilku mililitrów (ml) nocnej hodowli bakteryjnej⁶. Proces ten trwa około dwóch godzin czasu praktycznego wraz z czasem na inkubację i wzrost bakterii. Langridge i wsp.¹⁴ zgłosił wykonanie 130 elektroporacji w celu stworzenia biblioteki mutagenezy transpozonów o rozmiarze podobnym do opisanej tutaj⁸, co osiąga się za pomocą pojedynczej koniugacji. Zastosowanie 130 elektroporacji wymaga pracochłonnego i czasochłonnego przygotowania elektrokompetentnych ogniw oraz użycia wielu drogich materiałów (np. kuwet do elektroporacji), co wiąże się z kosztem ponad 1000 USD w samych materiałach eksploatacyjnych. Inne badania¹⁰ używały podobnych metod, ale z różnymi szczepami bakterii i osiągnęły znacznie mniejsze rozmiary bibliotek (5 x 10⁴ jednostki tworzące kolonie) niż opisane tutaj.

Uwagi na temat szczepu dawcy: Użyty tutaj szczep dawcy to szczep E. coli BW20767¹⁵ zawierający plazmid transpozonu pJA1¹⁶. Szczep BW20767 może koniugować się z innymi szczepami, dzięki czemu transfer plazmidu pJA1 jest bardzo wydajny. Co ważne, BW20767 jest lambda pir+. Jak wspomniano wcześniej, plazmid pJA1 może być utrzymany tylko w szczepach zawierających gen lambda pir. Szczep ten jest odporny na kanamycynę i ampicylinę. Plazmid pJA1 zawiera marker oporności na ampicylinę, a marker oporności na kanamycynę jest zawarty w transpozonie. Szczep ten jest uprawiany z selekcją na plazmidzie przy użyciu ampicyliny w stężeniu 100 μg/ml. Warto również zauważyć, że inne szczepy zawierające geny transpozazy o konstytutywnej ekspresji są znane jako niestabilne i chociaż zastosowana tutaj transpozaza jest pod kontrolą indukowalną, ryzyko nieszczelnej ekspresji pozostaje niskie. Z tego powodu sugeruje się, że przejście tego szczepu powinno być zminimalizowane, a świeża smuga powinna być pobierana z zamrożonej kultury dla każdego nowego preparatu bibliotecznego. Użyty tutaj szczep dawcy jest dostępny w naszym laboratorium na życzenie.

Uwagi na temat szczepu odbiorcy: Szczep biorcy może być szczepem z wyboru, takim jak laboratoryjne szczepy E. coli pochodzące z K12 lub szczepy S. flexneri (zobacz również: Dyskusja). Szczep biorcy musi mieć dodatkowy marker oporności na antybiotyki, który nie jest opornością na kanamycynę, aby można było dokonać selekcji szczepu dawcy. Dla szczepu biorcy stosuje się tutaj szczep E. coli MG1655 z wprowadzoną spontaniczną mutacją kwasu nalidyksowego. Spontaniczny mutant kwasu nalidyksowego wybrano poprzez wysianie 2 ml nocnej hodowli w 200 μl podwielokrotności na płytkach zawierających kwas nalidyksowy w stężeniu 30 μg/ml. Wybrano pojedynczy klon MG1655, który był odporny na kwas nalidyksowy, aby stać się szczepem biorcy. Dodatkowo, szczep biorca musi być lambda pir ujemny, jak opisano powyżej.

Przegląd: Gdy koniugacja bakteryjna już nastąpi i plazmid pJA1 przeniesie się ze szczepu dawcy do szczepu biorcy, dodanie IPTG do pożywki wywoła ekspresję genu tnp, który jest pod kontrolą indukowanego przez IPTG promotora lacIq/Ptac (Rysunek 1). Gen tnp na pJA1 jest zmutowaną transpozazą, która ma niższą częstotliwość insercji w gorących punktach^6,10,11. Po dodaniu i indukcji za pomocą IPTG, transpozon jest aktywowany i losowo wstawiany do genomu. Plazmid nie może być utrzymany w szczepie biorcy lambda pir- i jest tracony.

Protocol

UWAGA: Jeśli używasz S. flexneri jako szczepu biorcy, proszę pamiętać, że S. flexneri jest ludzkim patogenem, który może powodować choroby żołądkowo-jelitowe. Eksperymenty z udziałem S. flexneri muszą być przeprowadzane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego (oznaczone jako BSL-2 w Europie i USA lub PC2 w Nowej Zelandii). Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w filmie związanym z tym protokołem zostały przeprowadzone przy użyciu dobrze scharakteryzowanego szczepu biorcy niepatogennej E. coli MG1655 w warunkach PC1. Praca z Shigella flexneri była wcześniej wykonywana w laboratorium BSL-2 w Biozentrum w Bazylei, zgodnie z opisem w⁶.

Uwaga: Poniższy eksperyment jest skutecznie przeprowadzany dwukrotnie. Pierwsza część (Krok 1.1 - Krok 4.5) jest wykonywana w celu znalezienia najlepszego rozcieńczenia do posiewu z biblioteki, gdzie celem jest znalezienie rozcieńczenia koniugacji, które daje wiele pojedynczych kolonii na płytkę, ale nie tak wiele, aby utworzył się trawnik. Ma to na celu ograniczenie konkurencji między mutantami o znacznie obniżonej sprawności a tymi o silniejszej sprawności. Druga część (Kroki 5.1-7.4) to stworzenie końcowej biblioteki, w której rozkłada się wiele płyt o odpowiednim rozcieńczeniu biblioteki.

1. Przygotować się dzień przed eksperymentem

1. Zaszczepić, z zamrożonego bulionu, szczep dawcy w 2 ml bulionu LB, pożywka według przepisu Millersa (NaCl w stężeniu 10 g/l) zawierająca ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml. Użyty tutaj szczep dawcy to szczep E. coli BW20767¹⁵ zawierający plazmid pJA1¹¹. Stosowanie ampicyliny utrzymuje selekcję plazmidu pJA1
.
2. Zaszczepić, z pojedynczej kolonii lub zamrożonego bulionu, szczep biorcy w 2 ml pożywki LB ze znacznikiem oporności innym niż ampicylina lub kanamycyna. Użytym tutaj szczepem biorcy jest szczep E. coli "typu dzikiego" MG1655^17,18 z spontanicznym mutantem oporności na kwas nalidyksowy. Uprawia się go w 30 μg/ml kwasu nalidyksowego.
3. Przygotuj 20 bulionów Luria zawierających 1,5% płytek agarowych (na 90 mM szalkach Petriego, około 12,5 ml). Płytki agarowe pozbawione antybiotyku mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, aż do użycia.
4. Przygotuj 20 bulionów Luria zawierających 1,5% płytek agarowych (na 90 mM szalkach Petriego, około 12,5 ml) zawierających zarówno kwas nalidyksowy w stężeniu 30 μg/ml, jak i kanamycynę w stężeniu 50 μg/ml (LBA Nal30 Kan50). Płytki agarowe zawierające antybiotyki można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, aż do użycia.
5. Przygotuj 200 ml sterylnego podłoża LB. Pożywki LB można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
6. Przygotuj 1 ml 100 mM sterylnego wywaru IPTG, zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Kojarzenie lub koniugacja bakterii

1. Odwirować 1 ml nocnej hodowli szczepu dawcy przez 1 minutę w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzuć pożywkę wzrostową. Ten krok ma na celu usunięcie wszystkich pożywek wzrostowych zawierających antybiotyki.
2. Zawiesić osad komórkowy w 110 μl LB (niezawierającym antybiotyków), zagęszczając w ten sposób kulturę.
3. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść sterylny filtr nitrocelulozowy (alternatywnie można użyć sterylnego kawałka bibuły, patrz Lista materiałów) na środku płytki LBA (nie zawierającej antybiotyków). Oznacz tabliczkę "Kontrola ujemna: Dawca".
4. Za pomocą pipety wrzuć 50 μl skoncentrowanej kultury dawcy na filtr.
5. Powtórz kroki 2.1-4 dla szczepu biorcy, oznaczając tabliczkę "Kontrola ujemna: Biorca".
6. W przypadku biblioteki upuść 50 μl dawcy (z kroku 2.2) I 50 μl szczepu biorcy (z kroku 2.5) na pojedynczy sterylny filtr na płytce LBA (płytki te nie powinny zawierać antybiotyków). Oznacz tę tabliczkę jako "Biblioteka". Krycie następuje, ponieważ dawca i biorca są w bliskim kontakcie fizycznym na filtrze.
7. Umieścić płytki agarowe zawierające filtry w temperaturze 37 °C na 6 godzin.

3. Aktywacja transpozonu pJA1 przez indukcję transpozazy IPTG

1. Przygotować trzy stożkowe fiolki o pojemności 15 ml zawierające 2 ml LB z IPTG w końcowym stężeniu 1 mM (tj. 20 μl ze 100 mM zapasu IPTG). Oznacz każdą etykietę: Formant darczyńcy, Formant adresata i Biblioteka.
2. Wyjąć płytki z inkubatora po 6 godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C (od kroku 2.4). Na filtrze powinien być widoczny pewien wzrost bakterii.
3. Za pomocą sterylnych kleszczy usuń bibułę filtracyjną z grupy kontrolnej dawcy i umieść ją w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml oznaczonej jako Kontrola dawcy (od kroku 3.1). Zrób to samo dla formantu adresata i biblioteki.
4. Postukaj w probówki, aby bibuła filtracyjna znalazła się na dnie stożkowej fiolki o pojemności 15 ml i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona w LB.
5. Wiruj rurki przez co najmniej pełną minutę na wysokich obrotach, aby oddzielić bakterie od filtra nitrocelulozowego. LB powinien stać się mętny z komórkami bakteryjnymi (Rysunek 2).
6. Używając sterylnych szklanych kulek lub sterylnego rozsiewacza, nanieś 200 μl wirowej zawiesiny bakterii z kontroli dawcy na płytki LBA Nal30 Kan50 oznaczone "Kontrola dawcy, 200 μL".
7. Powtórzyć powyższy krok (3.6) dla kontrolki odbiorcy, oznaczając tabliczki "Kontrola odbiorcy, 200 μL".
8. Powtórzyć powyższy krok (3.7) dla biblioteki, oznaczając tabliczki "Biblioteka, 200 μL".
9. Wykonać dodatkowe rozcieńczenia (tj. rozcieńczenia 1:5, 1:10 i 1:100, używając LB niezawierającego antybiotyków jako rozcieńczalnika) biblioteki. Płytka 200 μl nierozcieńczonej biblioteki i dodatkowe rozcieńczenia na odpowiednio oznakowane płytki LBA Nal30 Kan50.
10. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 18 godzin. Klony z transpozonami wprowadzonymi do genu, który powoduje dużą utratę sprawności, mogą potrzebować więcej czasu, aby urosnąć i pojawić się na płytce. Kolonie powinny być różnej wielkości (Rysunek 3). Na płytkach szczepów dawcy i biorcy nie powinno znajdować się żadne kolonie.

4. Wybierz odpowiednie rozcieńczenie biblioteki, które ma być użyte dla ostatecznej biblioteki mutantów

1. Określ rozcieńczenie biblioteki z kroku 3.9, które daje wiele kolonii o różnych rozmiarach, które są odpowiednio rozmieszczone. Celem jest zebranie jak największej liczby kolonii na jednej płycie, ale nie na tyle, aby kolonie łączyły się ze sobą i rywalizowały o zasoby. Liczba ta powinna wynosić około 500-2,000 kolonii na płytkę. Przykład odpowiedniego zagęszczenia kolonii na płytce pokazano na Rysunek 3.
2. Zapisz liczbę kolonii na płytkach.
3. Oblicz częstotliwość koniugacji (liczba koniugantów na komórkę biorcy). Powinien to być zakres od 1 x ^10-4 do 1 x ^{10-6 19}.
4. Określ pożądaną liczbę mutantów w końcowej bibliotece na podstawie aplikacji podrzędnych. Wielu użytkowników po prostu potrzebuje biblioteki z jak największą liczbą mutantów. Aby wygenerować jak najwięcej insercji transpozonów, jak to teoretycznie możliwe (jedna insercja na każdą parę zasad), celuj w przybliżenie w taką samą liczbę kolonii, jak pary zasad w genomie (tj. ~4,5 x 10⁶ dla E. coli), aby w pełni nasycić genom wszystkimi możliwymi insercjami transpozonów. Należy zauważyć, że wiele mutantów zawierających insercje w podstawowych lub funkcjonalnie ważnych genach nie będzie w stanie odzyskać, ponieważ mutacje te będą śmiertelne dla biorcy.
5. Oblicz, ile objętości początkowej biblioteki jest potrzebne do utworzenia biblioteki o żądanym rozmiarze. Na przykład żądany rozmiar biblioteki to 5 x 10⁴ mutanty. Rozcieńczenie z najlepszym odstępem między koloniami z kroku 3.9 wynosiło 200 μl rozcieńczenia 1:10. Liczbę kolonii na tej płycie szacuje się na około 2,000 kolonii. Jeśli potrzebne są 5 x 10⁴ mutanty, a każda płytka ma 2,000 kolonii, to przy tym rozcieńczeniu potrzebnych będzie 25 płytek.

5. Stworzenie Ostatecznej Biblioteki Mutantów

1. Powtórz kroki od 1 do 3.8, dostosowując w razie potrzeby liczbę płytek w kroku 1.4 (patrz krok 4.4).
2. W kroku 3.9 nanieś rozcieńczenie wybrane w kroku 4.1 na tyle płytek, ile jest potrzebne do utworzenia biblioteki o żądanym rozmiarze (patrz krok 4.4).

6. Oszacuj gęstość biblioteki

1. Policz, ile kolonii znajduje się na jednej płycie, a tym samym uzyskaj przybliżone oszacowanie, jak gęsta jest biblioteka. Na przykład: W sumie 2x10⁵ kolonii jest platerowanych. Genom E. coli MG1655 składa się z około 4,5 x 10⁶ par zasad. Dlatego biblioteka z około 2 x 10⁵ wstawieniami oznacza, że średnio co 22 pary zasad występuje wstawka i że każdy gen powinien być zmutowany około 45 razy, biorąc pod uwagę, że jeden gen to w przybliżeniu 1 x 10³ pary zasad. Insercje w niezbędnych genach będą prawdopodobnie bardzo niedostatecznie reprezentowane w tej bibliotece, a zatem zagęszczenie w genach nieistotnych będzie prawdopodobnie większe. Tego rodzaju obliczenia dostarczają szerokiego oszacowania gęstości transpozonów.

7. Łączenie biblioteki Transposon i pamięci masowej

1. Po zliczeniu kolonii dodaj 1 ml LB (lub więcej, w razie potrzeby) do płytki bibliotecznej i użyj sterylnego rozsiewacza, aby zeskrobać bakterie z płytki. Usunąć zawiesinę bakteryjną i umieścić w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml lub 15 ml. Powtórz tę czynność dla wszystkich talerzy.
2. Wirować zebraną zawiesinę bakterii przez pełną minutę, aby ujednorodnić zawiesinę.
3. Dodaj sterylny glicerol do końcowego stężenia 20%.
   1. Przygotuj 100 x 20 μl porcji w probówkach o pojemności 0,25 ml, aby ułatwić ich ponowny wzrost.
   2. Przygotować co najmniej dwie lub więcej porcji po 1 ml w kriowialach.
4. Przechowywać wszystkie porcje w temperaturze -80°C

Results

Po 18 godzinach wzrostu, płytki powinny zawierać wiele kolonii o różnych rozmiarach (Rysunek 3). Różne rozmiary kolonii wskazują na klony o różnej sprawności i są dobrym znakiem, że protokół zadziałał. Kontrole dawcy i biorcy nie powinny mieć narośli na płytkach. Korzystając z powyższego protokołu, powinno to dać znacznie ponad 2 x 10⁵ jednostek tworzących kolonie (CFU). Skalowanie protokołu w górę do pięciu koniugacji replikowanych jednocześnie powinno dać około 1 x 10⁶ CFU. W poprzednich pracach analiza z wykorzystaniem sekwencjonowania nowej generacji wykazała, że taka przeskalowana biblioteka powinna dać >2 x 10⁵ unikalnych wstawień⁶. Przy bardzo wysokiej CFU (tj. 1 x 10⁶ CFU) oczekuje się, że wskaźnik unikalnych insercji ustabilizuje się, ponieważ wszystkie dostępne (nieśmiertelne) insercje staną się reprezentowane.

Rysunek 1: Schemat koniugacji bakteryjnej i insercji transpozonu do chromosomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obraz filtrów zanurzonych w nośniku LB przed i po wirowaniu. Przed wirowaniem komórki przyklejają się do filtra, a media są przezroczyste. Po wirowaniu podłoże staje się mętne, ponieważ komórki wypadły z filtra i znajdują się w pożywce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: (A) Reprezentatywna tabliczka biblioteki transpozonów po 18 godzinach wzrostu. (B) Zbliżenie wielkości kolonii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisany tutaj protokół pozwala na budowę gęstej biblioteki wstawiania. Metoda ta pozwala na stworzenie biblioteki transpozonów zawierającej ponad 2 x 10⁵ unikalnych mutantów transpozonów przy użyciu poniżej 5 ml objętości kultury⁶. Jest stosunkowo łatwy do wykonania, wykorzystuje odczynniki dostępne w większości podstawowych laboratoriów mikrobiologicznych, jest skalowalny i wymaga niewielkiego sprzętu lub materiałów eksploatacyjnych, takich jak kuwety do elektroporacji.

Istotną zaletą tej metody jest to, że teoretycznie użytkownik ma dużą swobodę w wyborze szczepów enterobakteryjnych biorców. W tym artykule, jak również w innych¹¹, użyto E. coli jako szczepu biorcy, jednak plazmid pJA1 był z powodzeniem stosowany z innymi gatunkami enterobakterii biorców, takimi jak Shigella flexneri⁶ i Salmonella enterica serowar Typhimurium szczep SL1344¹⁰. Teoretycznie γ początek replikacji (ori_R6Kγ) w pJA1 pozwala na utrzymanie tego plazmidu w szerokim zakresie gospodarza¹⁹, co pozwala na to, że szczepem biorcy jest pir+. Ostatnio opisano nowe metody, które pozwalają na konstruowanie pir+ w różnych szczepach enterobakteryjnych²⁰, co daje dodatkową elastyczność. Dodatkowo, regionmob o długości 300 par zasad z plazmidu RP4 w pJA1 umożliwia sprzężony transfer tego plazmidu do szerokiego zakresu szczepów bakterii Gram-ujemnych¹⁹. Mówiąc najprościej, metoda ta może być teoretycznie stosowana z różnymi szczepami biorców, o ile spełnionych jest kilka warunków: szczep jest pir+ i charakteryzuje się opornością na antybiotyki inną niż kanamycyna i inną niż szczep dawcy.

Krytycznym krokiem w protokole jest oszacowanie właściwej liczby komórek do wydzielenia w kroku 4.1. Jeśli kolonie są rozmieszczone zbyt blisko, konkurują o składniki odżywcze na talerzu, a mniej sprawne mutanty są konkurencjonowane. Może to prowadzić do zmniejszenia całkowitej liczby mutantów. Alternatywnie, jeśli kolonie są oddalone od siebie zbyt daleko, na płytce będzie zbyt mało kolonii, a całkowita liczba płytek agarowych potrzebnych do uzyskania dużej biblioteki stanie się uciążliwa. Dlatego ważne jest osiągnięcie właściwej równowagi pod względem liczby kolonii na płytce.

Ważne jest, aby wykonać kontrole wymienione w protokole, aby upewnić się, że kroki działają zgodnie z opisem. Warto zauważyć, że w przypadku stosowania kwasu nalidyksowego jako przeciwselekcji przeciwko szczepowi dawcy, ważne jest, aby upewnić się, że płytki kontrolne z ujemnym dawcą są wolne od kolonii. Dzieje się tak, ponieważ może występować niski odsetek (około 1 x ^10-10)²¹ spontanicznej oporności na kwas nalidyksowy, co daje wyniki fałszywie dodatnie. Zazwyczaj szybkość koniugacji i transpozycji wynosi około 2 x ^{10-4 19}. W związku z tym szybkość koniugacji i transpozycji jest o kilka rzędów wielkości większa niż szybkość spontanicznej oporności na kwas nalidyksowy. W związku z tym odsetek wyników fałszywie dodatnich w porównaniu ze zdarzeniami prawdziwej transpozycji jest bardzo niski i uważany za nieistotny, gdy protokół działa. Jeśli jednak tempo koniugacji lub transpozycji zostanie znacznie zmniejszone (z powodu niskiej wydajności kojarzenia i/lub braku indukcji genu transpozazy z IPTG), a protokół zostanie przeskalowany w górę, aby to zrekompensować, wówczas liczba wyników fałszywie dodatnich (klonów, które nie mają wstawionego transpozonu) może również wzrosnąć.

Pewne modyfikacje można wprowadzić w czasie inkubacji w krokach 3.2 i 3.10. Krok 3.2 mówi, że koniugacja powinna następować przez 6 godzin, ale z naszego doświadczenia wynika, że ten krok czasowy może być zmieniany (tj. 4-7 godzin) bez znaczącej zmiany wyników. Dodatkowo, w kroku 3.10, można również dostosować czas inkubacji kolonii na płytkach agarowych. Może się to zmieniać w zależności od średniego czasu podwojenia lub tempa wzrostu szczepu biorcy. Dodatkowo, z naszego doświadczenia, 18 godzin dało różne rozmiary kolonii, co wskazuje na bibliotekę o różnym przystosowaniu. Jednak kolonie o znacznie obniżonej sprawności mogą rosnąć dłużej, a zatem mogą nie być widoczne po 18 godzinach. Jeśli ta metoda jest stosowana do znajdowania klonów o skrajnie zmniejszonej sprawności, można zastosować dłuższy czas inkubacji i mniej kolonii na płytce w celu zmniejszenia stłoczenia (tj. 48 godzin, 50-300 kolonii).

Dodatkowe pułapki tej metody obejmują to, że nie jest możliwe użycie szczepu biorcy, który jest już odporny na kanamycynę. W celu pokonania tej przeszkody możliwe jest zastąpienie markera oporności na kanamycynę w plazmidzie pJA1 na alternatywny marker do wyboru, taki jak oporność na chloramfenikol. Warto również zauważyć, że teoretycznie możliwe jest użycie szczepu biorcy, który jest odporny na ampicylinę, ponieważ plazmid pJA1 zawierający marker oporności na ampicylinę jest tracony wkrótce po transpozycji.

Stworzenie gęstej biblioteki transpozonów w wybranym przez siebie tle genetycznym jest potencjalnie korzystne dla wielu dalszych zastosowań. Na przykład gęsta biblioteka transpozonów może być wykorzystana do identyfikacji mutantów auksotroficznych za pomocą posiewu replik²² lub do identyfikacji mutantów, które są wadliwe w tworzeniu infekcji ^1,2. Niedawno, gdy koszty sekwencjonowania DNA spadły, a nowe technologie, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, stały się powszechne, biblioteki transpozonów zostały wykorzystane do głębokiego sekwencjonowania DNA w celu uzyskania wglądu w niezbędność genów, funkcję genów i interakcje genetyczne. Niektóre z tych metod zostały omówione w ²³ i obejmują takie metody, jak sekwencjonowanie miejsca insercji kierowane transpozonami (TraDIS), sekwencjonowanie transpozonów (Tn-seq), wysokoprzepustowe śledzenie insercji za pomocą głębokiego sekwencjonowania (HITS) i sekwencjonowanie insercji (INSeq). Wszystkie te dalsze metody opierają się na budowie gęstych bibliotek wstawiania transpozonów. Podczas gdy w przypadku określonych metod dalszych może być konieczne zastosowanie innych wektorów, opisany tutaj protokół zawiera przegląd istotnych punktów proceduralnych, które należy śledzić.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtry nitrocelulozowe 0,45 mikrona (sterylne)	Milipory	HAWP02500	Alternatywnie można użyć bibuły (wymienionej poniżej)
Bibuła pocięta na kółka ~ 1 cala, a następnie autoklaw/sterylizowana w folii. Nie ma różnicy w wydajności między filtrami nitrocelulozowymi a bibułą	GE life Sciences: produkt Bibuła Chr klasy 3MM, arkusz, 46 i razy; 57 cm	3030-917	Alternatywnie można zastosować filtry nitrocelozowe (wymienione powyżej)
Kleszcze metalowe, sterylne	VWR/Global Science Nowa Zelandia	MURRE009/01
Szalki Petriego, sterylne, średnica 90 mm, objętość 68 ml,   Objętość robocza 12,5 ml.	Interlab Nowa Zelandia	2303-1090
Sterylne rozsiewacze szkła	VWR/Global Science Nowa Zelandia	NZNZSPREADER	Alternatywnie do rozprowadzania kultury na płytkach można użyć sterylnych kulek szklanych (wymienionych poniżej)
Sterylne kulki szklane	VWR/Global Science New Zealand	HERE1080603	Alternatywnie można użyć sterylnego rozsiewacza szkła do rozprowadzania kultury na płytkach (wymienionych powyżej)
Kwas nalidyksowy (opcjonalnie)	GoldBio.com	N-015-250
Sól sodowa ampicyliny BioChemica	VWR/Global Science Nowa Zelandia	APLIA0839.0025	przygotować zgodnie z zaleceniami producenta
Siarczan kanamycyny BioChemica	VWR/Global Science Nowa Zelandia	APLIA1493.0010
IPTG (Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd)	Thermofisher Nowa Zelandia	FMTR0393
Difco Agar granulowany	Fort Richard Laboratries/Interlab Nowa Zelandia	214530
Baza bulionowa Luria (baza bulionowa Miller's LB)	Thermofisher	12795-084
Glicerol bidestylowany 99,5 %	VWR/Global Science Nowa Zelandia	VWRC24388.320
15 ml sterylne stożkowe fiolki polipropylenowe	VWR/Global Science New Zealand	CORN430791
Probówki do mikrowirówek, płaskie, 1,7 ml, ultraprzezroczysty PP, z podziałką, autoklawowalne i zamrażalne	VWR/Global Science New Zealand	AXYGMCT-175-C
50 ml Probówki wirówkowe, Falcon, PP, stożkowe, z nadrukowaną podziałką, z płaskimi nakrętkami, sterylne	VWR/Global Science New Zealand	BDAA352070
Nazwa	Firma<	strong>Numer katalogowy	Uwagi
Sprzęt
Inkubator w 37C
Autoklaw do sterylizacji pożywek