Artykuł metodologiczny

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56221

⸱

21 września 2017

 ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Streszczenie

RNA stają się ważnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi. W związku z tym istnieje ogromny potencjał w opracowywaniu sond chemicznych i ligandów terapeutycznych do rozpoznawania sekwencji i struktury RNA. Niedawno opracowano chemicznie modyfikowane oligomery peptydowych kwasów nukleinowych (PNA), które mogą rozpoznawać dupleksy RNA w sposób specyficzny dla sekwencji. PNA są stabilne chemicznie z neutralnym szkieletem podobnym do peptydu. PNA mogą być stosunkowo łatwo syntetyzowane za pomocą ręcznej metody syntezy peptydów w fazie stałej Boc-chemistry. PNA są oczyszczane za pomocą HPLC z odwróconą fazą, a następnie charakteryzowane są za pomocą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą czasu przelotu (MALDI-TOF). Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) bez denaturacji ułatwia obrazowanie powstawania tripleksów, ponieważ starannie zaprojektowane konstrukty dupleksowe wolnego RNA i tripleksy związane z PNA często wykazują różne szybkości migracji. Niedenaturujący PAGE z bromkiem etydyny po barwieniu jest często łatwą i pouczającą techniką charakteryzowania powinowactwa wiązania i specyficzności oligomerów PNA. Zazwyczaj wiele spinek do włosów RNA lub dupleksów z mutacjami pojedynczej pary zasad można wykorzystać do scharakteryzowania właściwości wiązania PNA, takich jak powinowactwo wiązania i swoistość. 2-aminopuryna jest izomerem adeniny (6-aminopuryny); intensywność fluorescencji 2-aminopuryny jest wrażliwa na lokalne zmiany środowiska strukturalnego i nadaje się do monitorowania tworzenia tripleksów z resztą 2-aminopuryny włączoną w pobliżu miejsca wiązania PNA. Miareczkowanie fluorescencyjne 2-aminopuryny można również wykorzystać do potwierdzenia selektywności wiązania zmodyfikowanych PNA w stosunku do ukierunkowanych dwuniciowych RNA (dsRNA) w stosunku do jednoniciowych RNA (ssRNA). Eksperymenty z topnieniem termicznym z detekcją absorpcji promieniowania UV pozwalają na pomiar stabilności termicznej dupleksów PNA-RNA i tripleksów PNA·RNA2. W tym miejscu opisano syntezę i oczyszczanie oligomerów PNA zawierających zmodyfikowane reszty oraz opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Wprowadzenie

RNA stają się ważnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi, ze względu na ostatnie postępy w odkryciach roli RNA w regulacji i katalizie różnych procesów biologicznych1,2,3. Tradycyjnie, nici antysensowne były używane do wiązania się z ssRNA poprzez tworzenie dupleksu Watsona-Cricka3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Ostatnio kwasy nukleinowe peptydowe tworzące triplex (TFPNA) zostały zaprojektowane tak, aby wiązały się z dsRNA poprzez wiązania wodorowe Hoogsteena ( Rysunek 1) < sup class="xref">3,28,29. Regiony dsRNA są obecne w większości tradycyjnych RNA ukierunkowanych na antysens, w tym pre-mRNA i mRNA, pre- lub pri-miRNAs3 i wielu innych niekodujących RNA1,26,27. Celowanie w dsRNA poprzez tworzenie potrójnej helisy za pomocą TFPNA może być korzystne ze względu na jego specyfikę strukturalną i ma ogromny potencjał do wykorzystania w przywracaniu normalnych funkcji RNA, które są rozregulowane na przykład w chorobach.

Ostatnio opublikowana praca Rozners et al., oraz us3,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41, poinformował o wysiłkach zmierzających do poprawy selektywnego wiązania zmodyfikowanych TFPNA z dsRNA o zwiększonym powinowactwie. Opracowaliśmy metody syntezy racjonalnie zaprojektowanych monomerów PNA ( Rysunek 2), w tym monomeru tio-pseudoizocytozyny (L) 30 i modyfikowanego guanidyną monomeru 5-metylo cytozyny (Q)31. Dzięki różnym metodom charakterystyki biochemicznej i biofizycznej wykazaliśmy, że stosunkowo krótkie PNA (6-10 reszt) zawierające reszty L i Q wykazują lepsze rozpoznawanie par zasad Watsona-Cricka G-C i C-G odpowiednio w dsRNA. Ponadto, w porównaniu z niezmodyfikowanymi PNA, PNA zawierające reszty L i Q wykazują bardziej selektywne wiązanie w kierunku dsRNA w stosunku do ssRNA i dsDNA. Funkcjonalność guanidyny42 w bazie Q umożliwia PNA wejście do komórek HeLa31.

W naszym laboratorium syntetyzujemy PNA za pomocą manualnej chemii Boc (Boc lub t-Boc oznacza tert-butyloksykarbony (zobacz Rysunek 2) metoda syntezy peptydów w fazie stałej4. Synteza monomeru PNA z Boc jako grupą chroniącą aminy jest wygodna, ponieważ grupa Boc jest sterycznie mniej masywna w porównaniu z grupą chroniącą aminy fluorenylometylokoksykarbonylowe (Fmoc), co może być korzystne podczas sprzęgania monomeru PNA na stałym podłożu. Grupa Boc jest kwasolubna i może być łatwo usunięta na stałym podłożu przez 20-50% kwas trifluorooctowy (TFA) w dichlorometanie (DCM) podczas syntezy PNA. Do syntezy oligomerów PNA można zastosować zautomatyzowany syntezator peptydów; jednak do automatycznego syntezatora peptydów potrzebny jest 3-5-krotny nadmiar monomeru PNA. Ręczna synteza wymaga znacznie mniejszej ilości monomeru PNA (2-3-krotny nadmiar), a każde sprzężenie jest łatwo monitorowane przez Kaiser test43. Co więcej, wiele automatycznych syntezatorów nie jest kompatybilnych z syntezą strategii Boc ze względu na użycie TFA na etapie usuwania Boc.

Oligomery PNA mogą być oczyszczone za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC), a następnie charakterystyki masy cząsteczkowej za pomocą MALDI-TOF (Rysunki 3 i 4)30,31. Używamy niedenaturującego PAGE do monitorowania powstawania triplexów, ze względu na fakt, że wolne dupleksowe konstrukty RNA i tripleksy związane z PNA często wykazują różne wskaźniki migracji (Rysunek 5)30,31. Znakowanie nie jest potrzebne, jeśli można uzyskać skuteczne barwienie końcowe zarówno dla potrójnych pasm dupleksu RNA, jak i PNA·RNA2. Do eksperymentów PAGE bez denaturacji potrzebna jest stosunkowo niewielka ilość próbki. Jednak ładujące (inkubacyjne) i bieżące (pH 8,3) mogą nie być takie same, co powoduje, że pomiary są ograniczone do stabilnych kinetycznie tripleksów, ponieważ stosunkowo wysokie pH 8,3 może znacznie zdestabilizować tripleks.

2-aminopuryna jest izomerem adeniny (6-aminopuryny); intensywność fluorescencji 2-aminopuryny (z pikiem emisji około 370 nm) jest wrażliwa na lokalne zmiany środowiska strukturalnego i jest odpowiednia do monitorowania tworzenia się triplex z resztą 2-aminopuryny włączoną w pobliżu miejsca wiązania PNA (Rysunek 6)31. W przeciwieństwie do wielu innych barwników, które wykazują emisję fluorescencji w zakresie widzialnym, RNA znakowane 2-aminopuryną można wystawić na działanie światła pokojowego bez wybielania fotograficznego. W przeciwieństwie do eksperymentu PAGE, w którym często potrzebny jest bufor o pH 8,3, miareczkowanie fluorescencyjne oparte na 2-aminopurynie pozwala na pomiar wiązania w jednym roztworze przy określonym pH, a tym samym może pozwolić na pomiar i wykrycie stosunkowo słabego i kinetycznie niestabilnego wiązania w stanie równowagi.

Eksperymenty termicznego topnienia z wykrytą absorbancją-UV pozwalają na pomiar stabilności termicznej dupleksów (Rysunek 7)31 i triplexes30,32,44,45. W zależności od długości i składu sekwencji, topnienie tripleksów może, ale nie musi, wykazywać wyraźne przejście. Parametry termodynamiczne można uzyskać, jeżeli krzywe ogrzewania i chłodzenia nakładają się na siebie. Dokładne parametry termodynamiczne można uzyskać za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC)32; jednak do celów ITC na ogół wymagane są stosunkowo duże ilości próbek.

Protokół

1. Ręczna synteza peptydów w fazie stałej w celu otrzymania PNA z wykorzystaniem chemii Boc

UWAGA: Aby zapewnić powodzenie i łatwość pożądanej syntezy oligomerów PNA, wszystkie rozpuszczalniki i odczynniki powinny być bezwodne. Należy dodać odpowiednie sita molekularne (4A, granulki o średnicy 1-2 mm) i okresowo przepłukiwać butelki suchym azotem. Do syntezy zmodyfikowanych monomerów PNA można wykorzystać protokoły opisane w odpowiednich referencjach30,31. Niezmodyfikowane monomery PNA można nabyć z komercyjnych źródeł. W każdym z etapów płukania do żywicy dodaje się odpowiednią ilość rozpuszczalnika, tworząc zawiesinę, przed jego odlaniem.

  1. Ładowanie pierwszego monomeru i blokowanie nadmiaru wolnych amin pierwotnych na żywicy
    1. Odważyć 30 mg żywicy polistyrenowej z chlorkiem 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA·HCl) (dostępna komercyjnie; wartość ładowania 0,7-1,4 mmol/g; rozmiar ziarna 100-200 mesh) i przenieść do 5 mL naczynia do reakcji peptydowych w fazie stałej wyposażonego w kurek i szklany korek.
    2. Namoczyć żywicę w odpowiedniej ilości DCM przez 1 h, aby żywica spuchła i odsłoniła grupy aminowe (sól HCl).
      UWAGA: Ziarna żywicy powinny być przez cały czas syntezy całkowicie zanurzone w rozpuszczalnikach.
    3. Odlać DCM, kierując delikatny strumień suchego azotu nad wlew kolby. Dodać 1 mL 50% (v/v) N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) w DCM i pozostawić na 15 min. Neutralizuje to sól HCl przyłączoną do wolnych amin na żywicy.
    4. Powtórzyć krok 1.1.3. W międzyczasie odważyć 6 µmol monomeru i 6 µmol heksafluorofosforanu (benzotriazol-1-ylo-oksy)tripyrrolidynofosforoniumu (PyBOP) i przenieść do probówki 1,5 mL. Dodać 200 µL dimetyloformamidu (DMF) i 12 µmol DIPEA. Mieszać roztwór sprzęgający w wortexie przez 3-5 min.
      UWAGA: Pożądana wartość ładowania wynosi 0,2 mmol/g. Pierwszy dodany monomer to monomer na końcu C-końcowym pożądanej sekwencji PNA. Wartość ładowania pierwszej aminokwasu można obliczyć metodą kwasu pikrynowego46.
    5. Odlać DIPEA z roztworu DCM. Przemyć żywicę DCM (x 3), a następnie DMF (x 3) i zamknąć kurek. Dodać przygotowany roztwór sprzęgający do żywicy i delikatnie wstrząsnąć. Przesunąć żywicę wzdłuż wewnętrznych ścianek naczynia do roztworu sprzęgającego za pomocą czystej szpatułki ze stali nierdzewnej. Założyć szklany korek i umieścić naczynie w inkubatorze z wytrząsarką na 3 h w temperaturze 40 °C.
      UWAGA: Alternatywnie naczynie reakcyjne można pozostawić w spoczynku w temperaturze pokojowej przez 6-8 h, aby umożliwić zakończenie reakcji sprzęgania peptydowego.
    6. Przygotować roztwór blokujący, mieszając 240 µmol bezwodnika octowego i 360 µmol DIPEA w 200 µL DCM. Odlać roztwór sprzęgający i przemyć żywicę DMF (x 3) oraz DCM (x 3). Dodać roztwór blokujący i pozostawić naczynie na 30 min, sporadycznie delikatnie wstrząsając. Blokowanie maskuje nadmiar wolnych grup amin pierwotnych na żywicach poprzez acetylację.
    7. Powtórzyć krok 1.1.6. Odlać roztwór blokujący i przemyć żywicę DCM (x 3).
    8. Pobrać niewielką alikwotę ziaren żywicy za pomocą cienkiej rurki kapilarnej i umieścić je w małej szklanej fiolce 1,5 mL. Wykonać test Kaisera43. Dodać 15 µL każdego z roztworów testu Kaisera do fiolki i podgrzać za pomocą opalarki. Obserwować kolor ziaren po podgrzaniu. Kolor ziaren nie powinien ulec zmianie, co wskazuje na brak wolnych grup aminowych na żywicy.
      UWAGA: Zestaw do testu Kaisera jest dostępny komercyjnie lub może być przygotowany zgodnie z opisanym protokołem. Roztwór A: ninhydryna w etanolu; roztwór B: fenol w etanolu; roztwór C: cyjanek potasu (KCN) w pirydynie.
      OSTRZEŻENIE: KCN jest silnie toksyczny; należy stosować odpowiednią odzież ochronną, a podgrzewanie powinno odbywać się w dobrze wentylowanej dygestorium, w nieobecności łatwopalnych rozpuszczalników lub odczynników.
    9. Powtórzyć krok 1.1.6, jeśli ziarna żywicy wykazują niebieski lub blado niebieski kolor.
  2. Usuwanie grupy ochronnej aminy N-końcowej
    1. Odlać rozpuszczalniki z naczynia reakcyjnego i dodać roztwór 50% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA) w DCM, upewniając się, że żywice są całkowicie zanurzone. Pozostawić naczynie na 15 min, sporadycznie wstrząsając w celu ułatwienia deprotekcji grup aminowych. Powtórzyć jeszcze 2 cykle.
      OSTRZEŻENIE: TFA jest silnie żrący. Podczas pracy należy stosować odpowiednią odzież ochronną.
    2. Przemyć żywicę DCM (x 3), DMF (x 3) i DCM (x 3). Dodać roztwór 5% DIPEA w DCM. Pozostawić naczynie na 15 min. Ten krok aktywuje wolne aminy poprzez neutralizację przeciwjonów TFA. Powtórzyć raz jeszcze.
    3. Wypłukać DIPEA z roztworu DCM. Przemyć żywicę DCM (x 3). Wykonać test Kaisera (krok 1.1.8).
      UWAGA: Pomyślna deprotekcja grup aminowych spowoduje niebieskie zabarwienie ziaren. Po pomyślnej deprotekcji można przeprowadzić kolejne sprzęganie monomerów metodą sprzęgania peptydowego.
  3. Sprzęganie kolejnych monomerów
    1. Odważyć 18 µmol pożądanego monomeru (dla monomeru Boc-PNA-Q-OH odważyć 13,2 mg monomeru) i 18 µmol PyBOP do probówki 1,5 mL. Dodać 200 µL DMF i 36 µmol DIPEA do probówki 1,5 mL. Mieszać w wortexie do całkowitego rozpuszczenia wszystkich związków stałych.
    2. Przemyć żywicę DMF (x 3). Dodać roztwór sprzęgający do naczynia reakcyjnego i delikatnie wstrząsnąć. Przesunąć żywicę wzdłuż wewnętrznych ścianek naczynia do roztworu sprzęgającego za pomocą czystej szpatułki ze stali nierdzewnej. Założyć szklany korek i umieścić naczynie w inkubatorze z wytrząsarką na 3 h w temperaturze 40 °C.
    3. Odlać roztwór sprzęgający i przemyć żywicę DMF (x 3) oraz DCM (x 3). Wykonać krok 1.1.8. Jeśli kolor ziaren nie uległ zmianie, powtarzać kroki 1.2.1-1.3.3 aż do ukończenia pożądanej sekwencji PNA. Jeśli po sprzęganiu monomeru zaobserwowano niebieskie zabarwienie ziaren, powtórzyć kroki 1.3.1-1.3.3. Jeśli zabarwienie nadal utrzymuje się, ponownie przeprowadzić blokowanie (krok 1.1.6).
      UWAGA: W przypadku problemów ze sprzęganiem zaleca się wydłużenie czasu reakcji (3-12 h) i/lub zastosowanie nadmiaru ekwiwalentów monomeru i odczynników sprzęgających.
    4. Po ukończeniu pożądanej sekwencji PNA przemyć żywicę DMF (x 3) i DCM (x 3). Całkowicie osuszyć żywicę, stosując ciągły strumień suchego azotu przez 15 min. Tę suchą żywicę można podzielić i wykorzystać do przyłączenia lizyny lub znacznika fluorescencyjnego, takiego jak cyjanina 3 (Cy3) i karboksyfluoresceina, na końcu N-końcowym PNA.
  4. Przyłączanie lizyny lub znacznika fluorescencyjnego (Cy3, Cy5 lub karboksyfluoresceiny) do N-końca PNA
    1. Odważyć 10 mg żywicy uprzednio załadowanej pożądaną sekwencją PNA. Przenieść do 5 mL naczynia reakcyjnego. Namoczyć żywicę w DCM przez 1 h.
    2. W celu przyłączenia lizyny wykonać kroki 1.2.1-1.3.3, zastępując monomer związkiem Boc-Lys(Z)-OH lub Fmoc-Lys(Boc)-OH.
    3. W celu przyłączenia karboksyfluoresceiny wykonać kroki 1.2.1-1.3.3, stosując 10-krotny nadmiar 5(6)-karboksyfluoresceiny jako monomeru oraz N,N'-diizopropylokarbodiimid (DIPC) i hydroksybenzotriazol (HOBt) jako odczynniki sprzęgające w DMF. Pozostawić reakcję sprzęgania na noc w inkubatorze z wytrząsarką w 40 °C.
      UWAGA: Ponieważ karboksyfluoresceina jest światłoczuła, naczynie reakcyjne należy owinąć folią aluminiową.
    4. W celu przyłączenia barwnika Cy3 lub Cy5 za pomocą metody chemii klik, wykonać kroki 1.2.1-1.3.3, zastępując monomer N-Boc-2-propargylo-L-glicyną. Funkcjonalizuje to N-koniec PNA grupą alkinową. Przeprowadzić reakcję klik katalizowaną miedzią, aby przyłączyć zawierający azyd fluorescencyjny barwnik Cy3 lub Cy512,47,48,49
  5. Odczepienie PNA od nośnika stałego, oczyszczanie i charakterystyka
    UWAGA: Jeśli jakakolwiek grupa aminowa jest chroniona grupą Fmoc, najpierw przeprowadzić deprotekcję grupy aminowej, traktując ją 20% roztworem piperydyny w DMF przez 15 min (2 cykle). Dokładnie przemyć żywicę DMF (x 3), a następnie DCM (x 3). Całkowicie osuszyć żywicę, stosując ciągły strumień suchego azotu przez 15 min.
    1. Przenieść 5 mg suchej żywicy do małej fiolki. Dodać 10 µL tioanizolu i 4 µL 1,2-etanoditiolu, upewniając się, że żywica jest zanurzona w odczynnikach. Pozostawić probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Odczynniki te pełnią rolę wychwytywaczy (scavengers), które wiążą reaktywne gatunki kationowe powstające podczas usuwania grup ochronnych w PNA. Odpowiednich wychwytywaczy dobiera się w zależności od grup ochronnych łańcucha bocznego.
    2. Dodać 100 µL TFA do probówki zawierającej żywicę i wychwytywacze. Delikatnie wymieszać w wortexie i poddać krótkiej wirówce. Pozostawić probówkę w temperaturze pokojowej na 10 min.
      OSTRZEŻENIE: TFA jest silnie żrący. Podczas pracy należy stosować odpowiednią odzież ochronną.
    3. Ostrożnie dodać 20 µL kwasu trifluorometanosulfonowego (TFMSA) do probówki. Delikatnie wymieszać mieszaninę reakcyjną przed krótkim wirowaniem w temperaturze pokojowej. Pozostawić probówkę w spoczynku w temperaturze pokojowej przez 2 h.
      OSTRZEŻENIE: TFMSA jest silnie żrący. Podczas pracy należy stosować odpowiednią odzież ochronną.
    4. Przefiltrować koktajl odczepiający do 5 mL kolby okrągłodennej (RBF) za pomocą szklanej pipety Pasteura z watą. Użyć niewielkiej ilości TFA do przemycia żywicy.
    5. Przepłukać zebrany filtrat suchym azotem do odparowania wszystkich lotnych rozpuszczalników. Dodać 1 mL zimnego eteru dietylowego do kolby RBF.
      UWAGA: Eter dietylowy spowoduje wytrącenie PNA.
      1. Przepłukać kolbę RBF eterem dietylowym kilka razy przed przeniesieniem zmętniałego roztworu do probówki 1,5 mL. Poddać probówkę wirowaniu, aby osad PNA opadł na dno. Odlać rozpuszczalniki i dodać 300-500 µL wody autoklawowanej do osadu. Dokładnie wymieszać w wortexie, aby rozpuścić PNA.
    6. Oczyścić surowy preparat PNA za pomocą RP-HPLC, stosując wodę-acetonitryl-0,1% TFA jako fazę ruchomą. Zebrać odpowiednie frakcje, odparować wszystkie rozpuszczalniki za pomocą koncentratora próżniowego przed ponownym rozpuszczeniem oczyszczonego PNA w wodzie autoklawowanej.
    7. Przeprowadzić charakterystykę oczyszczonego PNA za pomocą analizy MALDI-TOF, stosując kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA) jako macierz krystalizacyjną próbki.
    8. Zmierzyć absorbancję UV (260 nm) PNA w 40 °C. Obliczyć stężenie PNA za pomocą równania:
      Prawo Beera-Lamberta, równanie: c=A/εl, obliczanie stężenia, analiza absorbancji.
      UWAGA: Tutaj c to stężenie, A to odczyt absorbancji, ε to współczynnik ekstynkcji sekwencji RNA, a l to długość drogi optycznej kuwety (1 cm). Współczynnik ekstynkcji sekwencji PNA jest sumą współczynników ekstynkcji poszczególnych monomerów50. Współczynniki ekstynkcji adeniny, cytozyny, guaniny i tyminy wynoszą odpowiednio 15,4, 7,3, 11,7 i 8,8 mL/µmol·cm. Przyjmuje się, że współczynnik ekstynkcji użytych monomerów L i Q jest taki sam jak w przypadku zasady cytozyny (C).

2. Nieodtwarzalna elektroforeza w żelu poliakryloamidowym (PAGE)

  1. Przygotowanie wymaganych roztworów buforowych
    1. Przygotować bufor do inkubacji (10 mL), wykorzystując 116,88 mg NaCl (200 mM), 50 µL 100 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 mM), 200 µL 1M roztworu stokowego HEPES (20 mM) oraz 9,75 mL H2O; dostosować pH buforu do wartości 7,5.
    2. Przygotować 1x bufor do elektroforezy Tris-Borate-EDTA (TBE) (1 L), wykorzystując 100 mL 10x Tris-Borate-EDTA o pH 8,3 oraz 900 mL H2O.
    3. Przygotować 10% roztwór persiarczanu amonu (APS) (300 µL), wykorzystując 30 mg persiarczanu amonu oraz 300 µL H2O.
  2. Przygotowanie 12% żelu poliakrylamidowego
    1. Oczyścić grzebień do formowania studzienek, szklane płyty odlewnicze i dystanse etanolem; grzebień do formowania studzienek i dystanse mają grubość 1 mm. Złożyć zestaw do żelowania i uszczelnić taśmą do uszczelniania żelu.
    2. Dla żelu poliakrylamidowego o wymiarach 22 cm x 16,5 cm x 1 mm wystarczająca jest ilość 50 mL roztworu żelu. Odważyć 5,7 g akrylamidu i 0,3 g N,N'-metylenobisakrylamidu (19:1) i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.
      UWAGA: Akrylamid jest rakotwórczy. Należy unikać wdychania pyłów akrylamidu i zapewnić stosowanie odpowiedniej odzieży ochronnej podczas pracy.
    3. Rozpuścić związki stałe w 50 mL 1X buforu do elektroforezy TBE, umieszczając probówkę wirówkową w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 15 min lub do momentu całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników stałych. Przeprowadzić wirowanie (3 000 rpm, 5 min, 25 °C), aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z roztworu. Pozostawić roztwór do ochłodzenia do temperatury pokojowej.
    4. Dodać 250 µL 10% roztworu APS oraz 50 µL tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu żelu i delikatnie wymieszać za pomocą szpatułki. Natychmiast wlać roztwór pomiędzy szklane płyty, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Włożyć grzebień do formowania studzienek i pozostawić zestaw z żelem w temperaturze pokojowej przez co najmniej 60 min w celu przeprowadzenia polimeryzacji, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Przygotowanie próbek
    1. Pobrać wymaganą ilość spinki RNA (1 µM) z roztworu stokowego do czystej probówki 1,5 mL. Osuszyć roztwór RNA za pomocą koncentratora próżniowego.
      UWAGA: Każda próbka zawiera 1 µM RNA w 20 µL buforu do inkubacji. Zazwyczaj do jednego eksperymentu PAGE przygotowuje się 13 próbek RNA. RNA dla wszystkich próbek można przygotować wspólnie w jednej probówce.
    2. Pobrać wymagane objętości docelowego PNA (z końcowym stężeniem do 50 µM) z roztworu stokowego i przenieść do oddzielnych probówek 1,5 mL. Odparować wodę z roztworów PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    3. Dodać 260 µL buforu do inkubacji do probówki 1,5 mL zawierającej osuszone RNA i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że całe RNA jest rozpuszczone. Poddać RNA szybkiemu schłodzeniu: umieścić probówkę w bloku grzejnym (wstępnie podgrzanym do 95 °C) na 5 min. Natychmiast przenieść do łaźni lodowej i pozostawić na 10 min.
    4. Dodać 20 µL RNA do każdej z probówek 1,5 mL zawierających osuszone PNA i dokładnie wymieszać. Przeprowadzić wyżarzanie: umieścić probówkę zawierającą mieszaninę RNA i PNA w bloku grzejnym (wstępnie podgrzanym do 65 °C) na 10 min. Wyłączyć blok grzejny i pozwolić próbkom powoli ochłodzić się do temperatury pokojowej. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Elektroforeza i przetwarzanie żelu
    1. Usunąć taśmę do uszczelniania żelu z dolnej strony szklanej płyty. Zamontować i przymocować szklaną płytę do pionowego statywu do żeli za pomocą plastikowych zacisków.
      UWAGA: Elektroforeza jest przeprowadzana w pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze około 4 °C. Całe oprzyrządowanie, próbki i bufory są schładzane do 4 °C przed uruchomieniem żelu.
    2. Napełnić dolny zbiornik buforowy 1x buforem do elektroforezy TBE, aż płyta zostanie zanurzona w około 1-2 cm buforu. Napełnić górny zbiornik buforowy buforem do elektroforezy, aż poziom cieczy przekroczy górną krawędź żelu o 1-2 cm. Powoli i delikatnie usunąć grzebień do formowania studzienek, pozwalając buforowi wypełnić studzienki.
    3. Podłączyć statyw do żeli do zasilacza. Przeprowadzić wstępną elektroforezę przez co najmniej 30 min przy stałym napięciu 250 V, co jest optymalne dla żelu o wymiarach 22 cm x 16,5 cm x 1 mm.
    4. W międzyczasie dodać 4 µL (20% objętości próbki) 35% roztworu glicerolu do każdej z próbek i delikatnie wymieszać. Po zakończeniu wstępnej elektroforezy, ostrożnie nanieść 20 µL każdej próbki (w tym jedną próbkę samego RNA oraz próbki zawierające mieszaninę RNA i PNA) na dno studzienki za pomocą mikropipety i końcówek do nakładania na żel, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Prowadzić elektroforezę przy stałym napięciu 250 V, analogicznie do etapu wstępnego, przez 5 h.
    5. Wyłączyć zasilacz po 5 h i wyjąć szklaną płytę ze statywu. Usunąć pozostałą taśmę do uszczelniania żelu i rozmontować szklaną płytę. Delikatnie wyjąć i zanurzyć żel w pojemniku wypełnionym 350 mL wody dejonizowanej. Ostrożnie dodać 35 µL bromku etydyny (10 mg/mL) i umieścić pojemnik na wytrząsarce platformowej (niska prędkość) na 30 min.
      UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenem. Podczas pracy należy stosować odpowiednią odzież ochronną.
    6. Utylizować roztwór bromku etydyny do wyznaczonego pojemnika na odpady. Przepłukać żel 1,5 - 2 L wody destylowanej. Zeskanować żel za pomocą obrazera (patrz Tabela materiałów) z zielonym laserem o długości fali 532 nm i filtrem emisyjnym ustawionym na 610 nm.
  5. Analiza żelu
    1. Ilościowo określić intensywność prążków żelowych za pomocą bezpłatnego oprogramowania GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Znormalizować intensywności prążków zgodnie z wzorem:
      Intensywność DNA tripleksowego w stosunku do dupleksowego, a=I_triplex_max/I_duplex_max, analiza wzoru.
      UWAGA: Tutaj Iduplex max to intensywność prążka samej spinki RNA bez dodatku PNA, a Itriplex max to intensywność prążka tripleksowego przy dodaniu najwyższego stężenia PNA.
      1. Obliczyć frakcję tworzenia tripleksu zgodnie z wzorem:
        Równanie równowagi statycznej, Y = I_triplex/(I_triplex + aI_duplex), wzór do analizy molekularnej.
    2. Przedstawić zależność frakcji tworzenia tripleksu (Y) od dodanego stężenia PNA (µM). Dopasować dane do równania, aby uzyskać stałą dysocjacji (Kd):
      Równanie równowagi statycznej; reprezentacja matematyczna; fizyka; wzór algebraiczny.
      UWAGA: Tutaj R0 to stężenie spinki RNA (1 µM). Y0 i B to odpowiednio początkowa i maksymalna zmiana frakcji tripleksu. Y to frakcja tripleksu przy zmiennym stężeniu PNA. X to całkowite stężenie PNA, a Kd to stała dysocjacji.

3. Analiza wiązania fluorescencyjnego z 2-aminopuryną

  1. Przygotowanie próbek (zawierających dsRNA)
    1. Przenieść wymaganą ilość dsRNA znakowanego 2-aminopuryną (2AP) (1 µM dla każdej nici) z zapasu głównego do czystej probówki 1,5 mL. Odparować wodę z roztworów RNA za pomocą koncentratora próżniowego.
      UWAGA: Każda próbka zawiera 1 µM RNA w 75 µL buforu inkubacyjnego. Zazwyczaj przygotowuje się 13 próbek RNA. RNA dla wszystkich próbek można przygotować wspólnie w jednej probówce.
    2. Odmierzyć wymagane objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z zapasu głównego i przenieść do oddzielnych probówek 1,5 mL. Odparować wodę z roztworów PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    3. Dodać 975 µL buforu inkubacyjnego do probówki 1,5 mL zawierającej wysuszone RNA i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że całe RNA zostało rozpuszczone. Krótko odwirować roztwór RNA i poddać go wyżarzaniu: umieścić probówkę w bloku grzejnym (wstępnie podgrzanym do 95 °C) na 10 min. Wyłączyć zasilanie bloku grzejnego i pozwolić próbkom powoli ochłodzić się do temperatury pokojowej.
    4. Dodać 75 µL RNA do każdej z probówek 1,5 mL zawierających wysuszone PNA i dokładnie wymieszać. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Przygotowanie próbek (zawierających ssRNA)
    1. Przenieść wymaganą ilość ssRNA znakowanego 2AP (1 µM) z zapasu głównego do czystych probówek 1,5 mL. Odmierzyć wymagane objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z zapasu głównego i przenieść do odpowiednich probówek 1,5 mL zawierających ssRNA. Wysuszyć mieszaninę RNA i PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    2. Dodać 75 µL buforu inkubacyjnego do każdej z probówek 1,5 mL i dokładnie wymieszać. Poddać mieszaninę wyżarzaniu: umieścić probówkę w bloku grzejnym (wstępnie podgrzanym do 95 °C) na 10 min. Wyłączyć zasilanie i pozwolić próbkom powoli ochłodzić się do temperatury pokojowej. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Pomiar i analiza
    1. Użyć spektrofluorometru do pomiaru emisji w zakresie długości fal 330-550 nm. Zastosować długość fali wzbudzenia 303 nm.
      UWAGA: Próbki są mierzone w temperaturze pokojowej; każdą próbkę mierzy się 3 razy, a następnie wyciąga średnią.
    2. Przenieść 70 µL buforu inkubacyjnego do kuwety o boku 1 cm. Rozpocząć pomiar.
    3. Usunąć bufor z kuwety. Przepłukać kuwetę wodą destylowaną i osuszyć strumieniem azotu. Powtórzyć procedurę dla wszystkich próbek. Odjąć wartości pomiarów buforu od wyników wszystkich próbek.
    4. Przedstawić zależność natężenia fluorescencji (a.u.) od długości fali (nm). Zapisać natężenie fluorescencji przy 370 nm dla wszystkich próbek. Przedstawić zależność natężenia fluorescencji przy 370 nm (a.u.) od odpowiadającego mu stężenia dodanego PNA (µM).
    5. Dopasować dane do równania z kroku 2.5.2 w celu wyznaczenia stałej dysocjacji (Kd): Y = Y0 + (B/(2R0))(R0 + X + Kd- ((R0 + X + Kd)2- 4R0X)1/2), gdzie R0 jest stężeniem dsRNA znakowanego 2AP (1 µM).
      UWAGA: Tutaj Y0 i B to odpowiednio początkowa i maksymalna zmiana natężenia fluorescencji przy 370 nm. Y to natężenie fluorescencji przy 370 nm dla zmiennego stężenia PNA. X to całkowite stężenie PNA, a Kd to stała dysocjacji.

4. Eksperymenty topnienia termicznego z detekcją absorbancji UV

  1. Przygotowanie próbek
    UWAGA: Zmierz absorbancję UV (260 nm) RNA w temperaturze 95 °C (aby upewnić się, że struktury drugorzędowe RNA zostały rozplecione). Oblicz stężenie RNA za pomocą równania:
    Równanie prawa Beer-Lamberta \(c = A/\varepsilon l\), analiza stężenia w spektroskopii.
    ​gdzie c to stężenie, A to uzyskany odczyt absorbancji, ε to współczynnik ekstynkcji sekwencji RNA, a l to długość drogi optycznej kuwety (1 cm). Współczynnik ekstynkcji RNA oblicza się na podstawie modelu najbliższego sąsiada przy użyciu programu MeltWin51,52. Pakiet programu może zostać udostępniony na prośbę.
    1. Odmierz wymaganą ilość ssRNA (5 µM) z zapasu głównego do czystych probówek 1,5 mL. Odmierz wymagane objętości docelowego PNA (5 µM) z zapasu głównego i przenieś je do odpowiednich probówek 1,5 mL zawierających ssRNA. Wysusz mieszaninę RNA i PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    2. Dodaj 130 µL buforu inkubacyjnego do każdej z probówek 1,5 mL i dokładnie wymieszaj. Poddaj mieszaninę procesowi hybrydyzacji: Umieść probówkę w bloku grzejnym (wstępnie podgrzanym do 95 °C) na 10 min. Wyłącz zasilanie i pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Pomiar i analiza
    1. Użyj spektrofotometru UV-Vis do pomiaru absorbancji przy 260 nm, stosując kuwetę mikrokomórkową o drodze optycznej 1 cm. Zmierz absorbancję próbek przy rosnącej temperaturze od 15 do 95 °C, a następnie przy spadającej temperaturze od 95 do 15 °C z szybkością zmiany 0,5 °C/min.
    2. Przenieś 130 µL próbki do każdego z dołków, upewniając się, że jeden dołek zawiera bufor inkubacyjny. Rozpocznij pomiar. Powtórz w razie potrzeby.
    3. Znormalizuj wartości absorbancji, przyjmując odczyt w wysokiej temperaturze jako jedność, a następnie nanieś znormalizowaną absorbancję na wykres w funkcji temperatury (°C). Wyznacz pierwszą pochodną krzywych. Wyznacz temperatury topnienia poprzez dopasowanie krzywych pierwszej pochodnej do funkcji Gaussa.

Wyniki

HPLC w trybie odwróconej fazy umożliwia oczyszczanie oligomerów PNA. Czyste oligomery PNA można uzyskać po dwóch rundach oczyszczania metodą HPLC (Rysunek 3). Tożsamość PNA można potwierdzić za pomocą analizy MALDI-TOF (Rysunek 4).

Niedenaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) jest prostą i informacyjną techniką służącą do charakteryzacji powinowactwa i specyficzności wiązania oligomerów PNA. Zazwyczaj stosujemy wiele spinek RNA lub dupleksów z mutacjami pojedynczych par zasad w celu scharakteryzowania właściwości wiązania (Rycina 5). Dane z niedenaturującej elektroforezy PAGE przedstawione na Rycini 5 wyraźnie sugerują, że PNA modyfikowane Q i L mogą rozpoznawać region dsRNA z parą C-G (Rycina 5B, panel dolny), ale nie ten bez pary C-G (Rycina 5B, panel górny). To specyficzne i wzmocnione rozpoznawanie odbywa się poprzez tworzenie trójek zasad PNA·RNA2 T·A-U, L·G-C oraz Q·C-G (Rycina 1A, C, D). Do wykazania poprawionych właściwości wiązania zmodyfikowanego PNA można również użyć różnych PNA z pojedynczymi lub wielokrotnymi mutacjami. Wykazaliśmy, że dodanie 2 mM Mg2+ do buforu inkubacyjnego nie wpływa znacząco na wiązanie31.

Wykazaliśmy za pomocą miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryną, że PNA zmodyfikowany Q i L wiąże się z docelowym regionem dsRNA (Rysunek 6A, 6C, 6D), ale nie z ssRNA (Rysunek 6B, 6E, 6F). PNA P3 wiąże się z dsRNA znakowanym 2-aminopuryną z wartością Kd wynoszącą 0.8 ± 0.1 µM. Intensywność fluorescencji przy 370 nm dla ssRNA znakowanego 2-aminopuryną pozostaje względnie stała przy zmiennym stężeniu P3, co wskazuje na brak wiązania PNA P3 z ssRNA.

PNA zawierające reszty Q (P2 i P3) nie wykazują przejść topnienia termicznego (Rysunek 7), co sugeruje brak wiązania z ssRNA. Jest to spowodowane zawadą steryczną występującą w parze Q-G o charakterze Watsona-Cricka. W porównaniu z niezmodyfikowanym PNA P1, PNA P4 i P5 zawierające zmodyfikowane reszty L, ale nie zawierające reszt Q, wykazują obniżone temperatury topnienia dla odpowiadających im dupleksów RNA-PNA ze względu na zawadę steryczną występującą w parze L-G o charakterze Watsona-Cricka. Dane topnienia termicznego wykryte za pomocą absorbancji UV są zgodne z danymi miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryną, które również pokazują, że PNA zawierające reszty Q i L nie wiążą się znacząco z ssRNA (Rysunek 6B, 6E, 6F). Wprowadzenie zasady Q jest bardziej destabilizujące niż zasady L, ponieważ zasada Q wywołuje bardziej znaczącą zawadę steryczną podczas tworzenia pary Q-G o charakterze Watsona-Cricka (Rysunek 1F) w porównaniu do pary L-G o charakterze Watsona-Cricka (Rysunek 1E).

Schemat parowania zasad RNA-DNA; pary Hoogsteena a Watsona-Cricka; analiza struktury chemicznej.
Rysunek 1: Struktury chemiczne stabilnych trypletów zasad oraz niestabilnych struktur par zasad. (A-D) Triplety zasad PNA·RNA2 w dużym rowku dla T·A-U (A), C+·G-C (B), L·G-C (C) oraz Q·C-G (D). (E, F) Niestabilne pary zasad PNA-RNA typu Watsona-Cricka dla L-G (E) i Q-G (F). Litera R reprezentuje szkielet cukrowo-fosforanowy RNA. Wiązania wodorowe zaznaczono czarnymi liniami przerywanymi. Rysunek został powielony z referencji31. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat struktur chemicznych wariantów Boc-PNA, ilustrujący syntezę kwasów nukleinowych typu peptydowego.
Rycina 2: Struktury chemiczne monomerów PNA. Przedstawiono cztery monomery PNA (T, C, L oraz Q). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat syntezy peptydu z wynikami chromatografii produktu surowego i ponownego oczyszczania, analiza czasu retencji.
Rycina 3: Struktura chemiczna oligomeru PNA i oczyszczanie za pomocą RP-HPLC. (A) Struktura chemiczna sekwencji PNA P3. (B, C) Dane RP-HPLC dla surowego PNA P3 (B) oraz ponownie oczyszczonego PNA P3 (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik spektrometrii mas; wykres m/z w funkcji intensywności; analiza związku P3; masa obliczona i obserwowana.
Rycina 4: Widmo MALDI-TOF oczyszczonego PNA P3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interakcje spinek RNA; schemat, elektroforeza w żelu, krzywa wiązania; analiza tworzenia tripleksu.
Rycina 5: Sekwencje spinek RNA i PNA oraz charakterystyka wiązania metodą niedenaturującej elektroforezy PAGE. (A) Spinki RNA (rHP1 i rHP2), PNA P3 oraz tripleks PNA·RNA2 utworzony pomiędzy PNA P3 a rHP2. (B) Wyniki niedenaturującej elektroforezy PAGE (12%) dla wiązania rHP1 i rHP2 z PNA P3. Bufor inkubacyjny zawiera 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. Naniesione spinki RNA (rHP1 i rHP2) znajdują się w stężeniu 1 µM w objętości 20 µL. Stężenia PNA w ścieżkach od lewej do prawej to 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28 i 50 µM. PNA P3 nie wiąże się z rHP1 (panel górny), ale wiąże się z rHP2 (panel dolny). (C) Wyznaczenie Kd dla wiązania P3 z rHP2. Frakcję tworzenia tripleksu (Y) przedstawiono w funkcji stężenia PNA. Rycina została opracowana na podstawie publikacji31. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stabilność tripleksu i dupleksu DNA-RNA; widma fluorescencji; krzywe powinowactwa wiązania; dane spektroskopowe.
Rycina 6: Badanie miareczkowania fluorescencyjnego wiązania PNA P3 z RNA znakowanym 2-aminopuryną. Pozostałość 2-aminopuryny jest oznaczona jako '2' w sekwencji RNA. Bufor inkubacyjny to 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) Tripleks PNA·RNA2 utworzony pomiędzy P3 a dsRNA znakowanym 2-aminopuryną (dsRNA2-2AP). (B) Hipotetyczny dupleks PNA-RNA utworzony pomiędzy P3 a ssRNA znakowanym 2-aminopuryną (ssRNA2-2AP). (C, E) Widma emisji fluorescencji odpowiednio dla dupleksu RNA (1 µM) i ssRNA (1 µM) znakowanych 2-aminopuryną, przy zmiżnym stężeniu P3 w pH 7.5. Pik w okolicy 475 nm wynika ze słabej emisji fluorescencyjnej zasady L w PNA. (D, F) Wyznaczenie Kd na podstawie wykresów intensywności fluorescencji 2-aminopuryny (przy 370 nm) odpowiednio dla dupleksu RNA i ssRNA w funkcji stężenia PNA P3. Rycina została opracowana na podstawie referencji31. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stabilność dupleksu RNA; krzywe topnienia; wykres; oddziaływanie ssRNA1, P1-P5; analiza denaturacji termicznej.
Rycina 7: Wyniki topnienia termicznego dla dupleksów RNA-PNA. Bufor inkubacyjny to 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Wszystkie próbki zawierają 5 µM jednoniciowego RNA (ssRNA1) oraz PNA w 130 µL. (A) Jednoniciowe RNA (ssRNA1), PNA (P1, P2, P3, P4 i P5) oraz hipotetyczny dupleks PNA-RNA utworzony między PNA P3 a ssRNA1 w orientacji równoległej. Steryczna zawada jest zaznaczona dla par Q-G i L-G przypominających pary Watsona-Cricka. (B) Krzywe topnienia dla różnych PNA wiążących się z ssRNA1. Temperatury topnienia są podane dla krzywych z przejściami topnienia. Rycina została zaadaptowana z referencji31.

Dyskusja

Oligomery PNA wiążące dupleksowo (np. 10-mery) są cząsteczkami średniej wielkości, a zatem mogą wykazywać przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej po związaniu się z RNA o porównywalnym lub nieco większym rozmiarze (np. 50-merowym lub mniejszym). Jeśli RNA jest znacznie większe niż PNA, miareczkowanie PNA do RNA może nie działać z powodu ograniczonej zmiany ruchliwości żelu. W ten sposób duży RNA może zostać obcięty w przypadku niedenaturujących testów PAGE. Miareczkowanie dużego RNA do znakowanego fluoroforem PNA pozwala na monitorowanie tworzenia się tripleksu przez niedenaturujący żel agarozowy z próbką załadowaną w środku żelu40.

W eksperymencie miareczkowania za pomocą niedenaturującego PAGE ze stałym całkowitym stężeniem RNA, zwykle używamy nieznakowanego stężenia RNA 1 μM do efektywnego barwienia po barwieniu wolnego RNA i prążków triplex bromkiem etydyny. Stężenie RNA tak niskie, jak 0,2 μM może być również wystarczające w zależności od konstruktu RNA31. Stężenie nieznakowanego RNA (0,2 μM) określa, że wartości Kd, które można dokładnie zmierzyć, powinny wynosić około 0,2 μM lub więcej. W celu zwiększenia skuteczności barwienia można zastosować inne barwniki barwiące. Alternatywnie, nasze niepublikowane dane sugerują, że RNA znakowane barwnikiem Cy3 mogą być używane w eksperymentach PAGE bez denaturacji w celu pomiaru zdarzeń ścisłego wiązania.

Ze względu na fakt, że 2-aminopuryna jest tylko umiarkowanie fluorescencyjna, miareczkowanie fluorescencji 2-aminopuryny jest również ograniczone do pomiaru wiązania przy wartościach Kd bliskich lub wyższych niż 0,2 μM31. RNA lub PNA można znakować stosunkowo jasnym barwnikiem w celu ilościowego określenia stosunkowo ścisłego wiązania w roztworze poprzez miareczkowanie fluorescencyjne, jeśli wiązanie powoduje zmiany w sygnałach fluorescencyjnych 53,54,55.

Strategia celowania w struktury RNA przez PNA wiążące dsRNA została przetestowana dla ograniczonej liczby RNA. Jest prawdopodobne, że właściwości wiązania mogą się różnić w przypadku dsRNA o różnych sekwencjach i składach par zasad. Zawsze można wybrać bogate w puryny pasmo dupleksu do projektowania TFPNA. Bardzo ważne jest zrozumienie, w jaki sposób kolejne trójki Q·C-G mogą wpływać na stabilność trójki. Zdecydowanie potrzebne są bardziej obszerne badania zależne od sekwencji, aby zrozumieć zależne od sekwencji właściwości wiązania TFPNA.

Powinowactwo wiązania TFPNA można dodatkowo zwiększyć poprzez zwiększenie długości i/lub dalszą modyfikację zasad i szkieletów56,57 TFPNA. Jednak ciągły obszar dupleksu może często nie składać się z więcej niż 10 kolejnych par zasad bez zakłóceń spowodowanych przez struktury inne niż Watson-Crick. Można sprzężać TFPNA z małymi cząsteczkami w celu rozpoznania struktur innych niż Watson-Crick sąsiadujących z regionami dsRNA. Zasadniczo oczekuje się, że koniugat TFPNA-mała cząsteczka będzie miał zwiększone powinowactwo wiązania i specyficzność w porównaniu z samym TFPNA lub małą cząsteczką. Jednak właściwości chemiczne i fizyczne łącznika dla koniugacji 58,59,60,61,62,63,64 muszą zostać zoptymalizowane.

Fakt, że TFPNA mogą selektywnie wiązać się z dsRNA przez ssRNA i dsDNA, sugeruje, że możliwe jest opracowanie TFPNA jako bardzo użytecznych sond chemicznych i potencjalnych ligandów terapeutycznych poprzez regulację dynamiki strukturalnej RNA i interakcji z białkami i metabolitami. Wychwyt komórkowy TFPNA może być ułatwiony poprzez koniugację z ugrupowaniami penetrującymi komórkę, takimi jak małe cząsteczki, peptydy i nanocząstki, lub kompleksowanie ze strukturami supramolekularnymi, takimi jak liposomy 5,6,12,17,25,31,41,65,66 . Dalsza funkcjonalizacja TFPNA za pomocą znaczników bioobrazowania, takich jak fluorofory i radioizotopy, może ułatwić wykrywanie, obrazowanie i celowanie w funkcjonalne struktury RNA w organizmach żywych.

Oświadczenia

Złożono wniosek patentowy (PAT/179/14/15/PCT) oparty na opisanej tu pracy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Edukacji Singapuru (MOE) Tier 1 (RGT3/13 i RG42/15 do G.C.) oraz MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 i MOE2015-T2-1-028 do G.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sita molekularne, 4A, granulki o średnicy 1-2 mm Alfa Aesar87956
Chlorowodorek 4-metylobenzhydryloaminy (MBHAŸ HCl)Sigma-Aldrich532444
N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)Alfa AesarA11801
(Benzotriazol-1-yl-oksy)tripyrrolidinofosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)Alfa AesarB25251
Anhyryd octowySigma-Aldrich320102
Kaiser Test Kit Sigma-Aldrich60017
Kwas trifluorooctowy (TFA)Alfa AesarL06374
Niemodyfikowane monomery PNAASM Research Chemicals GmbH5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OHSigma-AldrichB8389 / 47624
TioanizolAlfaAesar A14846
1,2-EthanedithiolAlfa AesarL12865
Kwas trifluorometanosulfonowyAlfa AesarA10173
LiChrosper® 100 RP-18 z końcówką (5 &mikro; m) LiChroCART® 250-4Milipore150838
Oligonukleotydy RNA firmy Merck Sigma-AldrichDostosowane 
Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA)Sigma-Aldrich39468
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Alfa AesarJ15694
HEPES Lonza17-737E
AkrylamidSigma-AldrichA8887
N.N'-metylenobisakryloamidSigma-Aldrich 
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-rad161-0700
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Bio-rad161-0800
10X Bufor tris-boranu-EDTA (TBE), pH 8,31. bazaBUF-3010-10X1L
Glicerol Promega H5433
Bromek etydyny (10 mg/ml)Bio-rad 161-0433
Ogniwo o wysokiej precyzji (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)Hellma Analytics 105.250-QS
146072

Bibliografia

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3(2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3(2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1(2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8(2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139(2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kwas nukleinowy peptydowydwuniciowe RNAnieodtwarzaj ca elektroforeza w elu poliakrylamidowym PAGEfluorescencja 2 aminopurynyspektrofotometria UV Visanaliza MALDI TOFHPLC w fazie odwr conejeksperymenty z topnienia termicznegospinki RNAbarwienie bromkiem etydyny
Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.