Method Article

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

DOI:

10.3791/56221

⸱

September 21st, 2017

 ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA stają się ważnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi. W związku z tym istnieje ogromny potencjał w opracowywaniu sond chemicznych i ligandów terapeutycznych do rozpoznawania sekwencji i struktury RNA. Niedawno opracowano chemicznie modyfikowane oligomery peptydowych kwasów nukleinowych (PNA), które mogą rozpoznawać dupleksy RNA w sposób specyficzny dla sekwencji. PNA są stabilne chemicznie z neutralnym szkieletem podobnym do peptydu. PNA mogą być stosunkowo łatwo syntetyzowane za pomocą ręcznej metody syntezy peptydów w fazie stałej Boc-chemistry. PNA są oczyszczane za pomocą HPLC z odwróconą fazą, a następnie charakteryzowane są za pomocą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą czasu przelotu (MALDI-TOF). Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) bez denaturacji ułatwia obrazowanie powstawania tripleksów, ponieważ starannie zaprojektowane konstrukty dupleksowe wolnego RNA i tripleksy związane z PNA często wykazują różne szybkości migracji. Niedenaturujący PAGE z bromkiem etydyny po barwieniu jest często łatwą i pouczającą techniką charakteryzowania powinowactwa wiązania i specyficzności oligomerów PNA. Zazwyczaj wiele spinek do włosów RNA lub dupleksów z mutacjami pojedynczej pary zasad można wykorzystać do scharakteryzowania właściwości wiązania PNA, takich jak powinowactwo wiązania i swoistość. 2-aminopuryna jest izomerem adeniny (6-aminopuryny); intensywność fluorescencji 2-aminopuryny jest wrażliwa na lokalne zmiany środowiska strukturalnego i nadaje się do monitorowania tworzenia tripleksów z resztą 2-aminopuryny włączoną w pobliżu miejsca wiązania PNA. Miareczkowanie fluorescencyjne 2-aminopuryny można również wykorzystać do potwierdzenia selektywności wiązania zmodyfikowanych PNA w stosunku do ukierunkowanych dwuniciowych RNA (dsRNA) w stosunku do jednoniciowych RNA (ssRNA). Eksperymenty z topnieniem termicznym z detekcją absorpcji promieniowania UV pozwalają na pomiar stabilności termicznej dupleksów PNA-RNA i tripleksów PNA·RNA2. W tym miejscu opisano syntezę i oczyszczanie oligomerów PNA zawierających zmodyfikowane reszty oraz opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA stają się ważnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi, ze względu na ostatnie postępy w odkryciach roli RNA w regulacji i katalizie różnych procesów biologicznych1,2,3. Tradycyjnie, nici antysensowne były używane do wiązania się z ssRNA poprzez tworzenie dupleksu Watsona-Cricka3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Ostatnio kwasy nukleinowe peptydowe tworzące triplex (TFPNA) zostały zaprojektowane tak, aby wiązały się z dsRNA poprzez wiązania wodorowe Hoogsteena ( Rysunek 1) < sup class="xref">3,28,29. Regiony dsRNA są obecne w większości tradycyjnych RNA ukierunkowanych na antysens, w tym pre-mRNA i mRNA, pre- lub pri-miRNAs3 i wielu innych niekodujących RNA1,26,27. Celowanie w dsRNA poprzez tworzenie potrójnej helisy za pomocą TFPNA może być korzystne ze względu na jego specyfikę strukturalną i ma ogromny potencjał do wykorzystania w przywracaniu normalnych funkcji RNA, które są rozregulowane na przykład w chorobach.

Ostatnio opublikowana praca Rozners et al., oraz us3,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41, poinformował o wysiłkach zmierzających do poprawy selektywnego wiązania zmodyfikowanych TFPNA z dsRNA o zwiększonym powinowactwie. Opracowaliśmy metody syntezy racjonalnie zaprojektowanych monomerów PNA ( Rysunek 2), w tym monomeru tio-pseudoizocytozyny (L) 30 i modyfikowanego guanidyną monomeru 5-metylo cytozyny (Q)31. Dzięki różnym metodom charakterystyki biochemicznej i biofizycznej wykazaliśmy, że stosunkowo krótkie PNA (6-10 reszt) zawierające reszty L i Q wykazują lepsze rozpoznawanie par zasad Watsona-Cricka G-C i C-G odpowiednio w dsRNA. Ponadto, w porównaniu z niezmodyfikowanymi PNA, PNA zawierające reszty L i Q wykazują bardziej selektywne wiązanie w kierunku dsRNA w stosunku do ssRNA i dsDNA. Funkcjonalność guanidyny42 w bazie Q umożliwia PNA wejście do komórek HeLa31.

W naszym laboratorium syntetyzujemy PNA za pomocą manualnej chemii Boc (Boc lub t-Boc oznacza tert-butyloksykarbony (zobacz Rysunek 2) metoda syntezy peptydów w fazie stałej4. Synteza monomeru PNA z Boc jako grupą chroniącą aminy jest wygodna, ponieważ grupa Boc jest sterycznie mniej masywna w porównaniu z grupą chroniącą aminy fluorenylometylokoksykarbonylowe (Fmoc), co może być korzystne podczas sprzęgania monomeru PNA na stałym podłożu. Grupa Boc jest kwasolubna i może być łatwo usunięta na stałym podłożu przez 20-50% kwas trifluorooctowy (TFA) w dichlorometanie (DCM) podczas syntezy PNA. Do syntezy oligomerów PNA można zastosować zautomatyzowany syntezator peptydów; jednak do automatycznego syntezatora peptydów potrzebny jest 3-5-krotny nadmiar monomeru PNA. Ręczna synteza wymaga znacznie mniejszej ilości monomeru PNA (2-3-krotny nadmiar), a każde sprzężenie jest łatwo monitorowane przez Kaiser test43. Co więcej, wiele automatycznych syntezatorów nie jest kompatybilnych z syntezą strategii Boc ze względu na użycie TFA na etapie usuwania Boc.

Oligomery PNA mogą być oczyszczone za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC), a następnie charakterystyki masy cząsteczkowej za pomocą MALDI-TOF (Rysunki 3 i 4)30,31. Używamy niedenaturującego PAGE do monitorowania powstawania triplexów, ze względu na fakt, że wolne dupleksowe konstrukty RNA i tripleksy związane z PNA często wykazują różne wskaźniki migracji (Rysunek 5)30,31. Znakowanie nie jest potrzebne, jeśli można uzyskać skuteczne barwienie końcowe zarówno dla potrójnych pasm dupleksu RNA, jak i PNA·RNA2. Do eksperymentów PAGE bez denaturacji potrzebna jest stosunkowo niewielka ilość próbki. Jednak ładujące (inkubacyjne) i bieżące (pH 8,3) mogą nie być takie same, co powoduje, że pomiary są ograniczone do stabilnych kinetycznie tripleksów, ponieważ stosunkowo wysokie pH 8,3 może znacznie zdestabilizować tripleks.

2-aminopuryna jest izomerem adeniny (6-aminopuryny); intensywność fluorescencji 2-aminopuryny (z pikiem emisji około 370 nm) jest wrażliwa na lokalne zmiany środowiska strukturalnego i jest odpowiednia do monitorowania tworzenia się triplex z resztą 2-aminopuryny włączoną w pobliżu miejsca wiązania PNA (Rysunek 6)31. W przeciwieństwie do wielu innych barwników, które wykazują emisję fluorescencji w zakresie widzialnym, RNA znakowane 2-aminopuryną można wystawić na działanie światła pokojowego bez wybielania fotograficznego. W przeciwieństwie do eksperymentu PAGE, w którym często potrzebny jest bufor o pH 8,3, miareczkowanie fluorescencyjne oparte na 2-aminopurynie pozwala na pomiar wiązania w jednym roztworze przy określonym pH, a tym samym może pozwolić na pomiar i wykrycie stosunkowo słabego i kinetycznie niestabilnego wiązania w stanie równowagi.

Eksperymenty termicznego topnienia z wykrytą absorbancją-UV pozwalają na pomiar stabilności termicznej dupleksów (Rysunek 7)31 i triplexes30,32,44,45. W zależności od długości i składu sekwencji, topnienie tripleksów może, ale nie musi, wykazywać wyraźne przejście. Parametry termodynamiczne można uzyskać, jeżeli krzywe ogrzewania i chłodzenia nakładają się na siebie. Dokładne parametry termodynamiczne można uzyskać za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC)32; jednak do celów ITC na ogół wymagane są stosunkowo duże ilości próbek.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ręczna synteza peptydów PNA w fazie stałej przy użyciu chemii Boc

UWAGA: Dla powodzenia i łatwości pożądanej syntezy oligomerów PNA, wszystkie rozpuszczalniki i odczynniki powinny być bezwodne. Dodaj odpowiednie sita molekularne (4A, granulki o średnicy 1-2 mm) i od czasu do czasu przetrzymuj suchy azot do butelek. Do syntezy zmodyfikowanych monomerów PNA można użyć zgłoszonych protokołów w odpowiednich odniesieniach30,31. Niemodyfikowane monomery PNA można kupić ze źródeł komercyjnych. Na każdym z etapów płukania do żywicy dodaje się odpowiednią ilość rozpuszczalnika, tworząc zawiesinę, zanim zostanie ona spuszczona.

  1. Ładowanie pierwszego monomeru i zamykanie nadmiaru wolnych amin pierwszorzędowych na żywicy
    1. Odważyć 30 mg żywicy polistyrenowej z chlorowodorku 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA·HCl) (dostępnej w handlu; wartość obciążenia 0,7-1,4 mmol/g; rozmiar oczek 100-200) i przenieść do 5 ml naczynia reakcyjnego peptydu w fazie stałej, wyposażonego w zawór odcinający i szklany korek.
    2. Namocz żywicę w odpowiedniej ilości DCM przez 1 godzinę, pozwalając żywicy spęcznieć i odsłonić aminy (sól HCl).
      UWAGA: Kulki żywiczne powinny być zawsze całkowicie zanurzone w rozpuszczalnikach podczas całej syntezy.
    3. Opróżnić DCM, stosując delikatny przepływ suchego azotu gazowego przez górną część kolby. Dodaj 1 ml 50% (v/v) N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) do DCM i pozostaw na 15 minut. To neutralizuje sól HCl przyłączoną do wolnych amin na żywicy.
    4. Powtórz krok 1.1.3. W międzyczasie odważyć 6 μmol monomeru i 6 μmol (benzotriazol-1-yl-oksy)tripirolidinofosfoniowego heksafluorofosforanu (PyBOP) i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 μl dimetyloformamidu (DMF) i 12 μmol DIPEA. Wirować roztwór sprzęgający przez 3-5 minut
      UWAGA: Żądana wartość obciążenia to 0,2 mmol/g. Pierwszym dodanym monomerem jest monomer na C-końcu żądanej sekwencji PNA. Wartość obciążenia pierwszego aminokwasu można obliczyć metodą kwasu pikrynowego46.
    5. Odcedzić DIPEA z roztworu DCM. Umyj żywicę za pomocą DCM (x 3), a następnie DMF (x 3) i zamknij kurek. Dodaj przygotowany roztwór sprzęgający do żywicy i delikatnie wstrząśnij. Wepchnąć żywicę wzdłuż wewnętrznych ścianek naczynia do roztworu sprzęgającego za pomocą czystej szpatułki ze stali nierdzewnej. Założyć szklany korek i zabezpieczyć naczynie w wytrząsarce inkubatora przez 3 godziny w temperaturze 40 °C.
      UWAGA: Alternatywnie, naczynie reakcyjne może być utrzymywane w stabilnej temperaturze pokojowej przez 6-8 godzin, aby umożliwić zakończenie reakcji sprzęgania peptydów.
    6. Przygotować roztwór zamykający, mieszając 240 μmol bezwodnika octowego i 360 μmol DIPEA z 200 μl DCM. Spuść roztwór sprzęgający i przemyj żywicę DMF (x 3) i DCM (x 3). Dodaj roztwór zamykający i pozostaw naczynie na 30 minut, od czasu do czasu delikatnie potrząsając naczyniem. Zamykanie maskuje nadmiar wolnych pierwszorzędowych grup aminowych na żywicach poprzez acetylację.
    7. Powtórz krok 1.1.6. Odcedź roztwór zamykający i umyj żywicę DCM (x 3).
    8. Usuń małą porcję kulek żywicy za pomocą cienkiej rurki kapilarnej i umieść je w małej szklanej fiolce o pojemności 1,5 ml. Wykonaj test Kaisera43. Dodać 15 μl każdego z roztworów testowych Kaisera do szklanej fiolki i podgrzać za pomocą opalarki. Obserwuj kolor koralików po podgrzaniu. Kolor koralików powinien pozostać niezmieniony, co wskazuje na brak wolnych grup aminowych na żywicy.
      UWAGA: Zestaw testowy Kaiser jest dostępny na rynku lub może być przygotowany zgodnie z zgłoszonym protokołem. Roztwór A: ninhydryna w etanolu; roztwór B: fenol w etanolu; roztwór C: cyjanek potasu (KCN) w pirydynie.
      UWAGA: KCN jest wysoce toksyczny; Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, a ogrzewanie powinno odbywać się w dobrze wentylowanym dygestorium, przy braku łatwopalnych rozpuszczalników lub odczynników.
    9. Powtórz krok 1.1.6, jeśli kulki żywicy mają niebieski lub słaby niebieski kolor.
  2. Usunięcie N-końcowej grupy ochronnej między aminami
    1. Opróżnić rozpuszczalniki z naczynia reakcyjnego i dodać roztwór 50% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA) w DCM, upewniając się, że żywice są całkowicie zanurzone. Pozostawić naczynie na 15 minut, od czasu do czasu wstrząsając, aby ułatwić deprotekcję grup aminowych. Powtórz jeszcze 2 cykle.
      UWAGA: TFA jest silnie. Podczas obchodzenia się z nią należy nosić odpowiednią odzież ochronną.
    2. Umyj żywicę za pomocą DCM (x 3), DMF (x 3) i DCM (x 3). Dodaj roztwór 5% DIPEA do DCM. Pozostaw naczynie na 15 minut. Ten etap aktywuje wolne aminy poprzez neutralizację anionów przeciw TFA. Powtórz jeszcze raz.
    3. Wypłucz DIPEA z roztworu DCM. Umyj żywicę za pomocą DCM (x 3). Wykonaj test Kaisera (krok 1.1.8).
      UWAGA: Skuteczna deprotekcja grup amin spowoduje niebieskie przebarwienia kulek. Gdy deprotekcja zakończy się sukcesem, można przeprowadzić późniejsze sprzęganie monomerów przez sprzężenie peptydowe.
  3. Sprzężenie kolejnych monomerów
    1. Odważyć 18 μmol pożądanego monomeru (dla monomeru Boc-PNA-Q-OH waży się 13,2 mg monomeru) i 18 μmol PyBOP do probówki o pojemności 1,5 ml. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać 200 μl DMF i 36 μmol DIPEA. Wirować, aż wszystkie związki stałe się rozpuszczą.
    2. Umyj żywicę za pomocą DKZ (x 3). Dodać roztwór sprzęgający do naczynia reakcyjnego i delikatnie wstrząsnąć. Wepchnąć żywicę wzdłuż wewnętrznych ścianek naczynia do roztworu sprzęgającego za pomocą czystej szpatułki ze stali nierdzewnej. Założyć szklany korek i zabezpieczyć naczynie w wytrząsarce inkubatora przez 3 godziny w temperaturze 40 °C.
    3. Spuść roztwór sprzęgający i przemyj żywicę DMF (x 3) i DCM (x 3). Wykonaj krok 1.1.8. Jeśli kolor koralików pozostaje niezmieniony, powtarzaj kroki 1.2.1-1.3.3, aż żądana sekwencja PNA zostanie zakończona. Jeżeli po sprzężeniu monomeru obserwuje się niebieskie przebarwienie kulek, należy powtórzyć kroki 1.3.1-1.3.3. Jeśli przebarwienia nadal się utrzymują, ponownie wykonaj zaślepianie (krok 1.1.6).
      UWAGA: W przypadku wystąpienia problemów ze sprzężeniem zaleca się wydłużenie czasu sprzęgania (3-12 h) i/lub użycie nadmiaru równoważnika monomeru i odczynników sprzęgających.
    4. Po zakończeniu żądanej sekwencji PNA umyj żywicę za pomocą DMF (x 3) i DCM (x 3). Całkowicie wysuszyć żywicę, stosując ciągły przepływ suchego azotu przez 15 minut. Ta sucha żywica może być rozszczepiona i użyta do przyłączenia lizyny lub znacznika fluorescencyjnego, takiego jak cyjanina 3 (Cy3) i karboksyfluoresceina na N-końcu PNA.
  4. Przyłączenie lizyny lub znacznika fluorescencyjnego (Cy3, Cy5 lub karboksyfluoresceiny) do N-końca PNA
    1. Odważyć 10 mg żywicy, wstępnie załadowanej żądaną sekwencją PNA. Przenieść do naczynia reakcyjnego o pojemności 5 ml. Namocz żywicę w DCM przez 1 godzinę.
    2. W celu przyłączenia lizyny należy wykonać kroki 1.2.1-1.3.3, zastępując monomer Boc-Lys(Z)-OH lub Fmoc-Lys(Boc)-OH.
    3. W celu przyłączenia karboksyfluoresceiny należy wykonać czynności 1.2.1-1.3.3 z 10-krotnym nadmiarem 5(6)-karboksyfluoresceiny jako monomeru oraz N,N'-diizopropylokarbodiamidu (DIPC) i hydroksybenzotriazolu (HOBt) jako odczynników sprzęgających w DMF. Pozostawić reakcję sprzęgania na noc w wytrząsarce inkubatora w temperaturze 40 °C.
      UWAGA: Ponieważ karboksyfluoresceina jest wrażliwa na światło, naczynie reakcyjne należy przykryć folią aluminiową.
    4. W celu przyłączenia barwnika Cy3 lub Cy5 oznaczyć metodą chemii klikającej, wykonać kroki 1.2.1-1.3.3, zastępując monomer N-Boc-2-propargilo-L-glicyną. To funkcjonalizuje N-koniec PNA za pomocą grupy alkinowej. Wykonaj reakcję kliknięcia katalizowaną miedzią, aby dołączyć barwnik fluorescencyjny Cy3 lub Cy5 zawierający azydek 12,47,48,49
  5. Rozszczepienie PNA z solidnego podparcia, oczyszczenia i charakteryzacji
    UWAGA: Jeśli jakakolwiek grupa aminowa jest chroniona grupą ochronną Fmoc, najpierw należy zdeprotect grupę aminową poprzez traktowanie 20% piperdyną w roztworze DMF przez 15 minut (2 cykle). Dokładnie umyj żywicę za pomocą DMF (x 3), a następnie DCM (x 3). Całkowicie wysuszyć żywicę, stosując ciągły przepływ suchego azotu przez 15 minut.
    1. Przenieść 5 mg suchej żywicy do małej fiolki. Dodać 10 μl tioanizolu i 4 μl 1,2-etaneditiolu, upewniając się, że żywica jest zanurzona w odczynnikach. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 5 min.
      UWAGA: Odczynniki te działają jak zmiatacze, które zatrzymują reaktywne formy kationowe, które powstają podczas usuwania grup ochronnych w PNA. Odpowiednie zmiatacze można wybrać na podstawie grup zabezpieczających łańcuch boczny.
    2. Dodaj 100 μl TFA do probówki zawierającej żywicę i zmiatacze. Delikatnie zmieszać mieszaninę i poddać krótkiemu odwirowaniu. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 10 min.
      UWAGA: TFA jest silnie. Podczas obchodzenia się z nią należy nosić odpowiednią odzież ochronną.
    3. Ostrożnie dodać 20 μl kwasu trifluorometanosulfonowego (TFMSA) do probówki. Delikatnie wymieszać mieszaninę reakcyjną przed poddaniem ją krótkiemu wirowaniu w temperaturze pokojowej. Pozostaw probówkę stabilną w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
      UWAGA: TFMSA jest silnie. Podczas obchodzenia się z nią należy nosić odpowiednią odzież ochronną.
    4. Odfiltrować koktajl z dekoltu do kolby okrągłodennej o pojemności 5 ml (RBF) za pomocą szklanej pipety Pasteura wyposażonej w bawełnę. Użyj niewielkiej ilości TFA do umycia żywicy.
    5. Przedmuchiwać suchy azot gazowy do zebranego filtratu, aż wszystkie lotne rozpuszczalniki zostaną odparowane. Dodać 1 ml zimnego eteru dietylowego do RBF.
      UWAGA: Eter dietylowy spowoduje wytrącanie się PNA.
      1. Przepłukać RBF eterem dietylowym kilka razy przed przeniesieniem mętnego roztworu do probówki o pojemności 1,5 ml. Poddać probówkę odwirowaniu, aby osad PNA mógł się wytrącić. Zdekantować rozpuszczalniki i dodać do osadu 300-500 μl autoklawizowanej wody. Dokładnie wymieszaj, aby rozpuścić PNA.
    6. Oczyść surową próbkę PNA za pomocą RP-HPLC, używając wody z acetonitrylem-0,1% TFA jako fazą ruchomą. Zebrać odpowiednie frakcje, odparować wszystkie rozpuszczalniki za pomocą koncentratora próżniowego przed ponownym rozpuszczeniem oczyszczonego PNA w wodzie w autoklawie.
    7. Scharakteryzować oczyszczony PNA za pomocą analizy MALDI-TOF przy użyciu kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) jako matrycy krystalizacji próbki.
    8. Zmierzyć absorbancję promieniowania UV (260 nm) PNA w temperaturze 65 °C. Obliczyć stężenie PNA za pomocą równania:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Tutaj c to stężenie, A to uzyskany odczyt absorbancji, ε to współczynnik ekstynkcji sekwencji RNA, a l to długość ścieżki optycznej kuwety (1 cm). Współczynnik ekstynkcji sekwencji PNA jest sumą współczynnika ekstynkcji poszczególnych monomerów50. Współczynniki ekstynkcji adeniny, cytozyny, guaniny i tyminy wynoszą odpowiednio 15,4, 7,3, 11,7 i 8,8 ml/μmol·cm. Zakłada się, że współczynnik ekstynkcji zastosowanych monomerów L i Q jest taki sam jak w przypadku zasady cytozyny (C).

2. STRONA niedenaturująca

  1. Przygotowanie wymaganych roztworów buforowych
    1. Przygotować bufor inkubacyjny (10 ml) przy użyciu 116,88 mg NaCl (200 mM), 50 μl 100 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 mM), 200 μl 1M podstawowego HEPES (20 mM), 9,75 m H2O; dostosować bufor do pH 7,5.
    2. Przygotować 1x bufor do biegania Tris-Borate-EDTA (TBE) (1 L) używając 100 ml 10x Tris-Borate-EDTA o pH 8,3 i 900 ml H2O.
    3. Przygotować 10% roztwór nadsiarczanu amonu (APS) (300 μl), używając 30 mg nadsiarczanu amonu i 300 μlH2O.
  2. Przygotowanie 12% żelu poliakryloamidowego
    1. Wyczyść dobrze formujący się grzebień, szklane płytki odlewane i przekładki etanolem; dobrze formujący się grzebień i przekładki mają grubość 1 mm. Ustawić zespół żelu i uszczelnić za pomocą żelowej taśmy uszczelniającej.
    2. W przypadku żelu poliakrylamidowego o wymiarach 22 cm x 16,5 cm x 1 mm wystarczy 50 ml roztworu żelu. Odważyć 5,7 g akrylamidu i 0,3 g N,N'-metylenobisakryloamidu (19:1) i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Akrylamid jest rakotwórczy. Unikaj wdychania oparów pyłu akrylowego i upewnij się, że podczas obsługi nosi się odpowiednią odzież ochronną.
    3. Rozpuść związki stałe w 50 ml 1X TBE bufor do biegania, umieszczając probówkę wirówkową w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 15 minut lub do momentu, gdy wszystkie związki stałe się rozpuszczą. Przeprowadzić wirowanie (3 000 obr./min, 5 min, 25 °C) w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza z roztworu. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    4. Dodać 250 μl 10% roztworu APS i 50 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu żelu i delikatnie wymieszać za pomocą szpatułki. Natychmiast wlej roztwór między szklane płytki, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Włóż dobrze formujący się grzebień i pozostaw żel w temperaturze pokojowej na co najmniej 60 minut, aby umożliwić polimeryzację, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Przygotowanie próbek
    1. Usuń wymaganą ilość spinki do włosów RNA (1 μM) z głównego zapasu do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć roztwór RNA za pomocą koncentratora próżniowego.
      UWAGA: Każda próbka zawiera 1 μM RNA w 20 μl buforze do inkubacji. Zazwyczaj do jednego eksperymentu PAGE przygotowuje się 13 próbek RNA. RNA dla wszystkich próbek można przygotować razem w jednej probówce.
    2. Usunąć wymagane objętości docelowego PNA (o końcowym stężeniu do 50 μM) z głównego zapasu i przenieść do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Odparować wodę z roztworów PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    3. Dodać 260 μl buforu inkubacyjnego do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej wysuszone RNA i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że cały RNA został rozpuszczony. Poddaj RNA szybkiemu schłodzeniu: Umieść probówkę w bloku grzewczym (podgrzanym do 95 °C) na 5 minut. Natychmiast przenieś do łaźni lodowej i pozostaw na 10 minut.
    4. Dodać 20 μl RNA do każdej z 1,5 ml probówek zawierających suszone PNA i dokładnie wymieszać. Wykonać wyżarzanie: Umieścić probówkę zawierającą mieszaninę RNA i PNA w bloku grzewczym (podgrzanym do 65 °C) na 10 minut. Wyłącz zasilanie bloku grzewczego i pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Bieganie i przetwarzanie żelu
    1. Usuń żelową taśmę uszczelniającą ze spodniej strony szklanej płytki. Zamontuj i przymocuj szklaną płytkę do pionowego stojaka na żel za pomocą plastikowych clamps.
      UWAGA: Działanie żelu odbywa się w chłodni w temperaturze około 4 °C. Wszystkie urządzenia, próbki i są schładzane w temperaturze 4 °C przed uruchomieniem żelu.
    2. Napełnij dolny zbiornik buforowy buforem roboczym 1x TBE, aż płyta zostanie zanurzona w około 1-2 cm bufora roboczego. Napełnij górny zbiornik buforowy buforem bieżącym do momentu, gdy poziom bufora przekroczy górną część żelu o 1-2 cm. Powoli i delikatnie wyjmij dobrze formujący się grzebień, pozwalając pracującemu buforowi wypełnić studzienki.
    3. Podłącz stojak na żel do zasilania. Uruchom żel przez co najmniej 30 minut przy stałym napięciu 250 V, które jest zoptymalizowane dla żelu o wymiarach 22 cm x 16,5 cm x 1 mm.
    4. W międzyczasie dodaj 4 μl (20% objętości próbki) 35% roztworu glicerolu do każdej z próbek i delikatnie wymieszaj. Po zakończeniu cyklu wstępnego ostrożnie załadować 20 μl każdej próbki (w tym jedną próbkę samego RNA oraz próbki zawierające mieszaninę RNA i PNA) na dno studzienki za pomocą mikropipety i końcówek ładujących żel, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Uruchom żel przy stałym napięciu 250 V, podobnie jak w przypadku uruchomienia wstępnego, przez 5 godzin.
    5. Po 5 godzinach wyłącz zasilanie i zdejmij szklaną płytkę ze stojaka. Usuń pozostałą żelową taśmę uszczelniającą i zdemontuj szklaną płytkę. Delikatnie wyjmij żel i zanurz go w pojemniku wypełnionym 350 ml wody dejonizowanej. Ostrożnie dodać 35 μl bromku etydyny (10 mg/ml) i umieścić pojemnik na wytrząsarce platformowej (niska prędkość) na 30 min.
      UWAGA: Bromek etydyny jest substancją mutagenną. Podczas obchodzenia się z nią należy nosić odpowiednią odzież ochronną.
    6. Roztwór bromku etydyny należy wyrzucić do przeznaczonego do tego pojemnika na odpady. Żel spłukać 1,5 - 2 litrami wody destylowanej. Zeskanuj żel za pomocą imagera (patrz tabela materiałów) z zielonym laserem o długości fali 532 nm i filtrem emisyjnym ustawionym na 610 nm.
  5. Analiza żelu
    1. Określ ilościowo intensywność opaski żelowej za pomocą darmowego oprogramowania GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normalizuj intensywność pasma według:
      figure-protocol-2
      UWAGA: Tutaj Iduplex max to intensywność pasma samej spinki do włosów RNA bez dodatku PNA, a Itriplex max to intensywność pasma triplex z najwyższym stężeniem dodanego PNA.
      1. Oblicz frakcję formacji triplex według:
        figure-protocol-3
    2. Wykreślić frakcję formacji triplex (Y) w stosunku do stężenia dodanego PNA (μM). Dopasuj dane do równania, aby uzyskać stałą dysocjacji (Kd):
      figure-protocol-4
      UWAGA: Tutaj R0 to stężenie RNA spinki do włosów (1 μM). Tutaj Y0 i B są odpowiednio początkową i maksymalną zmianą ułamka potrójnego. Y jest frakcją tripleksu przy zróżnicowanym stężeniu PNA. X jest całkowitym stężeniem PNA, a Kd jest stałą dysocjacji.

3. Test wiązania fluorescencji 2-aminopuryny

  1. Przygotowanie próbek (zawierających dsRNA)
    1. Usuń wymaganą ilość dsRNA znakowanego 2-aminopuryną (2AP) (1 μM dla każdej nici) z głównego materiału do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Odparować wodę w roztworach RNA za pomocą koncentratora próżniowego.
      UWAGA: Każda próbka zawiera 1 μM RNA w 75 μL buforze do inkubacji. Zazwyczaj przygotowuje się 13 próbek RNA. RNA dla wszystkich próbek można przygotować razem w jednej probówce.
    2. Usunąć wymagane objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z głównego materiału wyjściowego i przenieść do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Odparować wodę z roztworów PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    3. Dodać 975 μl buforu inkubacyjnego do 1,5 ml probówki zawierającej suszone RNA i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że całe RNA zostało rozpuszczone. Krótko odwirować roztwór RNA i poddać go wyżarzaniu: Umieścić probówkę w bloku grzewczym (podgrzanym do 95 °C) na 10 minut. Wyłącz zasilanie bloku grzewczego i pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej.
    4. Dodać 75 μl RNA do każdej z 1,5 ml probówek zawierających suszone PNA i dokładnie wymieszać. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na co najmniej 1 godzinę. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Przygotowanie próbek (zawierających ssRNA)
    1. Usuń wymaganą ilość ssRNA znakowanego 2AP (1 μM) z głównego zapasu do czystych probówek o pojemności 1,5 ml. Ekstrahować wymagane objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z głównego materiału wsadowego i przenieść do odpowiednich probówek o pojemności 1,5 ml zawierających ssRNA. Wysuszyć mieszaninę RNA i PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    2. Dodać 75 μl buforu inkubacyjnego do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać. Poddać mieszaninę wyżarzaniu: Umieścić rurkę w bloku grzewczym (podgrzanym do 95 °C) na 10 minut. Wyłącz zasilanie i pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Pomiar i analiza
    1. Użyj spektrofotometru fluorescencyjnego, aby zmierzyć emisję w zakresie długości fal 330-550 nm. Użyj długości fali wzbudzenia 303 nm.
      UWAGA: Próbki są mierzone w temperaturze pokojowej, a każda próbka jest mierzona 3 razy, w których pobierana jest średnia.
    2. Przenieść 70 μl buforu inkubacyjnego do kuwety o średnicy 1 cm. Rozpocznij pomiar.
    3. Wyjmij bufor z kuwety. Opłucz kuwetę wodą destylowaną i usuń azot do wyschnięcia. Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek. Odejmij pomiary bufora od wszystkich próbek.
    4. Wykreślić intensywność fluorescencji (j.a.) w stosunku do długości fali (nm). Zapisać intensywność fluorescencji przy długości fali 370 nm dla wszystkich próbek. Wykreślić intensywność fluorescencji przy 370 nm (j.a.) w stosunku do odpowiedniego stężenia dodanego PNA (μM).
    5. Dopasuj dane do równania z kroku 2.5.2, aby uzyskać stałą dysocjacji (Kd): Y = Y0 + (B/(2R0))(R0 + X + Kd- ((R0 + X + Kd)2- 4R0X)1/2), gdzie R0 oznacza stężenie dsRNA znakowane 2AP (1 μM).
      UWAGA: Tutaj Y0 i B to początkowa i maksymalna zmiana intensywności fluorescencji odpowiednio przy 370 nm. Y oznacza intensywność fluorescencji przy 370 nm przy zróżnicowanym stężeniu PNA. X jest całkowitym stężeniem PNA, a Kd jest stałą dysocjacji.

4. Eksperymenty termicznego topnienia z wykrytą absorbancją UV

  1. Przygotowanie próbek
    UWAGA: Zmierz absorbancję UV (260 nm) RNA w temperaturze 95 °C (aby upewnić się, że struktury drugorzędowe RNA są rozerwane). Oblicz stężenie RNA za pomocą równania:
    figure-protocol-5
    gdzie c jest stężeniem, A jest uzyskanym odczytem absorbancji, ε jest współczynnikiem ekstynkcji sekwencji RNA, a l jest długością drogi optycznej kuwety (1 cm). Współczynnik ekstynkcji RNA jest obliczany na podstawie modelu najbliższego sąsiada przy użyciu MeltWin51,52. Pakiet programu może być dostarczony na życzenie.
    1. Usunąć wymaganą ilość ssRNA (5 μM) z głównego zapasu do czystych probówek o pojemności 1,5 ml. Usunąć wymagane objętości docelowego PNA (5 μM) z głównego materiału i przenieść do odpowiednich probówek o pojemności 1,5 ml zawierających ssRNA. Wysuszyć mieszaninę RNA i PNA za pomocą koncentratora próżniowego.
    2. Dodać 130 μl buforu inkubacyjnego do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml i dokładnie wymieszać. Poddać mieszaninę wyżarzaniu: Umieścić rurkę w bloku grzewczym (podgrzanym do 95 °C) na 10 minut. Wyłącz zasilanie i pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Pomiar i analiza
    1. Za pomocą spektrofotometru UV-Vis zmierzyć absorbancję przy długości fali 260 nm przy użyciu kuwety składającej się z 8 mikrokomórek o długości drogi 1 cm. Zmierzyć absorbancję próbek przy wzroście temperatury od 15 do 95 °C, a następnie spadku temperatury z 95 do 15 °C z szybkością narastania 0,5 °C/min.
    2. Przenieść 130 μl próbki do każdej studzienki, upewniając się, że w jednej studzience znajduje się bufor inkubacyjny. Rozpocznij pomiar. Powtórz w razie potrzeby.
    3. Znormalizować wartości absorbancji przy odczycie wysokiej temperatury znormalizowanej do jedności i wykreślić znormalizowany odczyt absorbancji w funkcji temperatury (°C). Wykreśl pierwszą pochodną krzywych. Temperatury topnienia należy uzyskać, dopasowując pierwsze krzywe pochodne do funkcji Gaussa.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HPLC z odwróconymi fazami umożliwia oczyszczanie oligomerów PNA. Możemy otrzymać czyste oligomery PNA za pomocą dwóch rund oczyszczania HPLC (Rysunek 3). Tożsamość PNA można potwierdzić za pomocą analizy MALDI-TOF (Rysunek 4).

Niedenaturująca STRONA to łatwa i pouczająca technika charakteryzowania powinowactwa wiązania i specyfiki oligomerów PNA. Zazwyczaj używamy wielu spinek do włosów RNA lub dupleksów z mutacjami pojedynczej pary zasad, aby scharakteryzować właściwości wiązania (Rysunek 5). Niedenaturujące dane PAGE pokazane w Rysunek 5 wyraźnie sugerują, że zmodyfikowany Q- i L PNA może rozpoznać region dsRNA z parą C-G (Rysunek 5B, dolny panel), ale nie ten bez pary C-G ( Rysunek 5B, górny panel). To specyficzne i wzmocnione rozpoznanie odbywa się poprzez potrójną (Rysunek 1 A, C, D) potrójną zasadę T·A-U, L·G-Ci Q·C-G PNA·RNA 2). Różne PNA z pojedynczą lub wielokrotną mutacją mogą być również używane do wykazania ulepszonych właściwości wiązania zmodyfikowanego PNA. Wykazaliśmy, że dodanie 2 mM Mg2+ do bufora inkubacyjnego nie wpływa znacząco na wiązanie31.

Wykazaliśmy za pomocą miareczkowania fluorescencji 2-aminopuryny, że PNA modyfikowany Q i L wiąże się z docelowym regionem dsRNA (Rysunek 6A, 6C, 6D), ale nie ssRNA (Rysunek 6B, 6E, 6F). PNA P3 wiąże się z dsRNA znakowanym 2-aminopuryną o wartości Kd 0,8 ± 0,1 μM. Intensywność fluorescencji przy 370 nm dla ssRNA znakowanego 2-aminopuryną pozostaje względnie stała przy zróżnicowanym stężeniu P3, co wskazuje na brak wiązania PNA P3 z ssRNA.

PNA zawierające reszty Q (P2 i P3) nie wykazują przemian termicznych topnienia (Rysunek 7), co sugeruje brak wiązania z ssRNA. Wynika to ze sterycznego zderzenia obecnego w parze Q-G Watsona-Cricka. W porównaniu z niezmodyfikowanymi PNA P1, PNA P4 i P5 zawierające zmodyfikowane reszty L, ale bez reszt Q, wykazują obniżone temperatury topnienia dla odpowiadających im dupleksów RNA-PNA z powodu zderzenia sterycznego obecnego w parze L-G podobnej do Watsona-Cricka. Dane dotyczące topnienia termicznego wykrytego przez absorbancję UV są zgodne z danymi miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryny, które pokazują również, że PNA zawierające reszty Q i L nie wiąże się znacząco z ssRNA (Rysunek 6B, 6E, 6F). Włączenie zasady Q jest bardziej destabilizujące niż zasady L, ponieważ zasada Q ma bardziej znaczące zderzenie steryczne w tworzeniu pary Q-G podobnej do Watsona-Cricka (Rysunek 1F) w porównaniu z parą L-G podobną do Watsona-Cricka (Rysunek 1E).

figure-results-1
Rysunek 1: Struktury chemiczne stabilnych struktur trójzasadowych i niestabilnych par zasad. (A-D) Główny rowek PNA·RNA2 trójki zasad T·A-U (a), C+·G-C (B), L·G-C (C) i Q·C-G (d). (E, F) Niestabilne pary zasad Watsona-Cricka, takie jak PNA-RNA L-G (E) i Q-G (F). Litera R reprezentuje cukrowo-fosforanowy szkielet RNA. Wiązania wodorowe są oznaczone czarnymi przerywanymi liniami. Rysunek jest odtworzony z reference31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Struktury chemiczne monomerów PNA. Pokazano cztery monomery PNA (T, C, L i Q). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Struktura chemiczna oligomeru PNA i oczyszczanie za pomocą RP-HPLC. (A) Struktura chemiczna sekwencji PNA P3. (B, C) Dane RP-HPLC dotyczące surowego PNA P3 (B) i ponownie oczyszczonego PNA P3 (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Widmo MALDI-TOF oczyszczonego PNA P3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Sekwencje spinki do włosów RNA i PNA oraz charakterystyka wiązania przez niedenaturującą STRONĘ. (A) Spinki do włosów RNA (rHP1 i rHP2), PNA P3 i potrójny PNA·RNA2 utworzony między PNA P3 i rHP2. (B) Wyniki PAGE bez denaturacji (12%) dla wiązania rHP1 i rHP2 z PNA P3. Bufor inkubacyjny to 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Spinki do włosów załadowane RNA (rHP1 i rHP2) znajdują się na poziomie 1 μM w 20 μL. Stężenia PNA na pasach od lewej do prawej wynoszą 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28 i 50 μM. PNA P3 nie wiąże się z rHP1 (górny panel), ale wiąże się z rHP2 (dolny panel). (C) Oznaczanie Kd dla wiązania P3 z rHP2. Frakcję formacji triplex (Y) wykreślono w stosunku do stężenia PNA. Rysunek został zaadaptowany z reference31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Badanie miareczkowania fluorescencji wiązania PNA P3 z RNA znakowanymi 2-aminopuryną. Reszta 2-aminopuryny jest oznaczona jako "2" w sekwencji RNA. Bufor inkubacyjny to 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) Potrójny pna·RNA2 utworzony między P3 a dRNA znakowanym 2-aminopuryną dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) Hipotetyczny dupleks PNA-RNA utworzony między P3 a ssRNA znakowanym 2-aminopuryną (ssRNA2-2AP). (C, E) Widma emisji fluorescencji odpowiednio dla dupleksu RNA znakowanego 2-aminopuryną (1 μM) i ssRNA (1 μM), o zróżnicowanym stężeniu P3 przy pH 7,5. Szczyt przy około 475 nm jest spowodowany słabą emisją fluorescencji zasady L w PNA. (D, F) Oznaczanie Kd na podstawie wykresów intensywności fluorescencji 2-aminopuryny (przy 370 nm) odpowiednio dupleksu RNA i ssRNA w porównaniu ze stężeniem PNA P3. Rysunek został zaadaptowany z reference31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wyniki termicznego topnienia dla dupleksów RNA-PNA. Bufor do inkubacji to 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Wszystkie próbki zawierają 5 μM jednoniciowego RNA (ssRNA1) i PNA w 130 μL. (A) Jednoniciowe RNA (ssRNA1), PNA (P1, P2, P3, P4 i P5) oraz hipotetyczny dupleks PNA-RNA utworzony między PNA P3 i ssRNA1 w orientacji równoległej. Zderzenie steryczne jest wskazane dla par Watsona-Cricka, takich jak Q-G i L-G. (B) Krzywe topnienia dla różnych PNA wiążących się z ssRNA1. Temperatury topnienia są pokazane dla krzywych z przejściami topnienia. Rysunek został zaadaptowany z reference31.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligomery PNA wiążące dupleksowo (np. 10-mery) są cząsteczkami średniej wielkości, a zatem mogą wykazywać przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej po związaniu się z RNA o porównywalnym lub nieco większym rozmiarze (np. 50-merowym lub mniejszym). Jeśli RNA jest znacznie większe niż PNA, miareczkowanie PNA do RNA może nie działać z powodu ograniczonej zmiany ruchliwości żelu. W ten sposób duży RNA może zostać obcięty w przypadku niedenaturujących testów PAGE. Miareczkowanie dużego RNA do znakowanego fluoroforem PNA pozwala na monitorowanie tworzenia się tripleksu przez niedenaturujący żel agarozowy z próbką załadowaną w środku żelu40.

W eksperymencie miareczkowania za pomocą niedenaturującego PAGE ze stałym całkowitym stężeniem RNA, zwykle używamy nieznakowanego stężenia RNA 1 μM do efektywnego barwienia po barwieniu wolnego RNA i prążków triplex bromkiem etydyny. Stężenie RNA tak niskie, jak 0,2 μM może być również wystarczające w zależności od konstruktu RNA31. Stężenie nieznakowanego RNA (0,2 μM) określa, że wartości Kd, które można dokładnie zmierzyć, powinny wynosić około 0,2 μM lub więcej. W celu zwiększenia skuteczności barwienia można zastosować inne barwniki barwiące. Alternatywnie, nasze niepublikowane dane sugerują, że RNA znakowane barwnikiem Cy3 mogą być używane w eksperymentach PAGE bez denaturacji w celu pomiaru zdarzeń ścisłego wiązania.

Ze względu na fakt, że 2-aminopuryna jest tylko umiarkowanie fluorescencyjna, miareczkowanie fluorescencji 2-aminopuryny jest również ograniczone do pomiaru wiązania przy wartościach Kd bliskich lub wyższych niż 0,2 μM31. RNA lub PNA można znakować stosunkowo jasnym barwnikiem w celu ilościowego określenia stosunkowo ścisłego wiązania w roztworze poprzez miareczkowanie fluorescencyjne, jeśli wiązanie powoduje zmiany w sygnałach fluorescencyjnych 53,54,55.

Strategia celowania w struktury RNA przez PNA wiążące dsRNA została przetestowana dla ograniczonej liczby RNA. Jest prawdopodobne, że właściwości wiązania mogą się różnić w przypadku dsRNA o różnych sekwencjach i składach par zasad. Zawsze można wybrać bogate w puryny pasmo dupleksu do projektowania TFPNA. Bardzo ważne jest zrozumienie, w jaki sposób kolejne trójki Q·C-G mogą wpływać na stabilność trójki. Zdecydowanie potrzebne są bardziej obszerne badania zależne od sekwencji, aby zrozumieć zależne od sekwencji właściwości wiązania TFPNA.

Powinowactwo wiązania TFPNA można dodatkowo zwiększyć poprzez zwiększenie długości i/lub dalszą modyfikację zasad i szkieletów56,57 TFPNA. Jednak ciągły obszar dupleksu może często nie składać się z więcej niż 10 kolejnych par zasad bez zakłóceń spowodowanych przez struktury inne niż Watson-Crick. Można sprzężać TFPNA z małymi cząsteczkami w celu rozpoznania struktur innych niż Watson-Crick sąsiadujących z regionami dsRNA. Zasadniczo oczekuje się, że koniugat TFPNA-mała cząsteczka będzie miał zwiększone powinowactwo wiązania i specyficzność w porównaniu z samym TFPNA lub małą cząsteczką. Jednak właściwości chemiczne i fizyczne łącznika dla koniugacji 58,59,60,61,62,63,64 muszą zostać zoptymalizowane.

Fakt, że TFPNA mogą selektywnie wiązać się z dsRNA przez ssRNA i dsDNA, sugeruje, że możliwe jest opracowanie TFPNA jako bardzo użytecznych sond chemicznych i potencjalnych ligandów terapeutycznych poprzez regulację dynamiki strukturalnej RNA i interakcji z białkami i metabolitami. Wychwyt komórkowy TFPNA może być ułatwiony poprzez koniugację z ugrupowaniami penetrującymi komórkę, takimi jak małe cząsteczki, peptydy i nanocząstki, lub kompleksowanie ze strukturami supramolekularnymi, takimi jak liposomy 5,6,12,17,25,31,41,65,66 . Dalsza funkcjonalizacja TFPNA za pomocą znaczników bioobrazowania, takich jak fluorofory i radioizotopy, może ułatwić wykrywanie, obrazowanie i celowanie w funkcjonalne struktury RNA w organizmach żywych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożono wniosek patentowy (PAT/179/14/15/PCT) oparty na opisanej tu pracy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Edukacji Singapuru (MOE) Tier 1 (RGT3/13 i RG42/15 do G.C.) oraz MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 i MOE2015-T2-1-028 do G.C.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sita molekularne, 4A, granulki o średnicy 1-2 mm Alfa Aesar87956
Chlorowodorek 4-metylobenzhydryloaminy (MBHAŸ HCl)Sigma-Aldrich532444
N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)Alfa AesarA11801
(Benzotriazol-1-yl-oksy)tripyrrolidinofosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)Alfa AesarB25251
Anhyryd octowySigma-Aldrich320102
Kaiser Test Kit Sigma-Aldrich60017
Kwas trifluorooctowy (TFA)Alfa AesarL06374
Niemodyfikowane monomery PNAASM Research Chemicals GmbH5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OHSigma-AldrichB8389 / 47624
TioanizolAlfaAesar A14846
1,2-EthanedithiolAlfa AesarL12865
Kwas trifluorometanosulfonowyAlfa AesarA10173
LiChrosper® 100 RP-18 z końcówką (5 &mikro; m) LiChroCART® 250-4Milipore150838
Oligonukleotydy RNA firmy Merck Sigma-AldrichDostosowane 
Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA)Sigma-Aldrich39468
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Alfa AesarJ15694
HEPES Lonza17-737E
AkrylamidSigma-AldrichA8887
N.N'-metylenobisakryloamidSigma-Aldrich 
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-rad161-0700
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Bio-rad161-0800
10X Bufor tris-boranu-EDTA (TBE), pH 8,31. bazaBUF-3010-10X1L
Glicerol Promega H5433
Bromek etydyny (10 mg/ml)Bio-rad 161-0433
Ogniwo o wysokiej precyzji (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)Hellma Analytics 105.250-QS
146072

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).">Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).">Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).">Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).">Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).">Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).">Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3(2007).">Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3(2007).
  8. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3(2010).">Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3(2010).
  9. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).">Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).">Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1(2012).">Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1(2012).
  12. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).">Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).">Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).">Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).">Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).">Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).">Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).">Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).">Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).">Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).">Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).">Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).">Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).">Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).">Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).">Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).">Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).">Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8(2012).">Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8(2012).
  30. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).">Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).">Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).">Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).">Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).">Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).">Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).">Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).">Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).">Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).">Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).">Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).">Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).">Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).">Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).">Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).">Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).">Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139(2007).">Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139(2007).
  48. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).">Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).">Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).">Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).">Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).">McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).">Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).">Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).">Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).">Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).">Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).">Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).">Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).">Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).">Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).">Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).">Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).">Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).">Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).">Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptide Nucleic AcidDouble stranded RNANon denaturing PAGE2 Aminopurine FluorescenceUV Vis SpectrophotometryMALDI TOF AnalysisReverse phase HPLCThermal Melting ExperimentsRNA HairpinsEthidium Bromide Staining

Related Articles