Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56224

⸱

29 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

W tym artykule

Podsumowanie

Brak narzędzi do pomiaru właściwości materiału i parametrów rozciągania in vivo uniemożliwia walidację ich ról podczas rozwoju. Zastosowaliśmy mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie nanocząstek, aby określić ilościowo cechy mechaniczne nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Metody te są niezawodne i mają szerokie zastosowanie, unikając inwazyjnych interwencji.

Streszczenie

Wyjaśnienie czynników, które kierują czasoprzestrzenną organizacją ewoluujących tkanek, jest jednym z głównych celów badań nad rozwojem. Różne twierdzenia twierdzą, że wniosły ważny wkład w zrozumienie właściwości mechanicznych komórek i tkanek w ich organizacji czasoprzestrzennej w różnych procesach rozwojowych i morfogenetycznych. Jednak ze względu na brak wiarygodnych i dostępnych narzędzi do pomiaru właściwości materiałów i parametrów rozciągania in vivo, walidacja tych hipotez była trudna. W tym artykule przedstawiono metody wykorzystujące mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie cząstek w celu ilościowego określenia właściwości mechanicznych nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Epibolia jest wczesnym, konserwatywnym procesem rozwojowym, którego badanie jest ułatwione dzięki przezroczystości zarodka. Metody te są proste do wdrożenia, niezawodne i szeroko stosowane, ponieważ przezwyciężają natrętne interwencje, które mogą wpływać na mechanikę tkanek. Zastosowano prostą strategię montażu próbek, rejestracji AFM oraz wstrzykiwania i śledzenia nanocząstek. Takie podejście sprawia, że metody te można łatwo dostosować do innych okresów rozwoju lub organizmów.

Wprowadzenie

Fizyczne zasady leżące u podstaw biomechanicznej kontroli procesów morfogenetycznych są w dużej mierze niezdefiniowane. Podczas gdy badania biomechaniczne na poziomie molekularnym i komórkowym nabierają znacznego rozpędu, badanie parametrów biomechanicznych na poziomie tkanki/organizmu jest w powijakach. Regresja hydrodynamiczna1 lub Video Force Microscopy2 pozwalają badaczom rozróżniać siły czynne i pasywne, podczas gdy mikrochirurgia laserowa3, czyli mniej inwazyjna mikroskopia sił atomowych (AFM) zdysocjowanych komórek4 lub in vivo5 lub mikroreologia nanocząstek6 pozwalają na przewidywanie właściwości mechanicznych i reakcji tkanki.

AFM to trójwymiarowa technika topograficzna o wysokiej rozdzielczości atomowej, rozwiązująca chropowatość powierzchni i podatność na ugięcie końcówek wsporników przy kontakcie z sondowaną powierzchnią7. Opracowano różne metodologie wykorzystujące AFM do badania właściwości powierzchni, w tym pomiaru tarcia, sił adhezji i właściwości lepkosprężystych różnych materiałów. Ostatnio AFM stał się potężnym narzędziem do pozyskiwania informacji o właściwościach mechanicznych próbek biologicznych. W szczególności AFM może nieinwazyjnie wyodrębnić złożony moduł ścinania z pojedynczych komórek, stosując wgłębienia oscylacyjne z mikrokońcówką przymocowaną do wspornika o znanej stałej zginania8. To pozwala nam wnioskować o wynikających z tego siłach. Jednak AFM nie jest wyjątkowy, a różne metodologie pozwalają na ekstrakcję danych reologicznych i właściwości mechanicznych z poszczególnych komórek (np. aspiracja mikropipet9, magnetyczna cytometria skręcająca (MTC)10 lub jednoosiowa próba rozciągania11).

Jednak zastosowanie tych nowatorskich metodologii do złożonych procesów morfogenetycznych nie jest proste. Głównymi wyzwaniami stojącymi przy określaniu właściwości mechanicznych tkanek embrionalnych są mały (μm do mm), miękki (w zakresie 102 - 104 Pa) i lepkosprężysty (powodujący zjawiska zależne od czasu) charakter materiału12. Dlatego ważne jest, aby dostosować metody stosowane do określania właściwości mechanicznych (sztywność, lepkość, adhezja) do konkretnego przypadku zarodków i rozwijających się organizmów. Analizując podejścia reologiczne do opracowywania badań, należy wziąć pod uwagę dwie ważne kwestie: unikanie natrętnych zakłóceń i zapewnienie łatwej dostępności. W tym scenariuszu aspiracja mikropipet, MTC i próba rozciągania wykazują ograniczenia. W pierwszym przypadku duża deformacja, której doznaje komórka, może zmienić jej właściwości fizjologiczne i mechaniczne9. W drugim przypadku potrzeba mocnego przylegania tkanki doświadczalnej do podłoża w celu zapewnienia, że przyłożone naprężenia deformują miejscowo cytoszkielet, może również mieć wpływ na stan aktywacji komórek, a tym samym na ich cechy mechaniczne10. Wreszcie, jednoosiowe podejścia do rozciągania są ograniczone przez geometrię rozwijających się organizmów i dostępność11.

AFM wydaje się być lepiej przystosowany do badania procesów rozwojowych, ponieważ pozwala na badanie próbek biologicznych bezpośrednio w ich naturalnym środowisku, bez konieczności kłopotliwego przygotowywania próbek. Ponadto, ponieważ dysocjacja tkanek embrionalnych jest na ogół trudna, zmniejszony rozmiar sond AFM zapewnia wysoki stopień wszechstronności bez ograniczeń w wyborze rodzaju podłoża (wodnego lub niewodnego), temperatury próbki lub składu chemicznego próbki. AFM jest na tyle wszechstronny, że można go stosować w dużych domenach i skalach czasowych i został wykorzystany do odzyskiwania właściwości materialnych tkanek w różnych stadiach rozwojowych lub warunkach fizjologicznych. Całe rodzime tkanki, takie jak tętnice13 lub bones14 zostały zbadane z topograficznego punktu widzenia, a w niektórych przypadkach, takich jak twardówka, uzyskano również właściwości mechaniczne15. Topografia została również zbadana w żywych zarodkach, co pozwoliło na wizualizację np. rearanżacji komórek podczas morfogenezy w Xenopus16. Wreszcie, opracowano kompleksowe protokoły przygotowania próbek w celu określenia parametrów mechanicznych podczas różnych procesów rozwojowych. Mapy nanowgłębień zostały wygenerowane na natywnych nieutrwalonych skrawkach tkanek dla embrionalnego przewodu pokarmowego pisklącia11; Właściwości adhezyjne i mechaniczne uzyskane dla poszczególnych komórek progenitorowych ektodermy, mezodermy i endodermy wyizolowanych z zarodków zebry danio pręgowanego4; Pomiary sztywności wykonane dla epiblastu i prymitywnej smugi na eksplantatach z ptasich zarodków17; oraz wyraźny wzór gradientów sztywności bezpośrednio zdefiniowany w embrionalnym mózgu Xenopus5.

Znaczący skok jakościowy dla zastosowania AFM do badania rozwoju embrionalnego może wynikać z podejścia do prostych, dostępnych procesów morfogenetycznych. Epibolia danio pręgowanego jest istotnym i konserwatywnym wydarzeniem, w którym różne tkanki koordynują się w ograniczonej sferycznej przestrzeni, aby skierować ekspansję blastodermy w ciągu kilku godzin. Na początku epibolii danio pręgowanego (stadium kuliste) powierzchowna warstwa komórek, warstwa otaczająca (EVL), pokrywa półkulistą czapeczkę blastomerów wyśrodkowaną na zwierzęcym biegunie zarodka osadzonego na masywnej komórce syncytialnej żółtka. Epibolia składa się z korowej ekspansji roślinnej EVL, głębokich komórek (DC) blastodermy i zewnętrznej warstwy syncytialnej komórki żółtkowej (E-YSL) wokół żółtka. Epibolia kończy się zamknięciem EVL i DC na biegunie roślinnym18,19,20. Nie jest jeszcze jasne, w jaki sposób i gdzie siły są generowane podczas epibolii oraz jak są one globalnie sprzężone1,21.

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zastosować AFM do wnioskowania o pasywnych właściwościach mechanicznych tkanek podczas progresji epibolii w komórce żółtka danio pręgowanego in vivo. W tym celu wykorzystaliśmy małe mikrosfery przymocowane do wsporników AFM jako sondy. Pozwala to na uzyskanie precyzyjnych informacji lokalnych na niejednorodnej powierzchni komórki żółtka oraz badanie gradientów napięcia i ich dynamiki w czasie. Alternatywne podejścia AFM, takie jak te wykorzystujące wsporniki klinowe22, nie renderują wystarczająco precyzyjnych danych lokalnych. Technika klinowa, która wymaga bardzo ostrożnych umiejętności manipulacyjnych w celu sklejenia klina większego niż rozmiar próbki na końcu wspornika, nie nadaje się dobrze do sondowania mechaniki zarodka (~ 2 razy większego niż długość wspornika).

Modelowanie i charakteryzowanie właściwości lepkosprężystych komórek w sposób jakościowy i ilościowy pozwala na lepsze zrozumienie ich biomechaniki. Z biomechanicznego punktu widzenia niezbędne jest zrozumienie epibolii, a nie tylko wymaganie wiedzy na temat pomiarów i dynamiki napięcia korowego, które można uzyskać za pomocą AFM; W związku z tym potrzebne są informacje na temat właściwości biofizycznych tkanki. Aby wydobyć te informacje, na przestrzeni lat opracowano różne techniki reologii komórkowej w celu scharakteryzowania różnych typów komórek w różnych warunkach fizjologicznych23. Należą do nich AFM, MTC i pęseta optyczna (OT). Metody te okazały się jednak nieodpowiednie do analiz mezoskopowych w skali zarodków lub narządów. Jako alternatywę, z powodzeniem dostosowaliśmy mikroreologię śledzenia nanocząstek6 do pomiarów reologicznych in vivo. Technika ta analizuje przemieszczenia Browna poszczególnych cząstek i wnioskuje o lokalnych właściwościach mikromechanicznych.

Razem AFM i mikroreologia nanocząstek pozwalają na określenie dynamiki napięcia korowego i wewnętrznych właściwości mechanicznych żółtka podczas epibolii. Informacje te w pełni potwierdzają model, w którym stres anizotropowy rozwija się w wyniku różnic w odpowiedzi na deformację EVL i warstwy cytoplazmatycznej żółtka (YCL) na izotropowy skurcz aktomiozyny kory E-YSL jest niezbędny dla kierunkowego ruchu netto EVL i progresji epibolii1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane poniżej kroki protokołu są zgodne z wytycznymi naszych instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Hodowla danio pręgowanego

  1. Hoduj i utrzymuj dorosłego danio pręgowanego w standardowych warunkach.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano zarodki typu dzikiego AB i TL.
  2. Zebrać zarodki i wyhodować je w temperaturze 28,5 °C w pożywce dla zarodków E324. Ułóż je zgodnie z morfologią, jak opisano wcześniej19.

2. Mikroskopia sił atomowych

  1. Ręcznie dechorionowane zarodki danio pręgowanego (w różnym wieku w zależności od indywidualnych zainteresowań). Usuń kosmówkę dwoma cienkimi i ostrymi kleszczami (patrz tabela materiałów).
    1. Chwyć kosmówkę za pomocą jednego kleszcza i rozerwij go drugimi kleszczami. Następnie, trzymając kosmówkę w obszarze przeciwległym do rozdarcia, delikatnie wepchnij zarodek przez otwór.
    2. Wykonaj dekorionację pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym z regulowanym zakresem powiększenia od 8X do 50X.
  2. Zamontuj zarodki do AFM
    1. Przygotuj roztwór 2% agarozy w pożywce dla zarodków i wypełnij nim szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Niech stwardnieje. Wykonaj małe otwory o średnicy 1,5 mm (dwa razy większej niż wielkość zarodka) i głębokości około 350 μm (połowa wielkości zarodka) cienkimi kleszkami w łożu agarozy.
    2. Umieść zarodki w workach wykonanych w warstwie agarozy i upewnij się, że są na miejscu, rozprowadzając wokół roztworu 0,5% niskotopliwej agarozy w pożywce zarodkowej. Wlej ten roztwór tylko wokół zarodków, aby zabezpieczyć je w otworach.
    3. Zanim agaroza o niskiej temperaturze topnienia zestale się w temperaturze pokojowej, obróć zarodki w taki sposób, aby obszar zainteresowania badany przez AFM był skierowany do góry (Rysunek 1A).
  3. Badanie zarodków za pomocą AFM
    1. Zlokalizuj i zobrazuj zarodki na szalce Petriego za pomocą obiektywu 20X w odwróconym mikroskopie sił atomowych (patrz Tabela Materiałów25) w temperaturze pokojowej (23 - 24 °C).
      UWAGA: Zarodki są utrzymywane przy życiu, zanurzane w pożywce zarodkowej i przyczepiane do łoża agarozy.
    2. Zbadać powierzchnię komórek żółtkowych odlanych zarodków za pomocą sferycznych kulek polistyrenowych o średnicy 4,5 μm przymocowanych do wspornika o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m. Ustawić amplitudę między szczytami oscylacji wspornika na 5 μm, a jej częstotliwość na 1 Hz.
    3. Rutynowo należy zebrać dane dla każdego regionu, który ma być badany w różnych pozycjach i na kilku zarodkach, w celu uśrednienia danych.
      UWAGA: Dobrym punktem wyjścia jest zbadanie pięciu pozycji znajdujących się pośrodku i w rogach kwadratu o wymiarach 10 μm x 10 μm poprzez kontrolowanie położenia wspornika za pomocą siłowników piezo-wykonawczych XY mikroskopu AFM. Obrazowanie i zbieranie danych trwało około 20 minut na zarodek. Rejestrowanie danych w różnych regionach powierzchni komórek żółtka zarodka, np. na biegunie roślinnym lub w różnych regionach w pobliżu marginesu komórek EVL (Rysunek 1B i 1C), można wykonać tylko przy użyciu różnych próbek zorientowanych w różny sposób.
  4. Obliczanie sił
    1. Zmierzyć pionowe przemieszczenie wspornika AFM (z) za pomocą czujników tensometrycznych sprzężonych z siłownikami piezoelektrycznymi oraz jego ugięcie (d) za pomocą fotodiody kwadrantowej metodą dźwigni optycznej z oprogramowaniem sterującym mikroskopem (patrz Tabela materiałów25).
    2. Użyj nachylenia krzywej d-z uzyskanego z danych zebranych z odsłoniętego obszaru szklanego szkiełka nakrywkowego, aby skalibrować korelację między sygnałem fotodiody a ugięciem wspornika (d).
      UWAGA: Zmierzone przemieszczenie pionowe jest równe ugięciu wspornika, a nachylenie reprezentuje czułość na ugięcie dźwigni optycznej26.
    3. Wywnioskuj stałą sprężystości wspornika (k) z fluktuacji termicznych, jak opisano wcześniej27.
    4. Obliczyć wgłębienie próbki (h) jako:
      h = (z- z c) - (d - dwył.) (1)
      UWAGA: Tutaj zc jest położeniem punktu styku, a doff jest przesunięciem fotodiody.
    5. Oblicz siłę (F) działającą na wspornik jako:
      F = k · d (2)
  5. Oblicz napięcie kory mózgowej w odniesieniu do modelu ciecz-balon składającego się z elastycznej warstwy napięcia korowego Tc otaczającej lepką ciecz. W tym modelu, dla małych wgłębień (w porównaniu z wielkością zarodka), siła wzrasta proporcjonalnie4,28 as:
    F = 4π Tc [(Rb / Re) +1)] h (3)
    UWAGA: Tutaj Rb jest promieniem koralika, a Re jest promieniem zarodka. W przypadku zarodka danio pręgowanego, ponieważ promień zarodka (400 μm) jest o dwa rzędy wielkości większy niż promień koralika (2,25 μm), równanie to można w przybliżeniu wyznaczyć jako:
    F = 4π Tc h (4)
    1. Obliczyć krzywe siły rozciągającej i wgniecenia (F-h) w każdym regionie komórek żółtka zarodka dla pięciu różnych pomiarów punktowych.
    2. Oblicz Tc dla każdej krzywej F-h za pomocą nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Do celów analizy statystycznej obliczone napięcie korowe Tc należy uśrednić z różnych krzywych F-h.
  6. Zmierz właściwości lepkosprężyste (reologię) kory mózgowej, stosując oscylacje wieloczęstotliwościowe o niskiej amplitudzie (100 nm) podczas AFM złożone z fal sinusoidalnych o różnych częstotliwościach25.
    1. Oblicz efektywny moduł zespolony g*(ƒ) w dziedzinie częstotliwości z krzywych wgłębienia siły jako:
      g*(f) = [F(f) / h(f)] - ifb (5)
      tutaj i jest jednostką urojoną, a F(f) i h(f) są częstotliwościami (f) widm siły i wcięcia. b jest poprawkami na opór lepkości na wsporniku uzyskany z oscylacji przyłożonych do powierzchni.
    2. Podziel g*(ƒ) na części rzeczywiste i urojone jako:
      g*(ƒ) = g'(f) + ig''(f) (6)
      em>g'(f) jest modułem sprężystości i jest miarą energii sprężystości zmagazynowanej i odzyskanej w każdym cyklu oscylacji. g''(f) jest modułem lepkości, który odpowiada za rozproszoną energię.
    3. Oblicz tangens straty, który zapewnia indeks zachowania materiału w stanie stałym (<1) lub cieczy (>1), jako:
      g''(f) / g'(f) (7)
      UWAGA: Przy tego typu pomiarze możliwe jest wyodrębnienie parametrów wskazujących na lepkość i elastyczność badanego materiału. Chociaż b nieznacznie zależy od odległości końca wspornika od powierzchni, biorąc pod uwagę bardzo niskie wartości g'' wykazywane przez komórkę żółtka (patrz Rysunek 2D poniżej), niewielkie różnice w b mają znikomy wpływ na pomiary29.

3. Mikroreologia śledzenia cząstek

  1. Wykonać mikroiniekcję cząstek do komórki żółtka
    1. Wykonaj dostosowane mikroigły za pomocą poziomego ściągacza do mikropipet i borokrzemianowego szkła kapilarnego (patrz Tabela materiałów).
      1. Przygotuj mikroigły o średnicy zewnętrznej 1,00 mm, średnicy wewnętrznej 0,58 mm i długości 10 cm, korzystając z ustawień ściągacza: Ciśnienie: 500; Ciepło: 510; Uciąg: 65; Prędkość: 25; Czas: 50.
    2. Przygotuj płytkę Petriego do wstrzykiwań, tworząc proste pasy wgłębień w 1% agarozie w podłożu zarodkowym, używając niestandardowych form (patrz Tabela materiałów).
      1. Odwróć foremki do góry nogami i umieść je na płynnym żelu agarozowym i usuń foremki, gdy żel zastygnie. Pipetować zarodki do rowków wykonanych przez pleśń w agarozie pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym przy powiększeniu 1,2x.
        UWAGA: Szerokość i konstrukcja form umożliwiają zarodkom samodzielne wyrównanie.
    3. Przed wstrzyknięciem należy prawie całkowicie usunąć podłoże, aby ułatwić wstrzyknięcie (napięcie powierzchniowe zapobiega przywieraniu zarodka/kosmówki do igły podczas wyjmowania jej po wstrzyknięciu).
    4. Mikroiniekcję nanocząstek fluorescencyjnych (promień a = 100 nm, patrz tabela materiałów) rozcieńczonych w wodzie (1:1000) w roślinną część komórki żółtka zarodka (Rysunek 3A).
    5. Wyreguluj mikropipetę za pomocą precyzyjnych mikromanipulatorów i wstrzyknij kulki za pomocą automatycznego mikrowtryskiwacza z regulatorem czasu i ciśnienia (patrz Tabela materiałów). Ustaw ciśnienie w zakresie od 10 do 20 psi.
    6. Przed wstrzyknięciem roztworu kulek należy skalibrować objętość do wstrzyknięcia (0,5 nL), mierząc wielkość kropli dostarczanej przez mikrowstrzykiwacz za pomocą mikrometru o wymiarach 1x 0,01 mm stage (patrz Tabela materiałów).
    7. Zastosuj powiększenie 1,6x w stereoskopowym mikroskopie preparacyjnym, aby uwidocznić zarodki podczas wstrzyknięć, które są wykonywane w temperaturze pokojowej.
  2. Oceń lepkosprężyste zachowanie żółtka, rejestrując wahania termiczne
    1. Dekorionować zarodki, którym wstrzyknięto mikroimplanty, jak w kroku 2.1 i zanurzyć je w 0,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w roztworze pożywki dla zarodków w temperaturze 30 °C. Następnie przenieść je na szklane płytki dolne (patrz Tabela Materiałów) i ustawić je w kierunku szkiełka nakrywkowego, gdy agaroza jest jeszcze płynna.
      UWAGA: Gdy agaroza zestala się w temperaturze pokojowej, zarodki są gotowe do obrazowania.
    2. Zarodki osadzone w szklanych płytkach dolnych umieścić na stoliku konfokalnego mikroskopu odwróconego 2 godziny po mikroiniekcji. Rejestruj obrazy nanocząstek przez 26 s z częstotliwością próbkowania 25 Hz za pomocą obiektywu 63X w temperaturze pokojowej w odwróconym mikroskopie konfokalnym przy użyciu standardowego komercyjnego oprogramowania mikroskopowego (rozmiar piksela = 166 nm, obrazy rejestrowane co 40 ms).
    3. Oblicz położenie środków ciężkości cząstek i zdefiniuj ich trajektorie w czasie za pomocą wtyczki TrackMate oprogramowania ImageJ o otwartym kodzie źródłowym (Rysunek 3B).
    4. Oblicz dwuwymiarowe średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD) każdej cząstki za pomocą specjalnego oprogramowania6,30 jako:
      <Δr2 (τ)> = <[x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
      UWAGA: Tutaj t jest czasem, który upłynął, i upływem czasu. W czystej lepkiej cieczy MSD wzrasta odwrotnie proporcjonalnie do lepkości (ν) zgodnie z zależnością Stokesa-Einsteina:
      <Δr2 (τ)> = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
      gdzie T jest temperaturą bezwzględną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiary napięcia kory
Dla każdego punktu pomiarowego za pomocą AFM zarejestrowano pięć krzywych siła-przemieszczenie (F-z), przykładając do dźwigni wymuszenie o częstotliwości 1 Hz i amplitudzie szczyt-szczyt 5 µm (prędkość = 10 µm/s) aż do maksymalnego wciśnięcia wynoszącego ~2 µm. Procedura ta trwała mniej niż 20 min i nie była wpływana przez postęp epiboli. Każdy warunek eksperymentalny przetestowano na co najmniej 5 embrionach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy, że właściwości materiałowe i niektóre parametry biomechaniczne komórki żółtka danio pręgowanego podczas epibolii można łatwo oszacować za pomocą AFM i mikroreologii nanocząstek.

Podczas gdy AFM został wykorzystany do odzyskania cech reologicznych komórek i tkanek w warunkach fizjologicznych 4,5,25,28, tutaj opracowaliśmy protokół stosowania AFM do nienaruszonych rozwijających się zarodków, który wykorzystaliśmy do zbadania powierzchni komóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Amayrze Hernández-Vega i Philippe'owi-Alexandre'owi Pouille'owi za udział w tworzeniu podstaw dla tych protokołów. Dziękujemy również Platformie Obrazowania Molekularnego z IBMB-PCB, Xavierowi Estebanowi i członkom laboratorium za nieustanne wsparcie. Prace te zostały wsparte w ramach Programu Grup Skonsolidowanych Generalitat de Catalunya oraz DGI oraz dotacji Consolider z Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności Hiszpanii dla EMB i DN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odwrócony mikroskop optycznyNikonTE2000Wizualizacja próbki i wspornika AFM
Mikroskop sił atomowych (AFM)Wykonany na zamówienie-można zastosować dowolny skomercjalizowany AFM
Odwrócony mikroskop konfokalnyZeissLSM780Zbieranie danych nanorheologicznych
Agaroza D1 Low EEOConda8016.00Odlewanie zarodków
Ultraczysta agaroza LMP (niskotopliwa)Invitrogen16520-100Zabezpieczanie zarodków
Formy do mikroiniekcji i transplantacji danio pręgowanegoŚwiat Instrumenty precyzyjneZ-MOLDSOdlewanie zarodków. Wykonane na zamówienie z oryginalnymi wymiarami można również zastosować
kleszcze Dumont 5 FST11251-20o średnicy 1,5 mm
Si3N4 wspornikNovascanPT. GSPomiar zarodka za pomocą AFM. Końcówka kulista: 4,5 i mikro; m średnicy i k=0,01 N / m
Nanocząstki fluorescencyjneLifeTechnologies FluoSpheres F8811,Do śledzenia nanorheologii
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-2000Wytwarzanie szytych na miarę mikroigieł
Borokrzemianowe szkło kapilarneWarnerInstruments G100TF-4Wytwarzanie mikroigieł na zamówienie
MikromanipulatorNarishigeMN-153Manipulowanie mikropipetą
MikrowtryskiwaczEppendorfFemtoJet ExpressKontrolowanie czasu i ciśnienia iniekcji
StereomikroskopLeicaDFC365FXWizualizacja zarodków podczas iniekcji
Oprogramowanieanalityczne MathWorksMatlabAnaliza AFM i danych śledzenia cząstek
ZebraAB i TL dziki typ- Szczepy stosowane do pobierania zarodków
Szklane płytki dolneMat TekP35G-0.170-14-CMontaż zarodków do zbierania danych nanorheologicznych
Mikrometr stopniowyFST29025-02Pomiar objętości iniekcji

Bibliografia

  1. Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
  2. Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
  3. Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
  4. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
  5. Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
  6. Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
  7. de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
  8. Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
  9. Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
  10. Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914(2003).
  11. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
  12. Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
  13. Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
  14. Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21(1998).
  15. Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
  16. Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
  17. Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
  18. Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
  19. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  20. Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
  21. Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
  22. Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213(2014).
  23. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
  24. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
  25. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
  26. Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
  27. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
  28. Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
  29. Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
  30. Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
  31. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
  32. Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
  33. He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
  34. Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Skaningowa mikroskopia sił atomowychepiboliawłaściwości mechaniczneśledzenie cząstekmikroskopia konfokalnainiekcja nanocząstekindentacja siłowa
AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.