Technika minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest opisanie krok po kroku techniki minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC) u myszy. Poprzez wyeliminowanie intubacji i wentylacji, które są obowiązkowe w powszechnie stosowanej procedurze standardowej, minimalnie inwazyjny TAC upraszcza procedurę operacyjną i zmniejsza obciążenie zwierzęcia.

Streszczenie

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest jedną z najczęściej stosowanych technik chirurgicznych do eksperymentalnego badania przerostu lewej komory (LVH) wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym i jego progresji do niewydolności serca. W większości zgłoszonych badań procedura ta jest wykonywana z intubacją i wentylacją zwierzęcia, co czyni ją wymagającą i czasochłonną oraz zwiększa obciążenie chirurgiczne zwierzęcia. Celem tego protokołu jest opisanie uproszczonej techniki minimalnie inwazyjnego TAC bez intubacji i wentylacji myszy. Nacisk kładziony jest na krytyczne etapy techniki w celu osiągnięcia niskiej śmiertelności i wysokiej skuteczności w indukowaniu LVH.

Samce myszy C57BL/6 (10-tygodniowe, 25-30 g, n=60) zostały znieczulone pojedynczym dootrzewnowym wstrzyknięciem mieszaniny ketaminy i ksylazyny. U spontanicznie oddychającego zwierzęcia po częściowej sternotomii 3-4 mm górnej, odcinek jedwabnego szwu 6/0 przewleczonego przez oczko pomocy do podwiązania został przeprowadzony pod łukiem aorty i zawiązany na igle o rozmiarze 27. Zwierzęta operowane pozorowo przechodziły ten sam preparat chirurgiczny, ale bez zwężenia aorty. O skuteczności zabiegu w indukcji LVH świadczy znaczny wzrost stosunku masy serca do masy ciała. Stosunek ten uzyskuje się w 3, 7, 14 i 28 dniu po operacji (n = 6 - 10 w każdej grupie i każdym punkcie czasowym). Korzystając z naszej techniki, LVH obserwuje się w TAC w porównaniu ze zwierzętami pozorowanymi od 7 do 28 dnia. Śmiertelność operacyjna i śmiertelność pod koniec (powyżej 28 dni) jest bardzo niska i wynosi 1,7%.

Podsumowując, nasza opłacalna technika minimalnie inwazyjnego TAC u myszy zapewnia bardzo niską śmiertelność operacyjną i pooperacyjną oraz jest wysoce skuteczna w indukowaniu LVH. Upraszcza to procedurę operacyjną i zmniejsza obciążenie zwierzęcia. Można to łatwo wykonać, wykonując krytyczne kroki opisane w tym protokole.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich lat badania nad niewydolnością serca były prowadzone na realnych modelach zwierzęcych¹. W porównaniu z dużymi modelami zwierzęcymi niewydolności serca, małe modele zwierzęce mają wiele potencjalnych zalet. Oprócz niższych kosztów utrzymania i utrzymania, modele małych zwierząt są dostępne dla większej liczby badaczy ze względu na mniej skomplikowane potrzebne udogodnienia².

Modele niewydolności serca myszy oferują wiele takich samych zalet jak modele szczurze. Oprócz obniżonych kosztów utrzymania³, modele myszy korzystają z dostępności odpowiednich szczepów transgenicznych i nokautujących (KO). Możliwość specyficznych dla typu komórki, indukowalnych KO lub strategii transgenicznych sprawia, że mysz jest nieocenionym narzędziem do badania patogenezy niewydolności serca i prób zidentyfikowania nowych schematów terapeutycznych³.

Wśród obecnie używanych mysich modeli niewydolności serca⁴, poprzeczne zwężenie aorty (TAC), które po raz pierwszy zostało opisane przez Rockmana⁵ jest preferowanym modelem do generowania przerostu lewej komory (LVH) wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym^1,3. Największą zaletą tego modelu jest możliwość umożliwienia stratyfikacji LVH², chociaż przebudowa lewej komory w odpowiedzi na TAC jest zmienna wśród różnych szczepów myszy. W szczególności myszy C57BL/6 rozwijają szybką dylatację LV po TAC, która może nie wystąpić w przypadku innych szczepów^4,6,7.

Nagłe pojawienie się nadciśnienia osiągnięte za pomocą TAC powoduje około 50% wzrost masy LV w ciągu 2 tygodni, co pozwala na szybkie zbadanie aktywności interwencji farmakologicznych lub molekularnych mających na celu modulację rozwoju LVH⁴. Ostra indukcja ciężkiego nadciśnienia tętniczego przez TAC nie odtwarza dokładnie postępującego przerostu i przebudowy lewej komory obserwowanego w warunkach klinicznych zwężenia zastawki aortalnej lub nadciśnienia tętniczego. Niemniej jednak model ten jest używany przez wielu badaczy do identyfikacji i modyfikacji nowych celów terapeutycznych w niewydolności serca⁴.

Wykonywanie TAC u myszy wymaga większej wiedzy chirurgicznej niż ta wymagana dla innych technik stosowanych do wywoływania LVH i późniejszej niewydolności serca². Większość autorów przeprowadza tę procedurę poprzez intubację i wentylację zwierzęcia^2,8, co sprawia, że procedura ta jest bardziej wymagająca i czasochłonna oraz zwiększa obciążenie chirurgiczne dla zwierzęcia. Tylko nieliczni badacze zastosowali minimalnie inwazyjny TAC w swoich badaniach z krótkim odniesieniem do procedury chirurgicznej^9,10,11.

Celem tego protokołu jest opisanie krok po kroku uproszczonej i przyjaznej dla użytkownika techniki minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy, podkreślając krytyczne etapy procedury. Postępując zgodnie z tymi kluczowymi krokami, można łatwo wykonać tę technikę.

Protokół

Męskie myszy C57BL/6J (10 tygodni, 25 - 30g, n=60) są używane w tym protokole. Zwierzęta otrzymują humanitarną opiekę zgodnie z wytycznymi sformułowanymi przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa oraz Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych, a wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG) oraz prawem francuskim. Protokół został zatwierdzony przez "Regionalną Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach CREMEAS" (#2016092816207606).

1. Przygotowanie do zabiegu

1. Utrzymuj myszy przez tydzień po przybyciu do obiektu dla zwierząt w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności, w standardowych klatkach, z jedzeniem (szczegóły patrz Tabela materiałów) i wodą dostępną ad libitum.
2. W dniu operacji umieść myszy w oddzielnych klatkach na kilka minut przed indukcją znieczulenia, aby uniknąć dodatkowego stresu dla zwierzęcia. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne dzień przed zabiegiem.
3. Wstrzyknąć dootrzewnowo pojedynczą dawkę mieszaniny ketaminy (51,4 mg/kg) i ksylazyny (3,3 mg/kg) rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
4. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest spowodowana brakiem odruchu wycofania się u nogi.
5. Ogol szyję i klatkę piersiową zwierzęcia dostępną w handlu maszynką do golenia i zdezynfekuj ogolony obszar 70% alkoholem.
6. Umieść zwierzę na wznak na czystej korkowej podkładce roboczej i przymocuj łapy taśmą klejącą.

2. Chirurgia

1. Podczas zabiegów stosowana jest sterylna technika chirurgiczna. U zwierzęcia oddychającego spontanicznie wykonaj podłużne nacięcie szyjki macicy w linii środkowej na długości ponad 10 mm nożem z 11 ostrzami od wcięcia nadmostkowego do połowy klatki piersiowej w celu odsłonięcia mostka (Ryc. 1).
2. Cofnij tarczycę, przesuwając szew polipropylenowy 4/0 z monofilamentu za pomocą uchwytu na igłę Crile-Wood i przyklej go do podkładki roboczej.
3. Oddziel tępo mięśnie przedtchawicze za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych, aby odsłonić tchawicę.
4. Delikatnie przesuń zakrzywione kleszczyki mikrochirurgiczne z zamkniętymi szczękami po tchawicy i za mostek.
5. Ostrożnie otwierając i zamykając szczęki gładko zakończonych, zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych, przeprowadź rozwarstwienie pod mięśniami przedtchawicowymi i za mostkiem, aby odsunąć opłucną.
6. Chwyć prawe mięśnie nadobojczykowe prostymi kleszczami mikrochirurgicznymi z gładką końcówką i delikatnie pociągnij klatkę piersiową zwierzęcia.
7. Wsuń dolną szczękę szczypiec kostnych pod mostek i wykonaj górną częściową sternotomię 3-4 mm (Ryc. 2). Skieruj dolną część mini-sternnotomii lekko w lewo.
8. Przełóż szew polipropylenowy z monofilamentu 7/0 od wewnątrz na zewnątrz przez drugą przestrzeń międzyżebrową po każdej stronie mini-sternotomii za pomocą mikrochirurgicznego uchwytu na igłę. Trzymaj się blisko kąta żebrowo-mostkowego, aby uniknąć uszkodzenia naczyń międzyżebrowych i wewnętrznych klatki piersiowej lub opłucnej.
9. Rozłóż krawędzie mostka za pomocą monofilamentowych szwów polipropylenowych 7/0 z każdej strony i przymocuj je do podkładki roboczej za pomocą taśmy klejącej.
10. Delikatnie odsuń na bok mięśnie przedtchawicze, tłuszcz śródpiersia i grasicę za pomocą zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych o gładkiej końcówce, aby uwidocznić łuk aorty w powiększeniu o niskiej mocy (2 - 3X) (Ryc. 3). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotykać ani nie uszkadzać opłucnej ciemieniowej, aby zapobiec rozwojowi odmy opłucnowej.
11. Odsłoń tkankę miękką pod łukiem aorty, wiążąc kleszcze (Ryc. 4A) i delikatnie rozłóż jej szczęki. Przygotuj tunel w tkance miękkiej pod łukiem aorty za pomocą drugich kleszczy wiążących, delikatnie otwierając i zamykając szczęki w tkance miękkiej.
12. Przełóż odcinek jedwabnej ligatury 6/0 przewleczony przez oczko pomocy do podwiązywania (Ryc. 4B) trzymanego w lewej ręce pod łukiem aorty i odzyskaj go, zawiązując kleszcze trzymane w prawej ręce między początkiem prawej tętnicy szyjnej nienazwanej a lewą wspólną (Ryc. 5).
13. Przytnij igłę o rozmiarze 27 na długość 5 mm i stęp oba końce, dociskając je uchwytem na igłę Crile. Umieść igłę o rozmiarze 27 obok łuku aorty (Ryc. 6) za pomocą prostych kleszczy mikrochirurgicznych o gładkiej końcówce i zawiąż szew ciasno wokół igły i aorty między prawą tętnicą szyjną bezimienną a lewą wspólną za pomocą dwóch kleszczy wiążących (Rycina 7). Aby ściśle zawiązać szew, wykonaj początkowy podwójny węzeł, a następnie cztery dodatkowe węzły. Upewnij się, że wszystkie węzły są płaskie.
14. Po podwiązaniu należy szybko, ale delikatnie usunąć igłę, aby uzyskać zwężenie o średnicy 0,4 mm i powtarzalne poprzeczne zwężenie aorty na poziomie 65-70%.
15. Sprawdź, czy nie ma hemostazy tkanki miękkiej wokół łuku aorty, krawędzi mostka i mięśni przedtchawiczych. Umieść wchłanialną gazę hemostatyczną wszędzie tam, gdzie obserwuje się sączenie krwi. Usuń monofilamentowe szwy polipropylenowe 7/0 używane do rozkładania krawędzi mostka.
16. Przeprowadź prosty szew polipropylenowy 6/0 z monofilamentu za pomocą mikrochirurgicznego uchwytu na igłę od zewnątrz do wewnątrz lewej drugiej przestrzeni międzyżebrowej, a następnie od wewnątrz na zewnątrz prawej drugiej przestrzeni międzyżebrowej. Trzymaj się blisko kąta żebrowo-mostkowego, aby uniknąć uszkodzenia naczyń międzyżebrowych i wewnętrznych klatki piersiowej lub opłucnej.
17. Zbliż krawędzie mostka, wiążąc szew polipropylenowy 6/0 z monofilamentu za pomocą uchwytu na igłę Crile-Wood.
18. Zamknij skórę monofilamentowym polipropylenowym szwem ciągłym 5/0 w jednej warstwie za pomocą uchwytu na igłę Crile-Wood.
19. Wykonaj procedurę pozorowaną identyczną z operacją zwężenia, ale bez wiązania szwu wokół aorty.

3. Rekonwalescencja pooperacyjna

1. Monitoruj zwierzęta bardzo uważnie. Przenieś mysz do indywidualnej klatki i umieść ją w pozycji leżącej.
2. Pozwól myszy dojść do siebie w ciepłym świetle, aż do całkowitego wybudzenia (mniej niż 1 godzinę po wywołaniu znieczulenia).
3. W przypadku analgezji pooperacyjnej należy wstrzyknąć dootrzewnowo 0,1 mg/kg buprenorfiny. Powtarzać wstrzyknięcia podskórne w dawce 0,1 mg/kg buprenorfiny co 8 godzin przez pierwsze trzy dni, zgodnie ze wskazaniami.
4. Umieść operowane myszy w standardowych klatkach (maksymalnie 3 myszy na klatkę i minimum 2 myszy na klatkę).

4. Żniwa serca

1. W dniu analizy należy poddać mysz eutanazji roztworem ketaminy 300 mg/kg i ksylazyny 20 mg/kg w soli fizjologicznej we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
2. Najpierw zbierz krew z żyły głównej dolnej, a następnie tą samą linią wstrzyknij 5 ml roztworu 2,6 mM EDTA w soli fizjologicznej.
3. Zbierz serce, usuń przedsionki i obważ serce (lewa i prawa komora bez przedsionków).
4. Oddziel lewą komorę od prawej, pozostawiając przegrodę do lewej części komory. Zważyć obie próbki tkanek i zamrozić je w ciekłym azocie.

Wyniki

Operacyjne i późne przeżycie
Przeżycie operacyjne było bardzo wysokie, 98,3% (59 z 60) dla całej serii (TAC i zwierzęta operowane pozorowane). Jedyna śmierć operacyjna była spowodowana powikłaniem krwotocznym u myszy przeznaczonej do pozorowanej operacji. Doskonałe było również przeżycie pooperacyjne w okresie obserwacji wynoszącym 28 dni (98,3% (58 z 59). Jedyny późny zgon pooperacyjny nastąpił u myszy TAC w dniu (D) 16, prawdopodobnie pochodzenia sercowego.

Dyskusja

Celem tego protokołu jest przedstawienie krok po kroku ilustracji techniki chirurgicznej minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy. Szczegółowy opis techniczny poprzecznego zwężenia aorty u myszy został opisany przez innych autorów ^2,8. Jednak ci badacze wykonują operację po intubacji i wentylacji zwierząt. Zastosowanie dodatkowego etapu intubacji-wentylacji zwiększa złożoność i czas trwania całej procedury oraz globalny stres, na jaki narażone j...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop chirurgiczny	Olympus	SZX2-TR30
Maszynka do golenia	Rowenta	Nomad TN3650FO
szwy:
Polipropylen 7/0	Ethicon	BV-1X
Polipropylen 6/0	BBraun	C0862061
Jedwab 6/0 ligatura	FST	18020-60
Polipropylen 4/0	Ethicon	8683
Polipropylen 5/0	Ethicon	Z303
Drugs:
Ketamin		Merial Imalgè ne 1000, LBM154AD
Xylazine	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorphine	Ceva	Vetergesic, 072013
Instrumenty:
Szczypce do kości	Drobne narzędzia chirurgiczne	16101-10
Pomoce do podwiązania	Drobne narzędzia chirurgiczne	18062-12
Kleszcze do wiązania	Drobne narzędzia chirurgiczne	18026-10
Uchwyt igły Precyzyjne	narzędzia chirurgiczne	12003-15
Kleszcze mikrochirurgiczne	Drobne narzędzia chirurgiczne	11003-12
Kleszcze do mikrochirurgii	Drobne narzędzia chirurgiczne	11002-12
Kleszczyki do tkanek	Drobne narzędzia chirurgiczne	11021-12
Uchwyt na igły do mikrochirurgii	Drobne narzędzia chirurgiczne	12076-12
Nożyczki mikrochirurgiczne	Drobne narzędzia chirurgiczne	91501-09
Nożyczki Mayo	Drobne narzędzia chirurgiczne	14511-15
Nóż z 11 ostrzami	Fine Surgical Narzędzia	10011-00
RNA ekstrakcja i qPCR:
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini zestaw	Qiagen	74704
Qubit Fluorymetryczny test RNA	Fisher Scientific	10034622
Zestaw Nano	Agilent	5067-1511
Zestaw cDNA o dużej pojemności	Fisher Scientific	10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Startery Taqman BNP Fisher	Scientific	Mm01255770_g1
Startery ANP Taqman	Fisher Scientific	Mm01255747_g1
Podkłady Taqman ACE	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Podkłady Taqman Col1a1	Podkłady Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb	Podkłady Fisher Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh Fisher	Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  Thermocycler	Applied Biosystems	7000
Oprogramowanie:
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
karma dla zwierząt
myszy	Bezpieczny	UB220610R