Artykuł metodologiczny

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/56235

⸱

17 stycznia 2018

 , 
1Medical Mycology Research Center, Chiba University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obserwacja komórek i składników komórek w trzech wymiarach przy dużym powiększeniu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej wymaga przygotowania seryjnych ultracienkich przekrojów próbki. Chociaż przygotowanie seryjnych ultracienkich odcinków jest uważane za bardzo trudne, jest to raczej łatwe, jeśli zastosuje się odpowiednią metodę. W tym artykule przedstawiono krok po kroku procedurę bezpiecznego uzyskiwania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów. Kluczowymi punktami tej metody są: 1) wykorzystanie dużej części próbki i dostosowanie powierzchni próbki i krawędzi noża tak, aby były równoległe do siebie; 2) cięcie odcinków szeregowych w grupy i unikanie trudności w rozdzielaniu odcinków za pomocą pary pasm włosów podczas pobierania grupy odcinków szeregowych na siatki szczelinowe; 3) używać "pętli przechowywania sekcji" i unikać mylenia kolejności grup sekcji; 4) należy użyć "pętli podnoszącej powierzchnię wody" i upewnić się, że sekcje są umieszczone na wierzchołku wody i że najpierw dotykają siatki, aby umieścić je w żądanej pozycji na rusztach; 5) użycie folii nośnej na aluminiowym stojaku i ułatwienie odzyskiwania odcinków na kratkach oraz uniknięcie marszczenia się folii nośnej; oraz 6) użyć rurki do barwienia i unikać przypadkowego zerwania folii nośnej pęsetą. Ta nowa metoda umożliwia bezproblemowe uzyskiwanie seryjnych ultracienkich przekrojów. Metoda umożliwia analizę struktur komórkowych mikroorganizmów w wysokiej rozdzielczości w 3D, co nie jest możliwe do osiągnięcia przy użyciu metody automatycznego ultramikrotomu z taśmą oraz seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokiem lub skupioną wiązką jonów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwa technika seryjnego ultracienkiego cięcia jest niezbędna do trójwymiarowego badania komórek i komponentów komórek na poziomie mikroskopii elektronowej. Zbadaliśmy dynamikę korpusu bieguna wrzeciona w cyklu komórkowym komórek drożdży i ujawniliśmy zmiany morfologiczne ich ultrastruktury podczas cyklu komórkowego i czasu duplikacji1,2,3,4,5. W 2006 roku ukuliśmy nowe słowo "strukturom", łącząc "strukturę" i "-om", i zdefiniowaliśmy je jako "ilościową i trójwymiarową informację strukturalną całej komórki na poziomie mikroskopii elektronowej" 6, 7.

Przez analizę strukturomu, która wymaga techniki seryjnego ultracienkiego cięcia, odkryto, że komórka drożdży Saccharomyces cerevisiae i Exophiala dermatitidis miała około 200 000 rybosomów7, 8, komórka Escherichia coli miała 26 000 rybosomów9, komórka Mycobacterium tuberculosis miała 1 700 rybosomów10 a bakterie spiralne Myojin miały tylko 300 rybosomów11. Informacje te są przydatne nie tylko do oszacowania tempa wzrostu każdego organizmu, ale także do identyfikacji gatunków9.

Dalej, analiza strukturomu doprowadziła do odkrycia nowego organizmu; Parakaryon myojinensis został znaleziony w głębokim morzu u wybrzeży Japonii, którego struktura komórkowa była pośrednia między prokariotami a eukariontami12,13,14,15. Obecnie technika seryjnego ultracienkiego cięcia jest uważana za tak trudną, że jej opanowanie zajęłoby dużo czasu. W tym badaniu opracowaliśmy niezawodną metodę, dzięki której każdy może bez trudu wykonać seryjne ultracienkie cięcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Próbki użyte w tym badaniu to mikroorganizmy, szybko zamrożone propanem w ciekłym azocie, zamrożone podstawione acetonem zawierającym 2% tetratlenku osmu i zatopione w żywicy epoksydowej1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

1. Przygotowanie filmu wspierającego (Rysunek 1-3)

UWAGA: Folia nośna Formvar w kolorze srebrnym jest przygotowywana metodą odlewania na szkle19.

  1. Dodaj 100 ml 1,5% Formvaru w dichlorku etylenu do aparatu do produkcji Formvaru (Rysunek 1). Zanurzyć połowę szkiełka podstawowego (76 mm x 26 mm x 1,3 mm) w roztworze Formvar w górnej kolumnie aparatu, przeciskając roztwór z powietrzem przez "a" za pomocą gumowej kulki19.
    1. Spuść roztwór z kolumny, otwierając trójdrogowy kran i wypuszczając powietrze przez "b" w celu zmniejszenia ciśnienia. Wyjmij szkiełko z aparatu i wysusz na powietrzu, aby utworzyć film na powierzchni szkiełka. Użyj żarówki, aby przyspieszyć suszenie folii Formvar.
  2. Po zeskrobaniu czterech krawędzi folii ze szkiełka za pomocą żyletki (Rysunek 2a) i wdychaniu na szkiełko, aby ułatwić oddzielenie folii od szkiełka20, spuń folię na wodzie, zanurzając szklane szkiełko powoli w wodzie pod niskim kątem poziomym (około 10°, Rysunek 2b).
  3. Zbierz folię Formvar z wody za pomocą aluminiowego stojaka (30 mm x 25 mm x 3 mm) z otworami (o średnicy 4 mm) (Rysunek 3a). Trzymaj stojak z folią Formvar w eksykatorze do czasu użycia (Rysunek 3b).

2. Przycinanie bloku próbki za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania i żyletki 21 pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 4)

  1. Upewnij się, że na powierzchni bloku znajdują się komórki, obserwując końcówkę bloku za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 4a).
  2. Zamontuj blok próbki w uchwycie (uchwycie bloku) i zamontuj uchwyt na etapie przycinania21 (Rysunek 4b). Ten etap przycinania ma mechanizm podświetlający z tyłu próbki.
  3. Przytnij blok do rozmiaru 0,7 mm x 1,0 mm (rysunki 4c, 5d). Ponieważ żywica epoksydowa jest bardzo twarda, najpierw przytnij bloki za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania. Ultradźwiękowe ostrze do przycinania to nowo wprowadzona maszyna, a bloki można łatwo przycinać. Następnie przytnij blok dalej za pomocą żyletki. Odetnij jedno ramię, aby zaznaczyć kierunek cięcia (patrz Rysunek 5d, Rysunek 8).

3. Przycinanie bloku próbki za pomocą diamentowego noża za pomocą mikrotomu (Rysunek 5)

  1. Umieść uchwyt blokowy próbki w uchwycie próbki ultramikrotomu. Umieść próbkę pod kątem 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w stosunku do rzeczywistej pozycji, gdy wykonywane jest seryjne cięcie ultracienkie (patrz Rysunek 5d).
  2. Wytnij powierzchnię bloku diamentowym nożem do przycinania (patrz Rysunek 5d). Ustaw krawędź noża diamentowego równolegle do powierzchni bloku próbki i przyciąć minimalną powierzchnię próbki, aby nie stracić żadnej próbki (Rysunek 5d).
    UWAGA: Ten krok ma na celu wygładzenie powierzchni próbki. Część powierzchni próbki smukłej części pozostaje nienaruszona (dlatego ta część nie świeci jak lustro, Rysunek 5d), aby nie stracić żadnej części próbki do seryjnego cięcia. Dzieje się tak, ponieważ próbka jest odsłonięta na powierzchni bloku.
  3. Umieść lustro (Mesa cut, M) na stoliku noża, aby monitorować cięcie bloku próbki (Rysunek 5c).
  4. Przytnij lewą krawędź (staje się to górną stroną, Rysunek 5d, próbki w przekroju seryjnym) bloku za pomocą noża do przycinania, obracając stolik noża o 30° w lewo (Rysunek 5a).
  5. Przyciąć powierzchnię bloku w odległości około 100 μm od lewej krawędzi próbki (staje się to dolną stroną próbki w przekroju seryjnym, Rysunek 5d), obracając stolik noża o 30° w prawo ( Rysunek 5b).
    UWAGA: Sekcje seryjne zostaną wycięte z cienkiej części próbki o wymiarach około 90 nm x około 1 mm. Duża część zostanie wykorzystana do regulacji powierzchni próbki i krawędzi noża tak, aby były równoległe. Po ustawieniu powierzchni próbki tak, aby była równoległa do krawędzi noża, duża część zostanie usunięta za pomocą żyletki. Przecinając górną i dolną stronę próbki za pomocą mikrotomu, obie strony próbki stają się gładkie i dokładnie równoległe do siebie (Rysunek 5d), co jest konieczne, aby uzyskać proste i nieprzerwane odcinki wstążki.

4. Dostosowanie powierzchni próbki i krawędzi noża tak, aby były zwrócone równolegle do siebie 21

  1. Wyjmij nóż do przycinania i obróć blok próbki o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
  2. Ustaw ultracienki nóż do cięcia na etapie noża.
  3. Wyreguluj powierzchnię próbki i krawędź noża tak, aby były skierowane równolegle do siebie, wykorzystując dużą część powierzchni próbki.
    UWAGA: Duża część próbki służy do regulacji, ponieważ powierzchnia tnąca cięcia seryjnego jest tak mała, co utrudnia regulację powierzchni próbki i krawędzi noża tylko za pomocą tej części, szczególnie w kierunku pionowym. W ten sposób użycie dużej części próbki ułatwia regulację.

5. Rozprowadzanie roztworu neoprenu na bloku próbki (Rysunek 6)

  1. Aby umieścić uchwyt na próbkę dokładnie w tej samej pozycji, co pozycja pierwotna, nałóż taśmę na uchwyt i uchwyt uchwytu mikrotomu i przyciąć na granicy (Rysunek 6a).
  2. Wyjmij próbkę z mikrotomu i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 6b). Odetnij dużą część próbki żyletką, pozostawiając smukłą część, z której zostaną uzyskane sekcje seryjne.
  3. Za pomocą pipety Pasteura upuść około 1 μl 0,5% roztworu neoprenu (Rysunek 6b) na próbkę, która ma być użyta do seryjnego cięcia, aby boki sekcji były przyklejone. Przykryj całą próbkę roztworem neoprenu. Nadmiar roztworu neoprenu należy natychmiast wchłonąć za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej umieszczonego w pobliżu próbki. Uzyskanie wstęgi sekcji jest niezbędne do robienia zdjęć seryjnych sekcji komórek, a klej neoprenowy jest bardzo przydatny do sklejania sekcji.
  4. Przygotuj siatki 3-szczelinowe (rozmiary szczelin: środek, 0,4 mm x 2,2 mm, obie strony 0,2 mm x 2,2 mm) (Rysunek 6c) do zbierania odcinków szeregowych poprzez zginanie uchwytu kratek pod kątem 60°, traktowanie siatek 0,5% roztworem neoprenu i nadanie siatek hydrofilowości przez wyładowanie jarzeniowe22.

6. Tworzenie sekcji szeregowych (Rysunek 7-9)

  1. Umieść uchwyt bloku próbki z powrotem w mikrotomie w tej samej pozycji, co 5.1 (Rysunek 6a), wyrównując zaklejone części. Dzięki temu czoło bloku i krawędź noża są idealnie równoległe do siebie. Następnie zbliż nóż do próbki.
  2. Napełnij łódź z nożem wodą.
  3. Przykryj mikrotom plastikową osłoną, aby zapobiec przepływowi powietrza (Rysunek 7).
    UWAGA: Przepływ powietrza podczas ultracienkiego cięcia i pobierania skrawków często powoduje problemy. Plastikowa osłona ma trzy otwory: jeden otwór jest przeznaczony na soczewki lornetki, a pozostałe dwa otwory są przeznaczone na ramiona, aby umożliwić obsługę, gdy osłona jest założona. Drewniany podłokietnik służy do umieszczania ramion podczas wykonywania delikatnych prac, takich jak pobieranie odcinków szeregowych z siatkami. Drewniany podłokietnik jest umieszczony na innych stołach niż stół do mikrotomów (Rysunek 7, strzałki), aby nie przenosić wibracji rąk operatora na mikrotom
    4. .
  4. Rozpocznij cięcie próbki przy grubości przekroju 200 nm (Rysunek 8). Ustawienie na grubość 200 nm pozwoli zaoszczędzić czas na zbliżeniu noża do powierzchni próbki.
  5. Po wycięciu pierwszego przekroju ustaw grubość przekroju na 70 nm (Rysunek 8).
  6. Gdy liczba odcinków szeregowych osiągnie 20 (dokładnie po tym, jak wstęga osiągnie około 1,8 mm; liczba sekcji zmienia się w zależności od szerokości sekcji), ustaw grubość sekcji na 10 nm (Rysunek 8), kontynuując cięcie.
    UWAGA: Ponieważ mikrotom nie może ciąć odcinków o grubości 10 nm, nie pojawia się żadna nowa sekcja, a poprzednio przycięte odcinki zostają oddzielone od krawędzi noża. Ważne jest, aby uzyskać oddzielone grupy sekcji (Rysunek 9) do wybierania odcinków szeregowych, aby uniknąć trudności w ręcznym rozdzielaniu sekcji za pomocą pary pasm włosów. Ponieważ pole widzenia w transmisyjnym mikroskopie elektronowym wynosi 2,0 mm, odcinki powinny mieć co najwyżej 1,8 mm długości.
  7. Ustaw grubość przekroju na 60 nm (Rysunek 8). Spowoduje to wytworzenie odcinków o długości fali 70 nm (Rysunek 8), ponieważ maszyna doda poprzednie 10 nm grubości.
  8. Ustaw grubość przekroju z powrotem na 70 nm (Rysunek 8) i kontynuuj cięcie, aż uzyskasz odcinki o długości 1,8 mm.
  9. Powtarzaj 6.6-6.8, aż uzyskasz pięć odcinków o długości 1,8 mm (Rysunek 9). Zwykle wykonujemy pięć grup sekcji, ponieważ w transmisyjnym mikroskopie elektronowym dostępnym w naszym laboratorium jest pięć uchwytów na próbki, ale pięć nie jest limitem.

7. Wybieranie sekcji szeregowych (Rysunek 10-12)

  1. Umieść 'Pętlę trzymającą sekcję'23 (Wewnętrzna średnica pętli: 5,0 mm) (Rysunek 10a) na trzeciej grupie sekcji (Rysunek 10b).
    UWAGA: Konieczne jest pobranie sekcji w kolejności ich przekrojenia, aby zrobić zdjęcia w odpowiedniej kolejności. Ponieważ jednak na łodzi nożowej znajduje się pięć grup sekcyjnych, często mylenie się, które grupy są które. Umieszczając pętlę na trzeciej grupie, staje się jasne, że dwie grupy znajdujące się w pobliżu operatora to pierwsza i druga, a dwie odległe od operatora to czwarta i piąta grupa (Rysunek 10b). Zapobiegnie to pomyleniu zamówienia.
  2. Umieść 'Pętlę podnoszącą powierzchnię wody'23 (WSRL, średnica wewnętrzna pętli: 4.0 mm) (Rysunek 11a) na stoliku noża (Rysunek 11b). WSRL będzie stabilnie stał na stoliku noża, ponieważ jest wyposażony w magnes na dole.
    1. Umieść pętlę WSRL tuż nad sekcjami szeregowymi, przesuwając jej wałek i uchwyt. Opuść pętlę WSRL na powierzchnię wody tak, aby pętla otaczała sekcje.
    2. Dociśnij pętlę w dół, przekręcając w dół, tak aby powierzchnia wody podniosła się pod wpływem napięcia powierzchniowego (rysunki 11c-d). Przesuń sekcję na środek pętli, umieść ją na wierzchołku wody i dostosuj kierunek sekcji za pomocą pasma włosów21.
    3. Podnieś grupy sekcji, dotykając ich gołą siatką szczelinową, która jest trzymana przez pęsetę i trzymana równolegle do powierzchni wody (Rysunek 11d). Ważne jest, aby sekcje najpierw dotykały siatki, a nie wody, aby umieszczać sekcje dokładnie na środku siatki (Rysunek 11d).
  3. Umieść kratki z sekcjami wraz z niewielką kroplą wody na folii nośnej Formvar16 (Rysunek 12) i usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej.
    UWAGA: Marszczenie folii nośnej jest często problemem, gdy odcinki są zbierane za pomocą siatki z folią nośną, ponieważ membrana (sekcje) stykają się bezpośrednio z membraną (folią nośną). Problem powstawania zmarszczek na folii nośnej jest znacznie zmniejszony poprzez umieszczenie siatki nośnej przekroju wraz z niewielką kroplą wody na folii nośnej Formvar16.

8. Sekcje barwienia16, 24 (Rysunek 13)

  1. Po całkowitym wyschnięciu sekcji oderwij folię Formvar z okolic kratek i usuń kratki, na których znajdują się sekcje.
  2. Ustaw kratki w rowku probówki do barwienia16 w odpowiedniej kolejności (Rysunek 13), a następnie zabarwić sekcje octanem uranylu i cytrynianem ołowiu24.
    UWAGA: Wzdłuż długiej osi rurki wyciętej żyletką znajduje się rowek o głębokości 0,6 mm. Rurka jest przydatna do zapobiegania przypadkowemu pęknięciu folii nośnych podczas używania pęsety, ponieważ bezpośrednie obchodzenie się z kratkami nie jest konieczne podczas procesu barwienia i prania16.

9. Obserwacja odcinków szeregowych (Rysunek 14)

  1. Ustaw 5 siatek w uchwycie na wiele próbek we właściwej kolejności (Rysunek 14a), orientując długą oś szczeliny siatki prostopadle do osi uchwytu próbki. Uchwyty (groty strzałek) kratek nie muszą być przecinane, ponieważ "mocowniki siatki" nie będą dotykać uchwytów.
  2. Zamocuj siatki za pomocą 'grid-fixers' (Rysunek 14b) i włóż uchwyt próbki do transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
    UWAGA: Często przydatne jest wykonywanie zdjęć wszystkich sekcji komórek w małym powiększeniu (Rysunek 15), aby znaleźć interesujące mikroorganizmy lub komórki w dobrym stanie, bez zanieczyszczeń i z dobrą fiksacją, przed zrobieniem zdjęć komórki docelowej.
  3. Rób zdjęcia komórek docelowych we wszystkich sekcjach komórek w dużym powiększeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, do wybierania sekcji szeregowych użyto siatek z trzema szczelinami. Kratki wykonane są z niklu lub miedzi. Sekcje szeregowe są umieszczone na środkowej szczelinie. Szczeliny po obu stronach są niezbędne do przeglądania sekcji podczas podnoszenia ich za pomocą siatki. Aby siatki były równoległe do sekcji szeregowych podczas podnoszenia ich pęsetą (Rysunek 11d), uchwyt jest wygięty (Rysunek 6c, po prawej). Mały uchwyt jest korzystny, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda nie wymaga drogiego sprzętu. Wymaga jedynie aluminiowego stojaka (rysunek 3), kratek z trzema szczelinami (rysunek 6c), pętli przytrzymujących sekcje (rysunek 10a), pętli podnoszącej powierzchnię wody (rysunek 11a) i rurki do barwienia (rysunek 13). Obecna metoda ma wiele cech. Duża część próbki służy do regulacji powierzchni próbki i krawędzi noż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Shigeo Kita za cenne sugestie i dyskusję. Dziękujemy również Johnowi i Sumire Ecksteinom za krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aparatura do produkcji formNisshin EM Co. Ltd., Tokio652szer. 180 x gł. 180 x wys. 300 mm
Szkiełko szklaneMatsunami Co. Ltd., Osaka-76x 26 x 1,3 mm
Aluminiowy stojak z otworami 4 mmNisshin EM Co. Ltd., Tokio658szer. 30 x gł. 25 x wys. 3 mm, Patrz ten artykuł
Mikroskop stereoskopowyNikon Co. Ltd., Tokyo-SMZ 645
Oświetlenie LED do mikroskopu stereoskopowegoNikon Co. Ltd.,Tokyo-SM-LW 61 Ji
Etap przycinaniaSunmag Co.Ltd.,Tokio-Wyposażonyw mechanizm przechylania, Zapoznaj się z tym
papierem Oświetlenie LED do przycinania stageSunmag Co.Ltd.,Tokio-Zapoznajsię z tym artykułem
Ultradźwiękowe ostrze do przycinaniaNisshin EM Co. Ltd., Tokio5240EM-240, Patrz ten papier
Nóż diamentowy do przycinaniaDiatome Co. Ltd., Szwajcaria-45°
Nóż diamentowy do ultracienkich przekrojówDiatome Co. Ltd., Szwajcaria-45°
UltramikrotomLeica Microsystems, Wiedeń-UltracutS
Mesa cutLeica Microsystems, Vienna-Mirror
0.5% roztwór z neoprenu W NisshinEM Co. Ltd., Tokio605
Specjalna 3-szczelinowa siatka niklowaNisshin EM Co. Ltd., Tokio2458Zapoznaj się z tym artykułem
Specjalna 3-szczelinowa siatka miedzianaNisshin EM Co. Ltd., Tokio2459Patrz ten artykuł
Pętla do trzymania sekcjiNisshin EM Co. Ltd., Tokio526Patrz ta praca
Pętla podnosząca powierzchnię wodyNisshin EM Co. Ltd., Tokio527Patrz ten dokument
Rurka do barwieniaNisshin EM Co. Ltd., Tokio463Patrz ten dokument
Uchwyt na wiele próbekJEOL Co. Ltd.,Tokio-EM-11170
JEM-1400JEOL Co. Ltd., Tokijskitransmisyjny mikroskop elektronowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
  2. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
  3. Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
  4. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
  5. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
  6. Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
  7. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
  8. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
  9. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
  10. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109(2015).
  11. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
  12. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
  13. Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
  14. Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
  15. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
  16. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
  17. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
  18. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
  19. Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
  20. Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216(2000).
  21. Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
  22. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
  23. Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
  24. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
  25. Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
  26. Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
  27. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  28. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Serial Ultrathin SectionsTransmission Electron MicroscopyMicroorganism SpecimenSection Holding LoopWater Surface Raising LoopFormvar Support FilmUltramicrotome TechniqueDiamond Knife TrimmingNeoprene Solution ApplicationGrid Section Retrieval

Powiązane artykuły