Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca²⁺ i wywołanego przez Ca²⁺ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Streszczenie

Produkcja ATP przez fosforylację oksydacyjną jest podstawową funkcją mitochondriów. Mitochondria u wyższych eukariontów również uczestniczą w cytozolowym buforowaniu Ca^{2 +}, a produkcja ATP w mitochondriach może być pośredniczona przez wewnątrzmitochondrialne stężenie wolnego Ca^{2 +}. Zdolność retencji^Ca2+ można uznać za zdolność mitochondriów do zatrzymywania wapnia w macierzy mitochondrialnej. Nagromadzony wewnątrzkomórkowy Ca^{2 +} prowadzi do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej, nazywanej otwarciem porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (mPTP), co prowadzi do wycieku cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Obrzęk mitochondriów wywołany przez Ca²⁺ służy do wskazania otwarcia mPTP. Tutaj opisujemy dwa testy w celu zbadania zdolności zatrzymywania Ca^{2 +} i obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca^{2 +} w izolowanych mitochondriach. Po dodaniu określonych ilości^Ca2+ wszystkie kroki można wykonać w ciągu jednego dnia i zarejestrować za pomocą czytnika mikropłytek. W ten sposób te dwa proste i skuteczne testy można zastosować do oceny funkcji mitochondriów związanych z Ca^{2 +}.

Wprowadzenie

Mitochondria są głównymi organami komórkowymi wytwarzającymi prawie 95% ATP wykorzystywanego w komórkach ssaków poprzez fosforylację oksydacyjną. Poinformowano, że sekwestrowane stężenie mikromolowe Ca²⁺ przez mitochondria, obecność ADP i nieorganiczny fosforan można wykorzystać do fosforylacji ADP do syntezy ATP¹. Gdy stężenie cytozolowego Ca^{2 +} przekracza próg, mitochondria mogą szybko pobierać Ca^{2 +} i powoli go wypływać. W ten sposób funkcjonujące mitochondria mogą napływać do zwiększonego cytozolowego Ca²⁺. Niezależnie od udziału w fosforylacji oksydacyjnej, mitochondrialne Ca^{2 +} biorą również udział w cytozolowych sygnałach wapniowych i aktywują mitochondrialny mechanizm apoptozy poprzez indukowanie otwarcia mPTP w wewnętrznej błonie mitochondrialnej². Powszechnie uznano, że nieprawidłowe podniesienie wewnątrzkomórkowego Ca^{2 +} może wywołać masywny obrzęk mitochondriów poprzez otwarcie mPTP³. W związku z tym protokół ten ma na celu ocenę funkcji mitochondriów poprzez ilościowe określenie zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca^{2 +} i obrzęku mitochondriów wyzwolonego przez Ca^{2 +}.

Ca²⁺ zdolność zatrzymywania jest miarą zdolności mitochondriów do pobierania cytozolowego wapnia. Mitochondria mogą buforować wolny wapń cytozolowy i regulować procesy komórkowe zależne od wapnia poprzez wychwyt wapnia w postaci nieaktywnych osadów. Upośledzona zdolność zatrzymywania Ca²⁺ występuje w zjawiskach stresowych związanych z ograniczeniem energii, a nawet chorobami neurodegeneracyjnymi^4,5. Izolowane mitochondria lub komórki przepuszczalne digitoniną mogą być wykorzystane do identyfikacji zdolności zatrzymywania Ca^{2 +}, a zwiększona zdolność do akumulacji Ca^{2 +} przez izolowane mitochondria z dodatkiem glutaminianu i jabłczanu nie jest dotknięta procedurą izolacji mitochondriów⁶. Miareczkowana ilość digitoniny powinna być używana do przenikania błon plazmatycznych różnych typów komórek. Sól heksapotasowa zielonego barwnika fluorescencyjnego wiążącego Ca^{2 +}, wrażliwego na Ca^{2 +} wskaźnika pobudliwości światła widzialnego, jest szeroko stosowana⁷. Zielony barwnik fluorescencyjny wiążący Ca²⁺ jest wskaźnikiem o niskim powinowactwie i służy do pokazania, że wewnątrzkomórkowe stężenia wolnego Ca^{2 +} nadal rosną podczas długotrwałych (5 minut) stymulacji⁸. Metoda ta była mniej czuła niż technika filtra radioaktywnego, ale została znacznie uproszczona. Dodatkowy Ca^{2 +} podnosi fluorescencję zieleni wapniowej, a wychwyt Ca^{2 +} przez mitochondria przywraca fluorescencję do wartości wyjściowej. Sekwencyjne dodawanie Ca²⁺ dokonywano do momentu, gdy mitochondria nie były w stanie wychwycić pozamitochondrialnego Ca^{2+ 9}. Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych może być używany do ciągłego raportowania fluorescencji zieleni wapniowej.

Po akumulacji^Ca2+, mitochondria uległy depolaryzacji, uwolniły Ca²⁺ do pożywki i zaczęły pęcznieć. Obrzęk mitochondriów wywołany przez Ca²⁺ służy do wskazania otwarcia mPTP. Mikroskopia elektronowa i spadek absorbancji światła przy 540 nm mogą być wykorzystane do pomiaru obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca^2+10,11. Objętość mitochondriów można bezpośrednio określić za pomocą rozpraszania światła pod kątem do przodu¹², gdzie spadki absorbancji odzwierciedlają bierne pęcznienie macierzy mitochondrialnej.

Tutaj ilustrujemy metodologię badania zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca²⁺ i obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca²⁺ w izolowanych mitochondriach z komórek SH-SY5Y.

Protokół

1. Izolacja mitochondriów

UWAGA: Wszystkie roztwory i urządzenia powinny być wstępnie schłodzone do 0 - 4 °C i trzymane na lodzie.

1. Wysiew: około 3 x 10⁶ komórek SH-SY5Y na 10 cm naczynie do hodowli komórkowej. Hodowla komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 U/ml)-streptomycyną (100 μg/ml). Utrzymywać przez noc w inkubatorze zawierającym 5%_CO2 w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Do każdego testu izolacji potrzebne są co najmniej 1 - 2 x 10⁷ komórek SH-SY5Y.
2. Usuń pożywkę i umyj komórki około 1 ml lodowatego PBS w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych 3 razy.
3. Dodaj nowy 1 ml lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych i zeskrob przylegające komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Podczas wirowania przygotować 5 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego (250 mM sacharozy, 10 mM kwasu HEPES(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowego), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) uzupełnionego 50 μl roztworu podstawowego inhibitorów proteazy (100x stężenie; 1 tabletka wolna od EDTA rozpuszczona w 500 μl ddH₂O).
5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego. Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml na lodzie przez 30 minut.
6. Lizować zawieszone komórki za pomocą szklanego homogenizatora (15 - 25 uderzeń) ręcznie w górę iw dół na lodzie.
   UWAGA: Upewnij się, że podczas homogenizacji komórek nie ma pęcherzyków. Policz nienaruszone komórki i odsłonięte jądra pod mikroskopem wizualnie i potwierdź, że nastąpiło >90% pęknięcia komórek.
7. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń (jąder i pozostałych nienaruszonych komórek).
8. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
9. Przenieść sklarowany osad do nowej probówki i odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria za pomocą 1 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego.
11. Odwirować roztwór przez 15 minut w temperaturze 14 000 x g 4 °C w celu wytrącenia mitochondriów.
12. Otrzymany osad mitochondriów musi być przechowywany na lodzie i ponownie zawieszony w pożywkach o pojemności 50 - 100 μl KCl (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu i 2 μM rotenonu, pH 7,4) zgodnie z objętością osadu przed jakimkolwiek testem.
13. Użyj 5 μl roztworu mitochondrialnego, aby zmierzyć stężenie białka mitochondrialnego za pomocą standardowego testu BCA, mierząc OD562 za pomocą czytnika płytek¹³.

2. Określenie zdolności retencji mitochondriów Ca²⁺

1. Przygotować pożywkę KCl i dodać wiążący Ca²⁺ zielony barwnik fluorescencyjny do końcowego stężenia 0,5 μM przed eksperymentem.
2. Przenieść 1 ml izolowanych mitochondriów (0,4 mg/ml) w pożywce KCl zawierającej 0,5 μM Ca²⁺ wiążącego zielony barwnik fluorescencyjny do każdej studzienki 6-dołkowej.
3. Inkubować mitochondria i zielony barwnik fluorescencyjny wiążący Ca²⁺ na 6-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem otoczenia przez 1 minutę. Dodać 4 μl podwielokrotności 20 mM roztworu CaCl₂ (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM glutaminianu, 5 mM jabłczanu, pH 7,4) do każdej 6-dołkowej płytki przy użyciu automatycznego ustawienia dozowania w celu wprowadzenia 200 nmol Ca^{2 +} / mg białka mitochondrialnego.
4. Użyj spektrometru fluorescencyjnego, aby monitorować zmiany fluorescencji co 3 s przez 2 minuty przy długości fali wzbudzenia 506 nm i długości fali emisji 531 nm. Płytka wyposażona jest w wytrząsanie z prędkością 600 obr./min przez 3 s pomiędzy odczytami sterowanymi programowo (Rysunek 1).
5. Dodać dodatkowe 4 μl podwielokrotności 20 mM roztworu CaCl₂ do każdej studzienki i monitorować zmiany fluorescencji co 3 sekundy przez 2 minuty. Powtarzaj ten krok, aż fluorescencja wzrośnie z czasem.
   UWAGA: Mitochondria są prowokowane z dodatkiem Ca²⁺, na co wskazuje zwiększona fluorescencja zapisu. Kiedy mPTP się otwiera, fluorescencja wzrasta z czasem.
6. Zinterpretuj całkowitą ilość Ca²⁺ dodanego do momentu otwarcia mPTP jako pojemność retencyjną Ca²⁺.

3. Oznaczanie obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca ²⁺

1. Przygotuj pożywkę KCl przed eksperymentem.
   1. Przenieś 1 ml izolowanych mitochondriów (0,4 mg/ml) w pożywce KCl do każdej 6-dołkowej płytki.
2. Dodać 10 μl 20 mM CaCl₂ roztworu wodnego (500 nmol/mg białka mitochondrialnego) do białka mitochondrialnego, aby wywołać obrzęk mitochondriów.
3. Zapisuj spadek absorbancji przy 540 nm co 3 s na czytniku mikropłytek sterowanym przez oprogramowanie przez 10 minut (Rysunek 2). Zmiany fluorescencji są spowodowane napływem substancji rozpuszczonych przez wewnętrzną błonę mitochondriów.
   UWAGA: Zmniejszona absorbancja przy 540 nm odpowiada obrzękniętym mitochondriom. Jeśli czytnik nie zaobserwuje spadku absorbancji, można przyjąć dłuższy interwał odczytu lub czas odczytu.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki zdolności przechowywania Ca²⁺:
Wyniki wyrażono jako wartości fluorescencji. Dzięki dodatkowym impulsom Ca²⁺ (200 nmol / mg białka mitochondrialnego) fluorescencja wzrosła dwukrotnie powyżej linii podstawowej z otwarciem mPTP. W izolowanych mitochondriach dodano 5 μM Bongkrekate (BKA), inhibitor otwarcia mPTP indukowanego przez^Ca2+, lub atraktylozyd 1 μM (ATR), aktywator otwarcia mPTP indukowanego przez^Ca2+. Il...

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy prosty i skuteczny protokół testu zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca^{2 +} i testu obrzęku mitochondriów wywołanego Ca^{2 +}.

W przypadku izolacji mitochondriów upewnij się, że wszystkie materiały i rurki są na lodzie, zwłaszcza podczas homogenizacji komórek. 0,25% trypsyna-EDTA może być również użyta do odłączenia komórek od naczynia na 5 minut w temperaturze 37 °C. Po 15 - 25 pociągnięciach należy obserwować nienaruszoną błonę komórkową pod mikroskopem ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa SH-SY5Y	ATCC (Globalne Centrum Zasobów Biologicznych)	Numer ATCC: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-wiążące całkowite inhibitory proteazy zielonego barwnika fluorescencyjnego
	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
homogenizator szklany	Kimble Chase	9885303002
glutaminian	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
jabłczan	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Instrumenty błyskowe Varioskan	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atraktylozyd	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s zmodyfikowana pożywka Eagle	Hyclon	SH30022	4,5 g/L glukozy, L-glutamina, bez pirogronianu sodu
płodowa surowica bydlęca	Hycon	SV30087
penicylina	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycyna	Invitrogen	11860-038
Zestaw do oznaczania BCA	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclon	SH30256.01
Naczynie do hodowli komórkowych 10 cm	NEST	704001