Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca²⁺ i wywołanego przez Ca²⁺ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Streszczenie

Produkcja ATP przez fosforylację oksydacyjną jest podstawową funkcją mitochondriów. Mitochondria u wyższych eukariontów również uczestniczą w cytozolowym buforowaniu Ca^{2 +}, a produkcja ATP w mitochondriach może być pośredniczona przez wewnątrzmitochondrialne stężenie wolnego Ca^{2 +}. Zdolność retencji^Ca2+ można uznać za zdolność mitochondriów do zatrzymywania wapnia w macierzy mitochondrialnej. Nagromadzony wewnątrzkomórkowy Ca^{2 +} prowadzi do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej, nazywanej otwarciem porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (mPTP), co prowadzi do wycieku cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Obrzęk mitochondriów wywołany przez Ca²⁺ służy do wskazania otwarcia mPTP. Tutaj opisujemy dwa testy w celu zbadania zdolności zatrzymywania Ca^{2 +} i obrzęku mitochondriów wywołanego przez Ca^{2 +} w izolowanych mitochondriach. Po dodaniu określonych ilości^Ca2+ wszystkie kroki można wykonać w ciągu jednego dnia i zarejestrować za pomocą czytnika mikropłytek. W ten sposób te dwa proste i skuteczne testy można zastosować do oceny funkcji mitochondriów związanych z Ca^{2 +}.

Wprowadzenie

Mitochondria są głównymi organami komórkowymi wytwarzającymi prawie 95% ATP wykorzystywanego w komórkach ssaków poprzez fosforylację oksydacyjną. Poinformowano, że sekwestrowane stężenie mikromolowe Ca²⁺ przez mitochondria, obecność ADP i nieorganiczny fosforan można wykorzystać do fosforylacji ADP do syntezy ATP¹. Gdy stężenie cytozolowego Ca^{2 +} przekracza próg, mitochondria mogą szybko pobierać Ca^{2 +} i powoli go wypływać. W ten sposób funkcjonujące mitochondria mogą napływać do zwiększonego cytozolowego Ca²⁺. Niezależnie od udziału w fosforylacji oksydacyjnej, mitochondrialne Ca^{2 +} biorą ....

Protokół

1. Izolacja mitochondriów

UWAGA: Wszystkie roztwory i urządzenia powinny być wstępnie schłodzone do 0 - 4 °C i trzymane na lodzie.

1. Wysiew: około 3 x 10⁶ komórek SH-SY5Y na 10 cm naczynie do hodowli komórkowej. Hodowla komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 U/ml)-streptomycyną (100 μg/ml). Utrzymywać przez noc w inkubatorze zawierającym 5%_CO2 w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Do każdego testu izolacji potrzebne są co najmniej 1 - 2 x 10⁷ komórek SH-SY5Y.
2. Usuń pożywkę i umyj komórki około 1 ml l....

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pojemności retencji Ca²⁺:
Wyniki wyrażono jako wartości fluorescencji. Po dodaniu kolejnych pulsów Ca²⁺ (200 nmols/mg białka mitochondrialnego), fluorescencja wzrosła dwukrotnie powyżej poziomu bazowego w momencie otwarcia mPTP. Do izolowanych mitochondriów dodano 5 μM bongkrekatu (BKA), inhibitora indukowanego przez Ca²⁺ otwarcia mPTP, lub 1 μM atraktylosydy (ATR), aktywatora indukowanego przez Ca²⁺ otwarcia .......

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy prosty i skuteczny protokół testu zdolności zatrzymywania mitochondriów Ca^{2 +} i testu obrzęku mitochondriów wywołanego Ca^{2 +}.

W przypadku izolacji mitochondriów upewnij się, że wszystkie materiały i rurki są na lodzie, zwłaszcza podczas homogenizacji komórek. 0,25% trypsyna-EDTA może być również użyta do odłączenia komórek od naczynia na 5 minut w temperaturze 37 °C. Po 15 - 25 pociągnięciach należy obserwować nienaruszoną błonę komórkową pod mikroskopem .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa SH-SY5Y	ATCC (Globalne Centrum Zasobów Biologicznych)	Numer ATCC: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-wiążące całkowite inhibitory proteazy zielonego barwnika fluorescencyjnego
	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
homogenizator szklany	Kimble Chase	9885303002
glutaminian	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
jabłczan	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Instrumenty błyskowe Varioskan	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atraktylozyd	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s zmodyfikowana pożywka Eagle	Hyclon	SH30022	4,5 g/L glukozy, L-glutamina, bez pirogronianu sodu
płodowa surowica bydlęca	Hycon	SV30087
penicylina	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycyna	Invitrogen	11860-038
Zestaw do oznaczania BCA	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclon	SH30256.01
Naczynie do hodowli komórkowych 10 cm	NEST	704001