Artykuł metodologiczny

Ocena wad niedrożności połączeń dróg moczowych za pomocą iniekcji barwnika błękitu metylenowego

DOI:

10.3791/56247

⸱

12 października 2017

1Cancer and Developmental Biology Laboratory, National Cancer Institute, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzyknięcie barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej ułatwia ocenę wad niedrożności połączeń dróg moczowych podczas rozwoju embrionalnych dróg moczowych myszy. W tym miejscu opisano protokół wstrzykiwania barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wady niedrożności połączeń dróg moczowych to wrodzone anomalie wywołujące wodonercze i wodnik. Wady niedrożności połączeń dróg moczowych u myszy można ocenić, śledząc przepływ barwnika błękitu metylenowego w układzie moczowym. Barwnik błękitu metylenowego jest wstrzykiwany do miedniczki nerkowej okołoporodowych nerek embrionalnych, a przepływ barwnika jest monitorowany z miedniczki nerkowej nerki przez moczowód i do światła pęcherza moczowego po zastosowaniu ciśnienia hydrostatycznego. Nagromadzenie barwnika będzie widoczne w świetle pęcherza moczowego normalnych okołoporodowych dróg moczowych, ale będzie ograniczone między miedniczką nerkową a punktem końcowym nieprawidłowego moczowodu, jeśli wystąpi niedrożność dróg moczowych. Metoda ta ułatwia stwierdzenie niedrożności połączeń dróg moczowych oraz uwidocznienie wodonercza i wodniaka. Manuskrypt ten opisuje protokół wstrzykiwania barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej w celu potwierdzenia niedrożności połączeń dróg moczowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ moczowy składa się z pary nerek i moczowodów oraz wspólnego pęcherza moczowego i cewki moczowej. Główną funkcją układu moczowego jest utrzymanie homeostazy organizmu poprzez zarządzanie równowagą wodno-elektrolitową krwi. Nerki filtrują krew, aby kontrolować stężenie elektrolitów i równowagę kwasowo-zasadową, a także wytwarzają mocz w celu wydalenia nadmiaru wody i odpadów, w tym substancji rozpuszczonych i metabolitów. Mocz jest następnie transportowany przez moczowód z miedniczki nerkowej nerki do pęcherza moczowego w sposób jednokierunkowy, gdzie jest przechowywany i ostatecznie wydalany przez cewkę moczową1.

Moczowody to proste rurki wychodzące z przewodu nerkowego. Po pączkowaniu z przewodu nerkowego w 10,5 dniu embrionalnym (E10,5) u myszy, łodyga moczowodu wydłuża się i różnicuje w wielowarstwową strukturę zwaną urotelią, która jest nieprzepuszczalna dla mysich E12,5 i E16,5. Komórki mezenchymalne otaczające łodygę moczowodu są również zróżnicowane w trzy warstwy składające się z wewnętrznych komórek zrębu, pośrednich grubych komórek mięśni gładkich i zewnętrznych fibroblastów przybyszowych. Fale perystaltyczne moczowodu inicjowane w miedniczce nerkowej są rozchodzone przez warstwę mięśni gładkich ściany moczowodu do pęcherza moczowego w celu transportu moczu2,3, który jest wytwarzany począwszy od E16.5 w mouse1.

Wrodzone anomalie nerek i dróg moczowych (CAKUT) są jednymi z najczęstszych chorób genetycznych, występują u około 1% płodów ludzkich1,4, i składają się z różnych fenotypów, w tym wodonercza i wodniaka. Nieprawidłowe gromadzenie moczu w nerkach i moczowodach powoduje powstawanie wodonercza nerek i wodniaka. Jedną z przyczyn wodonercza i/lub powstawania wodomoczowodu jest niedrożność dróg moczowych. Niedrożność połączenia moczowodowo-miednicznego (UPJO) jest spowodowana nieprawidłowym przepływem moczu z powodu zablokowania między bliższym moczowodem a miedniczką nerkową, co powoduje wodonercze i zwężenie proksymalnej wodniaki moczowodowej z kątowaniem lub uporczywym fałdowaniem5,6. Ponadto ektopowe wprowadzenie dystalnego moczowodu do ściany pęcherza moczowego lub do układu rozrodczego nazywa się niedrożnością połączenia moczowodowo-pęcherzowego (UVJO). UVJO może również indukować wodonercze i tworzenie się wodonercza7,8. Dodatkowym ubytkiem połączenia moczowodowo-pęcherzowego (UVJ) jest refluks pęcherzowo-moczowodowy (VUR). VUR charakteryzuje się wstecznym przepływem moczu z pęcherza w kierunku nerki w UVJ. W porównaniu z UVJO, zarodki okołoporodowe z VUR nie wykazują wyraźnie rozdętego fenotypu nerki wodonerczej ani ciężkiego fenotypu wodniaka moczowodowego9.

U myszy laboratoryjnej przepływ moczu może być badany przez wstrzyknięcie barwnika, takiego jak błękit metylenowy, do miedniczki nerkowej9. Wstrzyknięty roztwór błękitu metylenowego będzie śledził trajektorię moczu od miedniczki nerkowej przez moczowód do pęcherza moczowego. Wodonercze można rozpoznać po rozszerzeniu barwnika w nerkach. UPJO można wykryć jako zablokowanie przepływu barwnika w bliższym moczowodzie z rozdętą miedniczką nerkową5. Każde rozszerzenie moczowodu wskazane przez poszerzoną średnicę pokazuje przykład hydromoczowodu. Wreszcie, nagromadzenie barwnika na ścianie pęcherza moczowego lub w miejscu układu rozrodczego wskazuje na UVJO z rozdętą nerką wodonerczą i rozszerzonym hydromoczowodem 7,10. Aby wykryć VUR, roztwór barwnika jest wstrzykiwany do pęcherza moczowego, a następnie monitorowany jest przepływ wsteczny w nerce9.

Tutaj przedstawiono protokół wstrzykiwania barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej zarodka okołoporodowego. Protokół ten umożliwia śledzenie przepływu moczu z miedniczki nerkowej przez moczowód do pęcherza moczowego i weryfikuje potencjalne niedrożności połączeń dróg moczowych, takie jak UPJO lub UVJO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy (myszy Wnt5a flox/flox (Wnt5atm1.1Tpy) i linia Dll1Cre, model myszy UVJO)7 były zarządzane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i badane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez NCI-Frederick Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie roztworu barwnika błękitu metylenowego

  1. Odmierz 0,1 g niebieskiego metylenu w proszku.
  2. Błękit metylenowy należy całkowicie rozpuścić w 10 ml soli fizjologicznej lub 1 roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez wirowanie.
  3. Przefiltrować roztwór błękitu metylenowego o stężeniu 10 mg/ml za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów membrany 0,45 μm), aby wyeliminować zatykanie podczas wstrzykiwania.
  4. Złóż sterylny zestaw do żył skóry głowy (27GX3/4") z jednorazową strzykawką o pojemności 3 ml i napełnij strzykawkę 3 ml przefiltrowanym roztworem błękitu metylenowego.
    UWAGA: Aby zapobiec ciśnieniu hydrostatycznemu i późniejszemu przepływowi barwnika, umieść końcówkę igły nad strzykawką wypełnioną roztworem błękitu metylenowego.

2. Sekcja prenatalnych embrionów

  1. Wyczyść nożyczki preparacyjne i kleszcze 70% etanolem.
  2. Aby pobrać zarodki okołoporodowe w E18.5 lub E19.5, najpierw poddaj eutanazji ciężarne myszy za pomocą inhalacji CO2, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi NIH.
    UWAGA: Ciężarna samica myszy zwykle rodzi od E18,5, jednak większe nerki są łatwiejsze do manipulowania. W związku z tym nerki w wieku E19,5 bliżej urodzenia są łatwiejsze do przeprowadzenia tej analizy. Jednak szczenięta z obustronną niedrożnością dróg moczowych umierają po urodzeniu. W zależności od charakterystyki myszy doświadczalnych, odpowiedni dzień/godzina zbierania powinna być empirycznie określona.
  3. Rozpyl 70% etanolu na brzuszną powierzchnię brzucha, a następnie otwórz jamę brzuszną brzusznie za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy.
  4. Podnieś całą macicę i oddziel ją od ciała, przecinając nożyczkami preparacyjnymi na końcach rogów macicy.
  5. Przepłucz całą macicę 1x PBS na szalce Petriego.
  6. Przeciąć macicę segmentowo nożyczkami preparacyjnymi i usunąć decyduę łożyskową za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby odsłonić zarodki w woreczkach żółtkowych.
  7. Najpierw usuń woreczek żółtkowy, a następnie usuń błonę owodniową za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby uwolnić zarodki okołoporodowe.
  8. Odetnij głowę zarodkowi nożyczkami do preparowania. Zetrzyj nadmiar krwi sterylnymi gazikami. Przypnij zarodek jego brzuszną powierzchnią do góry na mikroskopie preparacyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową do obrazowania. W razie potrzeby zbierz jego ogon do genotypowania.
    UWAGA: Wykonuj zastrzyki po jednym zarodku na raz.
  9. Ostrożnie otwórz jamę brzuszną zarodka za pomocą kleszczy, rozrywając skórę. Następnie ostrożnie usuń nadmiar narządów i tkanek, takich jak wątroba, żołądek i jelito, za pomocą kleszczy, przecinając je lub wyciągając, aby odsłonić nerki, moczowody i pęcherz, które znajdują się grzbietowo (Rysunek 1A). W razie potrzeby wchłonąć nadmiar krwi z wypreparowanego zarodka za pomocą sterylnych gazików.
    UWAGA: Nadmiar krwi przeszkadza w identyfikacji miedniczki nerkowej do wstrzyknięcia barwnika.

3. Wstrzykiwanie barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej i monitorowanie przepływu barwnika

  1. Usunąć pęcherzyki z igły i rurki, usuwając roztwór błękitu metylenowego z końcówki igły za pomocą ciśnienia hydrostatycznego. Podnieś strzykawkę zawierającą roztwór barwnika powyżej poziomu końcówki igły, aby rozpocząć przepływ, a następnie opuść strzykawkę, aby zatrzymać przepływ.
  2. Wbić igłę do miedniczki nerkowej w pobliżu bliższego moczowodu, uważając, aby nie naruszyć jej po umieszczeniu. Wykonaj wstrzyknięcie barwnika do nerki, aby określić jej niedrożność dróg moczowych.
    UWAGA: Najpierw wykonaj wstrzyknięcie barwnika do każdej nieprawidłowej nerki7, postępując w ten sam sposób, aby określić niedrożność dróg moczowych.
  3. Podnieś strzykawkę na około 20 cm, aby zapewnić ciśnienie hydrostatyczne i pozwól przepłynąć 15 μl - 60 μl roztworu barwnika. Natężenie przepływu wyniesie około 3 μl/s, jeśli strzykawka zostanie podniesiona do tej wysokości nad zarodkiem.
  4. Monitoruj niebieski kolor barwnika, zaczynając najpierw w miedniczce nerkowej, następnie na długości moczowodu, a na końcu w świetle pęcherza.
    UWAGA: Potrzeba około 5 sekund, aby zobaczyć, jak w świetle pęcherza pojawia się słaby kolor barwnika, jeśli moczowód jest prawidłowo wprowadzony do pęcherza. Pozwól, aby barwnik zgromadził się w zablokowanym miejscu przez około 15 sekund, jeśli w świetle pęcherza nie pojawi się żaden kolor barwnika.
  5. Umieścić strzykawkę w dół, aby zatrzymać przepływ barwnika i wyjąć igłę z nerki.
  6. Wykonaj zdjęcia nerki, moczowodu i pęcherza moczowego prześledzone roztworem barwnika za pomocą aparatu i programu do obrazowania podłączonego do mikroskopu stereoskopowego.
  7. Zapisz wodonercze nerki, wodonerek i końcowe położenie roztworu barwnika w zeszycie laboratoryjnym.
  8. Wykonać wstrzyknięcie do przeciwległej nerki zgodnie z opisem w punktach 3.1) do 3.5) i pozostawić przepływ barwnika łącznie około 20 s.
    UWAGA: Światło pęcherza zostanie wypełnione roztworem barwnika, oznaczonym mocnym niebieskim kolorem, jeśli moczowód zostanie prawidłowo wprowadzony do światła pęcherza. Po ocenie niedrożności połączenia dróg moczowych, moczowody i pęcherz moczowy mogą zostać przymocowane do sekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerki i dolny układ moczowy znajdują się grzbietowo w stosunku do większości innych narządów wewnętrznych, takich jak wątroba i jelita. Po usunięciu tych innych narządów wewnętrznych widoczna jest para nerek i moczowodów oraz pojedynczy pęcherz moczowy (Ryc. 1A). Po udanym rozbiorze barwnik wstrzyknięty do miedniczki nerkowej będzie przepływał z nerki do pęcherza moczowego przez moczowód. Miedniczka nerkowa to lejkowata, poszerzona proksymalna część moczowodu w nerce. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerki myszy funkcjonują od poziomu E16,5 i teoretycznie możliwy jest test wstrzykiwania barwnika od tego momentu. Jednak nerka jest zbyt mała, aby można ją było wstrzyknąć roztworem barwnika, a fenotypy, takie jak wodonercze i wodomoczowód, nie są wyraźnie obserwowane, ponieważ te fenotypy są wtórnym efektem moczu nagromadzonego w wyniku nieprawidłowego transportu moczu. Te fenotypy, wynikające z przeszkód takich jak UPJO lub UVJO, są widoczne w E18.5 przez rozdęte nerki i moczowody. Większe nerki zarodków w wieku E19,5 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) za wsparcie w złożeniu tego manuskryptu. Dziękuję również dr Michaelowi Hallowi (CDBL/NCI/NIH) i Nirmali Sharmie (CDBL/NCI/NIH) za redakcję tego manuskryptu. Jestem wdzięczny Lai Thangowi (SAIC) za jego doskonałą hodowlę myszy. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health, National Cancer Institute i Center for Cancer Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Błękit metylenowySigma-AldrichM9140
Quality Biological Inc. NORMALNA SÓL FIZJOLOGICZNA - 500MLFisherscientific50-983-204
Jednorazowa strzykawka 3 ml z końcówką BD Luer-LokFiltry
Acrodisc z membraną SuporPall corporation4614
Exel Zestawy żył skóry głowy (motyla); 27G x 3/4" 12" EXELINT26709
Delikatne nożyczki operacyjneRoboz Surgical Instrument Co.RS-6702
Mikro kleszcze preparacyjneRoboz Surgical Instrument Co.RS-5135
Pęseta Dumont; Wzór #5Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.RS-5045
BD Igły PrecisionGlide 30 G x 1/2"BD305106
strzykawkowe BD 309657

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
  2. Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
  3. Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
  4. Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
  5. Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
  6. Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
  7. Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
  8. Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
  9. Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
  10. Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykni cie do miedniczki nerkowejzastosowanie ci nienia hydrostatycznegomonitorowanie przep ywu barwnikawizualizacja wiat a p cherza moczowegoocena wodniaka nerkiwykrywanie wodniaka moczowodusekcja zarodka w okresie oko oporodowymniedro no odej cia moczowodu do p cherza moczowego

Powiązane artykuły